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Neuroscience

मानव दाता आखें से Bruch झिल्ली के संवर्धन

Published: November 15, 2015 doi: 10.3791/53382
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Centre for Ophthalmology & Vision Sciences, Institute of Human Development, University of Manchester, 2Centre for Advanced Discovery and Experimental Therapeutics, Central Manchester University Hospitals NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre

Abstract

उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) विकसित दुनिया में दृश्य हानि का एक प्रमुख कारण है। रोग केंद्रीय दृष्टि के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप मैक्युला बुलाया रेटिना के केंद्र के विनाश से ही प्रकट होता है। प्रारंभिक एएमडी जैसे भौगोलिक शोष (एएमडी सूखा) या neovascularisation (गीला एएमडी) के रूप में देर एएमडी पर प्रगति कर सकते हैं कि मुलायम drusen नामक छोटे, पीले रंग के घावों की उपस्थिति की विशेषता है। नैदानिक ​​परिवर्तन अच्छी तरह से वर्णित हैं, और एएमडी जोखिम प्रदान करने पर आनुवांशिक प्रभाव की समझ कभी अधिक विस्तृत हो रही है हालांकि, प्रमुख प्रगति की कमी एक ऐसा क्षेत्र आनुवंशिक जोखिम के जैव रासायनिक परिणामों की समझ है। इस Bruch झिल्ली, रक्त की आपूर्ति से सामग्री का एक जैविक फिल्टर और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) सेल monolayer रहता है, जिस पर एक पाड़ के रूप में कार्य करता है कि एक बहुत पतली बाह्य मैट्रिक्स के जैव रसायन समझने में कठिनाइयों की वजह से है। Drusen चBruch झिल्ली और उनकी उपस्थिति के भीतर ORM RPE कोशिकाओं को पोषक तत्व प्रवाह बाधित। केवल अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत कैसे वास्तव में Bruch झिल्ली की प्रोटीन संरचना की जांच कर रही है, और से, शोधकर्ताओं drusen गठन, विकास एएमडी की और बाद में दृष्टि हानि को मजबूती जैव रासायनिक तंत्र को खंडित करने की उम्मीद कर सकते हैं। इस पत्र में यह नीचे की ओर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, और यह पहले से ही Bruch झिल्ली जैव रसायन की समझ कैसे बदल रहा है के उदाहरण प्रदान किया जा सकता है, ताकि पूरे Bruch झिल्ली, या बस मैक्युला क्षेत्र से या तो समृद्ध बनाने के लिए तरीके का विवरण।

Introduction

नेत्र अनुसंधान में पोस्टमार्टम मानव नेत्र ऊतक के उपयोग के नेत्र रोग रोगजनन को समझने के लिए एक अमूल्य संसाधन है। मानव दाता आंखों के विश्लेषण से पश्चिमी दुनिया 1 में अंधापन का प्रमुख कारण है, जो उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी), underpinning तंत्र समझदार के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया है। विश्व स्तर पर, एएमडी सभी अंधापन का लगभग 8.7% के लिए खातों और एक तेजी से उम्र बढ़ने की आबादी के साथ, यह केंद्रीय दृष्टि के नुकसान में 2020 2। एएमडी परिणामों से 196,000,000 लोगों को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी की है और रोगी स्वतंत्रता और जीवन की गुणवत्ता पर गहरा प्रभाव पड़ता है 3। प्रारंभिक एएमडी drusen के गठन की विशेषता है और यह (भी neovascular या 'गीला' एएमडी के रूप में करने के लिए कहा गया है) (कभी कभी 'सूखा' एएमडी के रूप में करने के लिए कहा गया है) भौगोलिक शोष, या choroidal neovascularization करने के लिए प्रगति कर सकते हैं। विरोधी वीईजीएफ़ Whilst इंजेक्शन स्थिर कर सकते हैं या neovascular एएमडी यह मैं में दृष्टि में सुधारउपचारात्मक नहीं है, और वर्तमान में, कोई इलाज भौगोलिक शोष के लिए मौजूद है।

कुछ आनुवंशिक वेरिएंट एएमडी जोखिम 4 को संशोधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि - 8, कम इन वेरिएंट एक जैव रासायनिक स्तर पर मैक्युला को प्रभावित कैसे के बारे में जाना जाता है। एएमडी रोगजनन में एक महत्वपूर्ण स्थल Bruch झिल्ली है। इस संरचना और विभिन्न अध्ययनों के भीतर Drusen रूप में और एएमडी 9 में Bruch झिल्ली के आसपास सक्रियण पूरक के सबूत प्रदान की है। Bruch झिल्ली रंजित से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं को अलग करती है कि बाह्य मैट्रिक्स की एक चादर है, और लगभग 4 माइक्रोन मोटी है। Bruch झिल्ली रंजितपटलकोशिका में विलीन हो जाती है, गवाक्षित केशिकाओं और इस के लिए बाहरी होता है कि रंजित की एक परत बड़ा रक्त वाहिकाओं 10 (चित्रा 1 ए) युक्त परतें हैं।

Bruch झिल्ली अतिरिक्त की एक pentilaminar चादर हैसेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), और इस पद्धति लाल रक्त कोशिकाओं से काफी हद तक decellularized और जो मुक्त है, (अब Bruch झिल्ली को समृद्ध करने के लिए कहा गया है) अंतर्निहित रंजितपटलकोशिका के ईसीएम के साथ-साथ, Bruch झिल्ली को अलग-थलग करने के लिए विवरण कैसे। समृद्ध Bruch झिल्ली तो पश्चिमी सोख्ता और ऊतक विज्ञान के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, आँख के मैक्युला क्षेत्र से पूरी तरह तोड़कर की झिल्ली को समृद्ध बनाने के लिए कार्यप्रणाली में वर्णित है, एएमडी के जैव रासायनिक पहलुओं की जांच कर उन लोगों के लिए विशेष रुचि का हो जाएगा।

Protocol

अनुसंधान प्रयोजनों के लिए सहमति दे दी है मानव नेत्र ऊतक प्रत्यारोपण के लिए कॉर्निया को हटाने के बाद मैनचेस्टर रॉयल नेत्र अस्पताल नेत्र बैंक से प्राप्त हुई थी। अनुसंधान के लिए मानव ऊतक का उपयोग मानव ऊतक अधिनियम (2004) के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था, और विश्वविद्यालय के अनुसंधान आचार समिति के अनुमोदन के साथ (11,305 संदर्भ)।

पूरे Bruch झिल्ली 1. संवर्धन

  1. आसपास के कार्यक्षेत्र को साफ और 1% कीटाणुनाशक के साथ विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे (वी / वी) और फिर 70% (वी / वी) इथेनॉल के साथ नीचे पोंछे।
  2. सुनिश्चित करने के लिए हाथ निम्न हैं: (ए, बी, और सी के रूप में यहाँ सूचीबद्ध सामग्री की सूची देखें) एक नया डिस्पोजेबल छुरी, (आमतौर पर टिशू कल्चर में प्रयुक्त) दो बाँझ सेल स्क्रेपर्स और चिमटी के तीन जोड़े।
  3. बाद में उपयोग के लिए ढक्कन को बनाए रखना है, एक डिस्पोजेबल पेट्री डिश में आंख ग्लोब रखें। एक नया डिस्पोजेबल छुरी का प्रयोग, एक फ्लैट मो बनाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो किसी भी अवशिष्ट ऑप्टिक तंत्रिका को हटानेऊतक के UNT। इसके बाद, कर चार चीरों समान रूप से भाग 3 (धब्बेदार Bruch झिल्ली के संवर्धन) के लिए आगे बढ़ने मैक्युला क्षेत्र के माध्यम से कटौती नहीं करते हैं, तो चार quadrants बनाने के लिए अलग स्थान।
    1. अंतरतम neurosensory रेटिना (एनएसआर) से, रंजित और श्वेतपटल (आंख के सफेद) के माध्यम से - चीरों आंख ऊतक की पूरी गहराई के माध्यम से विस्तार सुनिश्चित करें। चीरा ऑप्टिक तंत्रिका eyecup के मार्जिन से आंख दौर सभी तरह से जारी रखें। इस eyecup (चित्रा 1 बी देखें) बाहर चपटा होने की अनुमति होगी।
  4. चिमटी से नोचना एक का उपयोग कर चपटा eyecup से एक वृत्त का चतुर्थ भाग होल्डिंग केंद्र की ओर बढ़ रहा है,, (रंजित टुकड़ी को रोकने के लिए) पकड़ के लिए बड़ा चिमटी से नोचना बी कांच और अंतर्निहित एनएसआर का उपयोग करें और परिधि पर शुरू दूर रेटिना वर्णक उपकला (RPE) से इस ऊतक खींच खोला eyecup की और फिर विरोध की ओर करने के लिए। आमतौर पर, लेकिन हमेशा कांच और एनएसआर दोनों एक के रूप में अलग नहीं। Scalpe प्रयोग करेंएल ऑप्टिक डिस्क पर लंगर डाले किसी भी अवशिष्ट एनएसआर आबकारी करने के लिए।
  5. फिर, चिमटी से नोचना एक का उपयोग जगह में ऊतक के एक चतुर्थ भाग पकड़े है, जबकि धीरे eyecup की पूरी अंदर की सतह से RPE monolayer बेदखल करने के लिए बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग करें। इन कोशिकाओं को आसानी से अलग और के रूप में गहरे भूरे रंग-पिगमेंटड झुरमुटों देखा जा सकता है। धीरे eyecup से दूर उखाड़ फेंकना RPE कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला।
  6. इसके बाद, धीरे सभी 4 आंख quadrants से (Bruch झिल्ली और रंजित दोनों को मिलाकर) overlying गहरे लाल ऊतक बंद छील करने के लिए चिमटी से नोचना एक का उपयोग करें। एक साफ डिश में excised ऊतक रखें।
  7. एक सेल खुरचनी का चपटा बढ़त का उपयोग, जगह में excised ऊतक पकड़ धीरे ऊतक परिमार्जन करने के लिए दूसरे खुरचनी का उपयोग करने के लिए। जितना संभव हो उतना अतिरिक्त सामग्री को हटाने पर ऊतक मुड़ें और दोहराएँ। आखिरकार, एक पारदर्शी झिल्ली रहेगा: इस कुदरती तौर समृद्ध Bruch झिल्ली है। 20X बढ़ाई की एक न्यूनतम पर विदारक माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल होता हैBruch झिल्ली की रंजित और संवर्धन को हटाने की सहायता में आवश्यक।
  8. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, संक्षेप में एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में झिल्ली रखने से पहले अवशिष्ट रंजित और रक्त को दूर करने के लिए ultrapure पानी के साथ Bruch झिल्ली कुल्ला।
  9. किसी भी दूषित सेलुलर बात lyse मदद करने के लिए लगभग 1 मिलीलीटर ultrapure पानी और भंवर संक्षिप्त (लगभग 15 सेकंड) में समृद्ध Bruch झिल्ली निलंबित (चित्र 2 देखें)। झिल्ली गोली और सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण करने के लिए 30 सेकंड के लिए 500 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
    नोट: बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या भंडारण (अनुभाग नीचे 2 में वर्णित है) शेष समृद्ध Bruch झिल्ली solubilization के लिए तैयार है।

पूरे समृद्ध Bruch झिल्ली और वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण 2. solubilization

  1. 500 μl 8 एम उर में ऊतक डुबो से समृद्ध Bruch झिल्ली से प्रोटीन निकालने1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (चित्रा 3) में आरटी पर 6 घंटे के लिए ईए।
  2. 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र solubilized नमूने किसी भी शेष बाह्य मामला गोली। तैरनेवाला निकालें और 3,500 दा MWCO डायलिसिस झिल्ली को हस्तांतरण, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए अपोहन पीबीएस के 1 एल में नमूना रखें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए, प्रोटीन अलगाव मोतियों की 40 μl जोड़ने के लिए, और 30 मिनट के लिए आरटी पर नमूना / मनका मिश्रण (एक घूर्णन मिक्सर पर 20 आरपीएम) बारी बारी से।
  4. 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने मोती गोली। (/ वी) ग्लिसरॉल, w 0.01% bromophenol नीले, 3% β-mercaptoethanol (65.8 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 2.1% एसडीएस 26.3%) 30 μl 2x नमूना लोड बफर में मोती के लिए बाध्य प्रोटीन तैरनेवाला निकालें और solubilize।
  5. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं, और 5 मिनट शेष मोती गोली के लिए फिर 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. एक पूर्व डाली पर जारी किया प्रोटीन होता है कि सतह पर तैरनेवाला लोड SDS-प्रोटीन अलग होने के लिए पेज ढाल जेल (सामग्री की सूची देखें)।
  7. उदाहरण के लिए एक आम धुंधला प्रोटोकॉल, Coomassie नीले रंग का उपयोग कर अलग प्रोटीन बैंड कल्पना।
    1. ((W / v), 50% मेथनॉल, 10% हिमनदों एसिटिक एसिड, 40% पानी 0.1% खूब ब्लू) जेल के लिए, और कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए संक्षेप में, प्रतिभाशाली नीले दाग के 20 मिलीलीटर जोड़ने सेते ।
    2. धुंधला समाधान त्यागें और पृष्ठभूमि धुंधला पर्याप्त दाग प्रोटीन बैंड दृश्य की अनुमति के लिए कम है जब तक विआयनीकृत पानी के साथ दाग जेल धो लें।
    3. नीचे वर्णित के रूप में वैकल्पिक रूप से, स्थानांतरण, वेस्टर्न विश्लेषण के लिए nitrocellulose करने के लिए प्रोटीन बैंड अलग कर दिया।
  8. ट्रांसफर बफर में semidry हस्तांतरण तंत्र (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 10% [V / V] मेथनॉल) का उपयोग कर 2.5 घंटे के लिए 80 मा nitrocellulose झिल्ली पर प्रोटीन बैंड अलग कर दिया।
  9. 10 मिलीलीटर पीबीएस, 10% में झिल्ली को ब्लॉक वें से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए दूध, और 0.02% (w / v) बीएसए (w / v)प्रोटीन का पता लगाने के लिए वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के ई अलावा।
    नोट: यहाँ एक उदाहरण के रूप में, चित्रा -3 सी पूरक झरना, कारक एच-जैसे प्रोटीन 1 (FHL-1) के एक नियामक के लिए जांच तीन अलग-अलग दाताओं से solubilised Bruch झिल्ली का एक प्रतिनिधि immunoblot से पता चलता है।

3. संवर्धन धब्बेदार Bruch झिल्ली की

  1. पहले से वर्णित के रूप में 1.3 - 1.1 कदम का पालन करें।
  2. एनएसआर जगह में अब भी है जबकि, केंद्रीय मैक्युला क्षेत्र (चित्रा 4 देखें) का प्रतिनिधित्व करता है कि पीले foveal रंगाई का पता लगाने। एक बाँझ 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करना, foveal क्षेत्र के ऊपर डाल दिया और मजबूती से मैक्युला में कटौती।
    1. जगह में बायोप्सी पंच रखते हुए, एक साफ बायोप्सी प्राप्त करने के लिए आसपास के आंख सामग्री दूर छील, बायोप्सी पंच ब्लेड के किनारे करने के eyecup के किनारे से एक छुरी के साथ एक अलग चीरा बनाने के लिए, और फिर चिमटी से नोचना बी का उपयोग कर।
  3. चिमटी से नोचना सी का उपयोग करना, हटानेसाफ पेट्री डिश के ढक्कन पर पंच और जगह से ऊतक 6 मिमी डिस्क। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पेट्री डिश ढक्कन और धब्बेदार पंच रखें।
  4. (बायोप्सी की सटीकता अनुमान करने के लिए पीले foveal धुंधला के लिए जाँच) पतली एनएसआर डिस्क निकालें। धीरे RPE कोशिकाओं को हटाने के लिए एक बाँझ सेल खुरचनी का प्रयोग करें।
  5. चिमटी से नोचना ए के सुझावों का उपयोग श्वेतपटल के माध्यम से धब्बेदार डिस्क सुरक्षित है, और धीरे-धीरे रंजित और चिमटी से नोचना सी फिर से उपयोग Bruch झिल्ली जटिल दूर छील, Bruch झिल्ली से अवांछित रंजित और रक्त बात दूर करने के लिए सेल खुरचनी का उपयोग करें।
  6. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में धब्बेदार Bruch झिल्ली प्लेस और 1 मिलीलीटर ultrapure पानी में निलंबित। भंवर संक्षिप्त (लगभग 15 सेकंड) किसी भी दूषित सेलुलर बात lyse मदद करने के लिए। झिल्ली गोली और सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण करने के लिए 30 सेकंड के लिए 500 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र।
    नोट: मैक्युला से अलग समृद्ध Bruch झिल्ली अब प्रोटिओमिक एक के लिए इस्तेमाल किया जा सकताalysis उपयोगकर्ता की पसंदीदा पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल तोड़कर की झिल्ली, रंजितपटलकोशिका के ईसीएम के अलगाव में Bruch झिल्ली परिणाम समृद्ध और RPE के सभी सहित कोशिकाओं / सेलुलर मलबे (चित्रा 2) के सबसे को हटा उत्पादन के लिए। पानी में समृद्ध Bruch झिल्ली की धुलाई किसी भी शेष choroidal कोशिकाओं lysing में एक महत्वपूर्ण कदम है। रंजित को समाप्त किए जाने के दौरान दबाव Bruch झिल्ली (चित्रा 2 बी) के रूप में परिभाषित क्षेत्र में कुछ शेष सेल नाभिक की कुछ संकुचित करने के लिए प्रकट होता है।

समृद्ध Bruch झिल्ली की solubilisation इसकी प्रोटीन सामग्री के बहाव के विश्लेषण की अनुमति देता है। एक 4 का उपयोग Bruch झिल्ली समृद्ध solubilised से प्रोटीन बैंड की जुदाई - प्रोटीन सामग्री की पहचान करने के लिए अपने आप में है, जबकि उपयोगी नहीं 12% ढाल एसडीएस पृष्ठ जेल, गिरफ्तारी कि दूषित रक्त प्रोटीन को कम से कम करने के लिए इस तकनीक की क्षमता प्रदर्शित करता हैई गैर-विशेष रूप से बाध्य (3B चित्रा)। समृद्ध Bruch झिल्ली के histological विश्लेषण चित्र में दिखाया गया 2 भी समर्थन करता है: इस संबंध में प्रोटीन जेल रन से एक उल्लेखनीय अनुपस्थित मानव सीरम albumin का एक बड़ा बैंड अन्यथा बाद में पश्चिमी व्याख्या करने के लिए और अधिक कठिन सोख्ता बना सकता है (~ 66 केडीए) है इस। काम के हिस्से के पहले 11 में वर्णित के रूप में वास्तव में, व्यक्तिगत दाताओं की एक श्रृंखला से Bruch झिल्ली पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 3 सी) के माध्यम से विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन के एक नंबर के लिए जांच कर रहे थे solubilised। यहाँ दिखाए गए मामले, (OX23 कहा जाता है) एक एंटीबॉडी में 12 बुलाया पूरक कारक एच (एफ एच), इस्तेमाल किया गया था, सहज उन्मुक्ति की 155 केडीए नियामक के खिलाफ निर्देशित और अलग तीन से Bruch झिल्ली नमूनों में एक कम आणविक वजन बैंड की उपस्थिति का प्रदर्शन दाताओं (चित्रा 3 सी)। यह बाद में कारक एच-जैसे प्रोटीन 1 निकला (FHL -1)एक 49 केडीए प्रोटीन एफएच से संबंधित है और एक ही जीन 13 साल की एक ब्याह भिन्नता से उत्पन्न होने वाली। FHL -1 Bruch झिल्ली 11 में मुख्य पूरक नियामक उपस्थित होने के लिए प्रकट होता है।

चित्र 1
Bruch झिल्ली के मानव नेत्र और संवर्धन के चित्रा 1. विच्छेदन। (ए) Bruch झिल्ली एक बाह्य मैट्रिक्स बाधा नहीं है। रंजित (रंजितपटलकोशिका कहा जाता है) लगातार Bruch झिल्ली में विलय कि गवाक्षित केशिकाओं की एक परत होती है और इन physiologically फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का समर्थन करता है जो रेटिना वर्णक उपकला (RPE) सेल monolayer से (बड़ी रक्त वाहिकाओं से युक्त) रंजित के बाकी अलग neurosensory रेटिना (एनएसआर)। (बी) के मानव eyecup में चार चीरों यह एक फ्लैट माउंट बनाने के लिए खोले जाने के लिए अनुमति देने के लिए बना रहे हैं।कांच का चिमटी के उपयोग के साथ हटाया जा सकता है। एनएसआर कांच के साथ बंद आ सकता है, लेकिन यह भी चिमटी से हटाया जा सकता है। एक सेल खुरचनी यह अभी भी रंजित और श्वेतपटल के लिए लंगर डाले है, जबकि Bruch झिल्ली से RPE सेल परत को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है। Bruch झिल्ली / रंजित जटिल दूर श्वेतपटल से खुली किया जा सकता है और एक नया सेल खुरचनी का उपयोग, बाहरी रंजित हटाया जा सकता है। Ultrapure पानी में एक अंतिम धोने किसी भी शेष सेलुलर बात lyses। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ultrapure वा में Bruch झिल्ली और कपड़े धोने से बाहरी choroidal संरचनाओं दूर स्क्रैप Bruch झिल्ली और (ए) से पहले रंजित। एच एंड ई दाग वर्गों के ऊतक विज्ञान और बाद में (बी)आतंकवाद Bruch झिल्ली समृद्ध उत्पन्न करते हैं। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा प्रोटीन सामग्री विश्लेषण के लिए समृद्ध Bruch झिल्ली 3. Solubilisation। (ए) प्रोटीन पीबीएस के खिलाफ dialysed जा रहा से पहले, आरटी पर 6 घंटे के लिए 8 एम यूरिया में incubating से समृद्ध Bruch झिल्ली से निकाला जा सकता है। पश्चिमी विश्लेषण के लिए, पूरे Bruch झिल्ली अपोहित से प्रोटीन प्रोटीन अलगाव मनकों का उपयोग अलग-थलग और eluted Laemmli नमूना लोड बफर कम करने के साथ उबालकर। (बी) के एक प्रतिनिधि Coomassie नीले रंग दोनों साफ दिखा रहा है, एसडीएस पृष्ठ जेल दाग और Bruch झिल्ली solubilised पतला किया जा सकता (बीएम) विधि डी का उपयोग। (ए) में escribed (ग) 3 व्यक्ति दाताओं से solubilised Bruch झिल्ली का एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा (गलियों 1-3)। कारक एच-जैसे प्रोटीन 1 (FHL -1) के लिए जांच का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 4
मैक्युला से समृद्ध Bruch झिल्ली की चित्रा 4. अलगाव। रेटिना के मैक्युला क्षेत्र एक 5 मिमी आसानी overlying गतिका के पीले रंगाई से पहचाना जा सकता है कि क्षेत्र है, और आसन्न ऑप्टिक डिस्क के लिए अपनी निकटता है। एक गाइड के रूप में गतिका का उपयोग करना, एक 6 मिमी मैक्युला ऊतक ब्लॉक आबकारी करने के लिए फ्लैट घुड़सवार मानव आंख पर एक 6 मिमी बायोप्सी पंच जगह है। Overlying एनएसआर निकालें और excised मैक्युला से RPE कोशिकाओं परिमार्जन। शेष Bruch झिल्ली / रंजित जटिल कर सकते हैंएन दूर श्वेतपटल से खुली हो और अच्छी तरह से ल्य्से ultrapure पानी में डुबकी द्वारा सेलुलर सामग्री शेष, रंजित दूर करने के लिए स्क्रैप है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ हम आगे के विश्लेषण के पश्चिमी सोख्ता 11, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और उपयोग संशोधित कक्षों 11,14 ussing Bruch झिल्ली का प्रसार संपत्तियों सहित बाद के विश्लेषण की अनुमति के लिए Bruch झिल्ली के संवर्धन का वर्णन है। महत्वपूर्ण कदम एक) आंख के भीतरी सतह की पूरी तरह से स्क्रैप और वाशिंग तोड़कर के बिखर कारण के बिना सब RPE कोशिकाओं ख) अंतर्निहित रंजित के दोहराया और सावधान स्क्रैप को दूर करने और ultrapure पानी में excised तोड़कर के ग) धुलाई शामिल अवशिष्ट कोशिकाओं के सेल सुनिश्चित करने के लिए। समृद्ध Bruch झिल्ली प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा रहा है इसके अलावा, अगर, यूरिया उपचार द्वारा प्रोटीन निकासी ऐसी यांत्रिक एकरूपता के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में इस लचीला ऊतक को तोड़ने में सबसे प्रभावी है। समृद्ध Bruch झिल्ली के ऊतक विज्ञान रंजितपटलकोशिका के ईसीएम हटा नहीं है इंगित करता है। इस पूर्व होना हैpentilaminar Bruch झिल्ली की बाहरी परत के रूप में pected रंजितपटलकोशिका endothelial सेल तहखाने झिल्ली द्वारा बनाई है। वास्तव में यह परिवर्तन टर्मिनल पूरक जटिल / झिल्ली हमले परिसर (मैक) 15 के बयान सहित एएमडी में इस में होने के रूप में रंजितपटलकोशिका के ईसीएम बनी हुई है कि फायदेमंद हो सकता है। यह श्वेतपटल, रंजित, और Bruch झिल्ली की उपस्थिति में sectioned यदि Bruch झिल्ली की विस्तृत histological विश्लेषण के लिए, इसकी संरचना बेहतर संरक्षित किया जाएगा कि ध्यान दिया जाना चाहिए। दरअसल, चित्रा 2 में प्रस्तुत ऊतक विज्ञान केवल इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक से उत्पन्न संवर्धन की डिग्री को प्रदर्शित करने का इरादा है।

धब्बेदार तोड़कर के संवर्धन एनएसआर और विशेष रूप से गतिका क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने eyecup से सावधान विच्छेदन की आवश्यकता है; अन्यथा पहचान और मैक्युला के इस प्रकार अलगाव संभव नहीं हैं। tissu की अखंडताई भी इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है और यह इसलिए 48 घंटा पोस्टमार्टम के समय के तहत नमूने का इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है। आवश्यक संवर्धन की डिग्री दाताओं के बीच होती है और दाता उम्र, पोस्टमार्टम के समय, और किसी भी आंख विकृति की उपस्थिति से प्रभावित हो सकते हैं। समृद्ध अवधि का उपयोग इस 'शुद्धि' या इस पद्धति का उपयोग Bruch झिल्ली की 'अलगाव' बस संभव नहीं है कि किया जा रहा है, तकनीक की एक सीमा को स्वीकार करने में जानबूझकर है। दरअसल, रंजितपटलकोशिका के ईसीएम Bruch झिल्ली में विलीन हो जाती है यह देखते हुए कि वहाँ पूरा जुदाई संभव नहीं है।

संबंधित नेत्र ऊतकों के जैव रासायनिक परिवर्तन को समझने नेत्र रोग प्रगति को समझने में आवश्यक है। Bruch झिल्ली का यह अनूठा संवर्धन इस समझ की सुविधा; चल रही पढ़ाई एएमडी के विभिन्न चरणों में मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग समृद्ध धब्बेदार Bruch झिल्ली के proteome जांच कर रहे हैंऔर अलग जीनोटाइप के साथ विषयों से होने वाले नमूनों में एएमडी की आणविक विकृति की समझ में सुधार करने के लिए। पहले से ही यहाँ वर्णित तकनीक को सफलतापूर्वक समृद्ध Bruch झिल्ली पर Bruch झिल्ली 11 और आगे की पढ़ाई में प्रमुख पूरक नियामक के रूप में FHL -1 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एएमडी की आणविक पैथोलॉजी में और अधिक नए अंतर्दृष्टि में परिणाम की संभावना है।

Acknowledgments

लेखक डॉ इसहाक Zambrano और मानव दाता आंख ऊतक की आपूर्ति के लिए मैनचेस्टर नेत्र अस्पताल नेत्र बैंक में कर्मचारियों, और एच एंड ई दाग छवियों के लिए जीवन विज्ञान प्रोटोकॉल सुविधा के संकाय के श्री पीट वाकर स्वीकार करना चाहते हैं। विशेष धन्यवाद माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए श्री रोजर मीडोज के लिए चला जाता है। एसजेसी एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद के एक प्राप्तकर्ता (एमआरसी) कैरियर विकास फैलोशिप (एमआर / K024418 / 1) है और लेखकों को भी, एमआरसी (G0900538 और K004441) से अन्य हाल के शोध से धन स्वीकार करते नजर में (1866) और धब्बेदार सोसायटी के लिए लड़ो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auxillary objective 0.5X GT-Vision Ltd 3638 Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6 mm Oncall Medical Supplies SCH-33-36 6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin Sigma - Aldrich A3059
Bromophenol Blue Sigma - Aldrich B0126
Cell scrapers Sarstedt 83.183 For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials Sarstedt 72.38
Disposable Scalpels Fisher Scientific 12387999 Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms GT-Vision Ltd 0153 Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma - Aldrich D8537 Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4280 (A) Fine (100 mm) and straight
(B) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4272 (B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps Scientific Laboratory Supplies INS4323 (C) Straight fine points
Glycerol Sigma - Aldrich G1345
Glycine Sigma - Aldrich B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software GT-Vision Ltd 1122
Methanol Sigma - Aldrich M/4000/17
Nitrocellulose membrane Life Technologies NP0007
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels Life Technologies NP0322BOX
Petri dish Sterilin 101VR20 90 mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin) Agilent 400714-61
SDS Bio-Rad 161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X) GT-Vision Ltd 5595 Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl Sigma - Aldrich T3253

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 105 मानव आँख ऊतक उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन रेटिनल रोग Bruch झिल्ली drusen पश्चिमी सोख्ता
मानव दाता आखें से Bruch झिल्ली के संवर्धन
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McHarg, S., Brace, N., Bishop, P. N., Clark, S. J. Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes. J. Vis. Exp. (105), e53382, doi:10.3791/53382 (2015).

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