Anrikning av Bruchs membran från human donator Ögon

Abstract

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en ledande orsak till synnedsättning i den utvecklade världen. Sjukdomen manifesterar sig genom förstörelsen av näthinnans centrum, som kallas gula fläcken, vilket resulterar i förlust av det centrala seendet. Tidig AMD kännetecknas av närvaron av små, gulaktiga lesioner kallade mjuka drusen som kan avancera till slutet av AMD som geografisk atrofi (torr AMD) eller kärlnybildning (våt AMD). Trots att de kliniska förändringar är väl beskrivna, och förståelsen av genetiska påverkan på ger AMD risk blir allt mer detaljerad, är ett område som saknar stora framsteg förståelse av de biokemiska konsekvenserna av genetisk risk. Detta beror delvis på svårigheter att förstå biokemi Bruchs membran, en mycket tunn extracellulär matris som fungerar som ett biologiskt filter av material från blodtillförsel och en byggnadsställning på vilken retinala pigmentepitel (RPE) cellmonoskiktet är bosatt. Drusen form inom Bruch membran och deras närvaro stör näringsflödet till RPE-celler. Endast genom att undersöka proteinsammansättningen i Bruch membran, och faktiskt hur andra proteiner interagerar med det, kan forskarna hoppas att riva de biokemiska mekanismer som ligger till grund drusen bildning, utveckling av AMD och efterföljande synförlust. Detta dokument detaljer metoder för att berika antingen hela Bruch membran, eller bara från macula regionen så att den kan användas för efterföljande biokemisk analys och ge exempel på hur detta redan förändra förståelsen av Bruch membran biokemi.

Introduction

Användningen av post mortem mänskliga ögat vävnad i ögon forskning är en ovärderlig resurs för att förstå ögonsjukdom patogenes. Analys av humana givar ögon har gjort viktiga insatser för att kräsna mekanismerna som ligger till grund åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), som är den främsta orsaken till blindhet i västvärlden ^1. Globalt svarar AMD för cirka 8,7% av all blindhet och med en allt äldre befolkning, är det förutspås att påverka 196 miljoner människor år 2020 ^2. AMD resulterar i förlust av det centrala seendet och har en djupgående inverkan på patientens självständighet och livskvalitet ^3. Tidig AMD kännetecknas av bildningen av drusen och det kan gå vidare till geografisk atrofi (ibland kallad "torr" AMD), eller koroidal neovaskularisering (även benämnd neovaskulärt eller "våta" AMD). Medan anti-VEGF injektioner kan stabilisera eller förbättra synen i neovaskulär AMD det jagär inte botande, och för närvarande finns det ingen behandling för geografisk atrofi.

Medan vissa genetiska varianter har visat att ändra AMD risk ^4-8, mindre är känt om hur dessa varianter påverkar makula på en biokemisk nivå. En viktig plats i AMD patogenes är Bruch membran. Drusen form inom denna struktur och olika studier har gett bevis för komplementaktivering i och runt Bruch membran i AMD ^9. Bruchs membran är ett ark av extracellulär matris som skiljer de retinala pigmentepitel (RPE) -celler från åderhinnan, och är ungefär 4 pm tjockt. Bruchs membran övergår i choriocapillaris, ett skikt av åderhinnan som innehåller Fenestrated kapillärer och utanför detta är skikt innehållande större blodkärl ¹⁰ (Figur 1A).

Bruchs membran är en pentilaminar ark av extracellulär matrix (ECM), och denna metod beskriver hur att isolera Bruch membran, tillsammans med ECM de underliggande choriocapillaris (hädanefter kallad berikat Bruch membran), vilket till stor del decellulariserad och fri från röda blodkroppar. Anrikat Bruchs membran användes sedan för Western blotting och histologi experiment. Vidare metodik för att berika Bruchs membran uteslutande från macula regionen hos ögat beskrives, som kommer att vara av särskilt intresse för de som undersöker de biokemiska aspekterna av AMD.

Protocol

Mänsklig ögonvävnaden samtyckt för forskningsändamål erhölls från Manchester Royal Ögonsjukhus Eye Bank efter avlägsnande av hornhinnan för transplantation. Användningen av mänsklig vävnad för forskning var i enlighet med den mänskliga Tissue lagen (2004) riktlinjer, och med godkännande University Research etikkommitté (referens 11305).

1. Anrikning av hela Bruch membran

1. Rengör arbetsytan runt och under dissekera mikroskop med 1% desinfektionsmedel (v / v) och sedan torka med 70% (v / v) etanol.
2. Se till att följande är till hands: en ny engång skalpell, två sterila cellskrapor (vanligen används i vävnadskultur) och tre par pincett (listade här som A, B och C, se materiallista).
3. Placera ögongloben i en engångspetriskål, behåller locket för senare användning. Med hjälp av en ny engångs skalpell, ta bort eventuella synnerven, vilket kan störa med att skapa en plan mount av vävnaden. Därefter gör fyra snitt lika åtskilda för att skapa fyra kvadranter, om man går vidare till del 3 (anrikning av macular Bruch membran) inte skära igenom makula regionen.
   1. Se till att snitt sträcker sig genom hela djupet av ögonvävnaden - från den innersta neuro näthinnan (NSR), genom åderhinnan och sklera (ögonvitan). Fortsätt snittet hela vägen runt ögat från kanten av ögonmusslan på synnerven. Detta kommer att tillåta ögonmusslan att plattas ut (se figur 1B).
4. Innehav en kvadrant av tillplattade ögonmussla med hjälp av pincett A (för att förhindra åderhinnan lossnar), använd större pincett B att gripa glaskroppen och underliggande NSR och dra bort från näthinnans pigmentepitel (RPE) denna vävnad börjar vid periferin, rör sig mot mitten för den öppnade ögonmusslan och sedan till den motsatta sidan. Vanligtvis, men inte alltid båda glaskroppen och NSR loss som en. Använd scalpel att skära eventuellt kvarvarande NSR förankrade på den optiska skivan.
5. Återigen, medan du håller en kvadrant av vävnad på plats med pincetten A, använd steril cellskrapa för att försiktigt lösgöra RPE monoskiktet från hela den inre ytan av ögonmusslan. Dessa celler lätt lossna och kan ses som mörka brunpigmente klumpar. Skölj med PBS för att försiktigt tvätta bort lösgjorts RPE-celler från ögonmusslan.
6. Sedan använder pincett A för att försiktigt dra av den överliggande mörkröd vävnad (som omfattar både Bruch membran och åderhinnan) från alla 4 ögon kvadranter. Placera den utskurna vävnaden i en ren skål.
7. Med användning av plattade kant en cellskrapa för att hålla utskurna vävnaden på plats, använd den andra skrapan att försiktigt skrapa vävnaden. Vänd vävnaden och upprepa, ta bort så mycket överskottsmaterial som möjligt. Så småningom kommer en genomskinlig membran förbli: detta är den grovt anrikade Bruchs membran. Användningen av dissektionsmikroskop vid minst 20X förstoring ärväsentliga i att bistå avlägsnande av åderhinnan och anrikning av Bruch membran.
8. Med hjälp av en pasteurpipett, kort skölj Bruchs membran med ultrarent vatten för att avlägsna kvarvarande åderhinnan och blod innan du placerar membranet i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
9. Häng upp berikade Bruch membran i cirka 1 ml ultrarent vatten och virvel kort (ca 15 sekunder) för att lysa någon kontamine cellulär materia (se Figur 2). Centrifugera provet vid 500 xg under 30 sek för att pelle membranet och aspirera bort supernatanten.
   Obs: Den återstående berikat Bruch membran är nu klar för solubilisering (som beskrivs i avsnitt 2 nedan) eller lagring vid -80 ° C för senare användning.

2. Solubilisering av hela Enriched Bruchs membran och Western blot-analys

1. Utdrag protein från berikat Bruch membran genom nedsänkning av vävnaden i 500 l 8 M urea för 6 timmar vid rumstemperatur i 1,5 ml mikrocentrifugrör (figur 3a).
2. Centrifugera solubiliserade proverna vid 10.000 xg under 10 minuter för att pelletera eventuellt kvarvarande extracellulära fråga. Avlägsna supernatanten och överför den till 3500 Da MWCO dialysmembran, placera sedan provet i en L PBS att dialysera under 16 timmar vid 4 ° C.
3. För varje prov, tillsätt 40 pl proteinisoleringskulor, och rotera provet / kula-blandning (20 varv per minut på en roterande bländare) vid RT under 30 minuter.
4. Centrifugera proverna vid 10000 xg i 5 min för att pelletisera pärlorna. Avlägsna supernatanten och solubilisera protein bundet till kulorna i 30 | il 2x provladdningsbuffert (65,8 mM tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (vikt / volym) glycerol, 0,01% bromfenolblått, 3% β-merkaptoetanol).
5. Inkubera proverna vid 100 ° C under 10 min och centrifugera sedan vid 10000 xg i 5 min för att pelletera de återstående kulorna.
6. Fyll på supernatanten som innehåller de frigjorda proteiner på till en i förväg gjuten SDSsida gradientgel (se materiallista) för proteinseparation.
7. Visualisera separerade proteinband med hjälp av en gemensam färgningsprotokollet, t.ex., Coomassie-blått.
   1. I korthet, tillsätt 20 ml av den lysande blå fläck (0,1% briljantblått (vikt / volym), 50% metanol, 10% isättiksyra, 40% vatten) till gelén, och inkubera under 30 min vid RT under försiktig omrörning .
   2. Kassera färgningslösningen och tvätta färgade gelén med avjonat vatten tills bakgrundsfärgning är tillräckligt reducerad för att tillåta färgade proteinband visualisering.
   3. Alternativt separerades överföringsproteinbanden till nitrocellulosa för Western-analys, såsom beskrivs nedan.
8. Överföring separerade proteinband på nitrocellulosamembran vid 80 mA under 2,5 timmar med användning av halvtorr överföringsapparat i överföringsbuffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 10% [volym / volym] metanol).
9. Blockera membranet i 10 ml PBS, 10% (vikt / volym) mjölk, och 0,02% (vikt / volym) BSA under 16 h vid 4 ° C innan the tillsats av de önskade primära antikroppar för proteindetektion.
   Anmärkning: Som ett exempel här, visar fig 3C en representativ immunoblot av solubiliserade Bruchs membran från tre separata donatorer sonde för en regulator av komplementkaskaden, faktor H-liknande protein 1 (FHL-1).

3. Anrikning av macular Bruch membran

1. Följ steg 1,1-1,3 såsom tidigare beskrivits.
2. Medan NSR är fortfarande på plats, lokalisera den gula foveala färgning som representerar den centrala makula regionen (se Figur 4). Med hjälp av en steril 6 mm biopsistans, placera den över foveala regionen och fast klippa in i gula fläcken.
   1. Att hålla biopsistans på plats, göra en separat snitt med en skalpell från kanten av ögonmusslan till kanten av biopsistans blad, och sedan använda pincett B, skala bort det omgivande ögat material för att uppnå en ren biopsi.
3. Med hjälp av pincett C, ta bort6 mm tjock platta av vävnad från stansen och plats på ren petriskål lock. Placera locket petriskålen och macular punch under dissekera mikroskop.
4. Ta den tunna NSR skivan (kontrollera gul foveala färgning att sluta noggrannhet biopsi). Använd en steril cellskrapa för att försiktigt ta bort RPE-celler.
5. Säkra macular skivan via sklera med hjälp av tips av pincett A, och sakta dra av åderhinnan och Bruch membran komplex med hjälp av pincett C. Återigen använder cellskrapa för att ta bort oönskade åderhinnan och blod material från Bruch membran.
6. Placera macular Bruch membran i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och suspendera i 1 ml ultrarent vatten. Vortex kort (ca 15 sekunder) för att lysera alla förorenande cellulär materia. Centrifugera provet vid 500 xg under 30 sek för att pelle membranet och aspirera bort supernatanten.
   Obs: Det anrikade Bruchs membran som isolerats från macula kan nu användas för proteomik enALYS använder användarens föredragna matsmältning protokoll.

Representative Results

Det protokoll som beskrivits ovan för framställning av anrikat Bruchs membran resulterar i isolering av Bruchs membran, ECM av choriocapillaris och tar bort det mesta av celler / cellrester inklusive alla RPE (figur 2). Tvättningen av den anrikade Bruch membran i vatten är ett viktigt steg i lyse eventuella återstående koroidala celler. Det tryck som utövas under skrotning av koroidea förefaller att kompaktera några av de få kvarvarande cellkärnor i det område som definieras som Bruchs membran (Figur 2B).

Solubiliseringen av anrikad Bruchs membran tillåter nedströms analys av proteinhalten. Separationen av proteinbanden från solubiliserad anrikad Bruchs membran med användning av en fyra - 12% gradient SDS-PAGE-gel, medan inte användbart i sin egen rätt för att identifiera proteininnehåll, gör visar förmågan hos denna teknik för att minimera kontaminerande blodproteiner att Are ospecifikt bundet (figur 3B). I detta avseende, en noterbar frånvarande från proteingel kör är en stor band av humant serumalbumin (~ 66 kDa) som annars kan göra efterföljande Western blotting svårare att tolka: den histologiska analys av anrikad Bruch membran visas i figur 2 stöder också detta. Såsom en del av arbetet som beskrivits tidigare ^11, solubiliserad Bruchs membran från en serie av individuella donatorer sonderades för ett antal proteiner med användning av specifika antikroppar via Western blotting (figur 3C). I det fall som visas här, en antikropp (benämnd OX23) ¹² riktad mot en kDa regulator av medfödd immunitet 155, kallad komplementfaktor H (FH), användes och visade närvaron av en lägre molekylvikt band i Bruchs membran prover från tre separata givare (Figur 3C). Detta visade sig senare ut att vara faktor H-liknande protein 1 (FHL-1), Ett protein 49 kDa i samband med FH och som härrör från en skarv variant av samma gen ^13. FHL-1 verkar vara den viktigaste komplement regulator närvarande i Bruch membran ^11.

Figur 1. Dissekering av det mänskliga ögat och Berikning av Bruchs membran. (A) Bruchs membran är en extracellulär matris barriär. Åderhinnan innehåller ett skikt av Fenestrated kapillärer som kontinuerligt övergår i Bruchs membran (kallad choriocapillaris) och dessa separera resten av åderhinnan (innehållande stora blodkärl) från det retinala pigmentepitelet (RPE) cellmonoskiktet, som fysiologiskt stöder fotoreceptorceller av neurosensoriska näthinnan (NSR). (B) Fyra snitt i den mänskliga ögonmusslan är gjort så att den kan öppnas för att skapa en platt fäste. Deglaskroppen kan tas bort med hjälp av pincett. NSR kan lossna tillsammans med glaskroppen, men kan också tas bort med pincett. En cellskrapa används för att avlägsna RPE cellskiktet från Bruchs membran medan den fortfarande förankrad till åderhinnan och senhinnan. Den Bruchs membran / koroidea komplexet kan skalas bort från senhinnan och med användning av en ny cellskrapa, kan den yttre koroidea avlägsnas. En slutlig tvättning i ultrarent vatten lyserar eventuellt kvarvarande cellmaterial. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Histologi av Bruchs membran och koroidea. H & E-färgade snitt före (A) och efter (B) skrapa bort de yttre koroidala strukturer från Bruchs membran och tvättning i ultrarena water att generera berikad Bruch membran. Skalstrecken representerar 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Solubilisering av anrikad Bruchs membran för Proteininnehåll Analys. (A) Protein kan extraheras från anrikade Bruchs membran genom inkubering i 8 M urea för 6 timmar vid rumstemperatur, innan den dialyseras mot PBS. För Western-analys, kan proteiner från hela Bruchs membran dialysat isoleras med användning av proteinisolerings pärlor och eluerades genom kokning med Laemmli reducerande provladdningsbuffert. (B) En representativ Coomassie-blått färgad SDS-PAGE-gel, som visar både snyggt och späddes solubiliserades Bruchs membran (BM) med användning av förfarandet d. beskrivningen i (A) (C) En representant western blöt av solubiliserad Bruch membran från 3 enskilda donatorer (banorna 1-3). sonderade för faktor H-liknande protein 1 (FHL-1) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Isolering av anrikat Bruchs membran från macula. Gula fläcken området av näthinnan är en 5 mm område som lätt kan identifieras av den gula färgning av den överliggande fovea, och dess närhet till den intilliggande synnervspapillen. Använda fovea som en guide, placera en 6 mm biopsistans på plan monterade mänskliga ögat att skära en 6 mm macula vävnadsblock. Ta bort överliggande NSR och skrapa bort RPE-celler från utskurna makula. Resterande Bruch membran / koroidea komplex kan denn dras bort från sklera och grundligt skrapas för att avlägsna åderhinnan, lyse återstående cellmaterial genom nedsänkning i ultrarent vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskriver vi anrikning av Bruchs membran för ytterligare analys som tillåter efterföljande analyser inklusive western blotting ^11, masspektrometri och diffusionsegenskaper i Bruchs membran med användning av modifierad Ussing-kamrarna ^11,14. Kritiska steg inkluderar a) grundlig skrapning och tvättning av den inre ytan av ögat för att avlägsna alla RPE B-celler) den upprepade och noggrann skrapning av den underliggande åderhinnan utan att orsaka att Bruchs att sönderdelas och c) tvättning av den utskurna Bruchs i ultrarent vatten att säkerställa lys av återstående celler. Dessutom, om den anrikade Bruchs membran skall användas för proteomik analys, är protein extraktion genom ureabehandling det mest effektiva för att bryta ned denna fjädrande vävnad jämfört med andra metoder såsom mekanisk homogenisering. Histologi av anrikad Bruchs membran indikerar ECM av choriocapillaris avlägsnas inte. Detta är att vara frittväntad som det yttre skiktet av pentilaminar Bruchs membran bildas av choriocapillaris endoteliala cellbasalmembran. I själva verket kan det vara fördelaktigt att ECM av choriocapillaris kvarstår som förändringar sker i detta i AMD och nedfallet av terminalkomplementkomplex / membranattackkomplexet (MAC) ^15. Det bör noteras att för detaljerad histologisk analys av Bruchs membran, dess struktur skulle bevaras bättre om sektionerad i närvaro av sklera, åderhinnan och Bruchs membran. Faktum är att histologi presenteras i Figur 2 endast är avsett för att demonstrera graden av anrikning som härrör från den teknik som beskrivs i detta manuskript.

Anrikning av macular Bruchs kräver noggrann dissekering av ögonmusslan, se till att NSR och i synnerhet fovea inte är skadade; annars identifiering och därmed isolering av macula är inte möjligt. Integriteten hos tissue är också viktigt att denna process och det rekommenderas därför att proverna under 48 h efter slakt tiden användas. Graden av anrikning som krävs varierar mellan givare och kan påverkas av donatorns ålder, obduktioner tid och närvaron av alla ögon patologi. Användningen av termen anrikad är avsiktligt att erkänna en begränsning av tekniken, vilket är att "rening" eller "isolering" av Bruch membran med den här metoden är helt enkelt inte möjligt. I själva verket, med tanke på att ECM av choriocapillaris övergår i Bruch membran där fullständig separation inte är möjlig.

Förstå biokemiska förändringar i respektive okulära vävnader är viktigt att förstå ögonsjukdomsförloppet. Denna unika anrikning av Bruch membran underlättar denna förståelse; pågående studier undersöker proteomet av anrikat macular Bruch membran med hjälp av masspektrometri i olika skeden av AMDoch i prover som kommer från patienter med olika genotyper för att förbättra förståelsen av den molekylära patologin hos AMD. Redan den teknik som beskrivs här har använts för att framgångsrikt identifiera FHL-1 som dominerande komplement regulator i Bruch membran ¹¹ och ytterligare studier om anrikat Bruch membran kommer sannolikt att leda till att fler nya insikter molekylär patologi AMD.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auxillary objective 0.5X	GT-Vision Ltd	3638	Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount
Biopsy Punch 6 mm	Oncall Medical Supplies	SCH-33-36	6mm Biopsy Punches
Bovine serum albumin	Sigma - Aldrich	A3059
Bromophenol Blue	Sigma - Aldrich	B0126
Cell scrapers	Sarstedt	83.183	For membrane enrichment
CyroPure Cyrovials	Sarstedt	72.38
Disposable Scalpels	Fisher Scientific	12387999	Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.
Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms	GT-Vision Ltd	0153	Flexible light source essential for dissection and imaging
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma - Aldrich	D8537	Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.
(A) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4280	(A) Fine (100 mm) and straight
(B) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4272	(B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample
(C) Forceps	Scientific Laboratory Supplies	INS4323	(C) Straight fine points
Glycerol	Sigma - Aldrich	G1345
Glycine	Sigma - Aldrich	B0126
GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software	GT-Vision Ltd	1122
Methanol	Sigma - Aldrich	M/4000/17
Nitrocellulose membrane	Life Technologies	NP0007
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels	Life Technologies	NP0322BOX
Petri dish	Sterilin	101VR20	90 mm, used as a dish for samples
Protein isolation beads (Strataclean resin)	Agilent	400714-61
SDS	Bio-Rad	161-0301
Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X)	GT-Vision Ltd	5595	Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T3253