Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Published: December 7, 2015 doi: 10.3791/53402
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

Abstract

Phagocytosis הוא תהליך בסיסי שדרכו תאים חיסוניים מולדים לבלוע חיידקים, תאים אפופטוטיים או חלקיקים זרים אחרים כדי להרוג או לנטרל את חומר בליעה, או להציג אותה כאנטיגנים וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית. PH של phagosomes הוא פרמטר קריטי המסדיר ביקוע או היתוך עם endomembranes והפעלה של אנזימי מפרקי חלבונים, אירועים המאפשרים vacuole phagocytic להתבגר לתוך אברון נגרע. בנוסף, טרנסלוקציה של H + נדרשת לייצור רמות גבוהות של מינים תגובתי חמצן (ROS), שהם חיוניים להרג יעיל ואיתות לרקמות מארח אחרות. פתוגנים תאיים רבים לחתור תחת הרג phagocytic ידי הגבלת החמצת phagosomal, המדגיש את חשיבותו של ה- pH בביולוגיה phagosome. כאן אנו מתארים שיטה למדידת pH ratiometric phagosomal בנויטרופילים באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) -labeled zymosan כטארג phagocyticETS, וLive- תא הדמיה. Assay מבוסס על תכונות הקרינה של FITC, שהוא הרווה ידי pH חומצי כאשר נרגש ב 490 ננומטר, אך לא כאשר נרגש ב 440 ננומטר, המאפשר כימות של יחס pH תלוי, ולא הקרינה מוחלטת, של צבע אחד. פרוטוקול מפורט לביצוע בכיול צבע אתר והמרה של יחס לערכי pH האמיתי הוא גם סיפק. שיטות ratiometric חד צבע נחשבות בדרך כלל עדיפה על אורך גל בודד או פרוטוקולים פסאודו-ratiometric כפול צבע, כפי שהם פחות רגישים להפרעות כגון הלבנה, להתמקד שינויים, וריאציות לייזר, ותיוג אחיד, המעוותים את האות הנמדדת. שיטה זו ניתן לשנות בקלות למדוד pH בסוגי תאי phagocytic אחרים, וzymosan יכול להיות מוחלף על ידי כל חלקיקים המכילים אמין אחרים, מחרוזי אינרטי למיקרואורגניזמים חיים. לבסוף, בשיטה זו ניתן להתאים לעשות שימוש בבדיקות ניאון אחרים רגישות לטווחי pH שונים או phagosom האחרפעילויות אל, מה שהופך את פרוטוקול כללי להדמיה התפקודית של phagosomes.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המניפולציות של בעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות קפדניות של ועדת המחקר בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'נבה.

1. הכנת יעדי phagocytic

  1. הוסף 20 מ"ג של zymosan המיובש 10 מיליליטר שנאגרו מלוח פוספט סטרילי (PBS). מערבולת וחום באמבט מים רותח למשך 10 דקות. מגניב ו צנטריפוגות XG ב 2000 במשך 5 דקות.
  2. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מיליליטר PBS וsonicate במשך 10 דקות באמבט המים sonicator. העבר את 500 μl לשני צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות.
  3. חזור על לשטוף עם 500 μl PBS. Zymosan מבושל יכול להיות aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  4. לשטוף zymosan פעמיים ב500 μl מוכן טרי 0.1 M Na 2 CO 3, pH 9.3 כאמור לעיל (שלב 1.2).
  5. גלול ב490 μl לאחר השטיפה הסופית. הוסף 10 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​מומס FITC בsulfoxid דימתילדואר (DMSO), מערבולת, מכסה בנייר כסף, ודגירה עם תסיסה במשך 4 שעות ב RT.
  6. כדי להסיר צבע מאוגד, לשטוף כאמור לעיל (שלב 1.2), ראשון עם 0.5 מיליליטר DMSO + 150 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 300 μl PBS, אז 0.5 מיליליטר DMSO + 450 μl PBS, אז PBS לבד.
  7. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer. הוסף 1 μl של zymosan 500 μl PBS, מערבולת, ולאחר מכן להוסיף 10 μl לקצה תא haemocytometer, שבו הוא פוגש את coverslip הניח על הרשת המרכזית. הר haemocytometer על מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד מטרת 20X.
  8. להתמקד בפינה השמאלית העליונה מכילה 16 ריבועים ולספור את כל חלקיקי zymosan בתחום זה באמצעות דלפק יד נקודות. חזור עם הפינה הימנית התחתונה. חשב את ריכוז zymosan באמצעות המשוואה הבאה: ריכוז Zymosan = רוזן / 2 x 500 x 10 4 zymosan / מיליליטר. zymosan שכותרתו ניתן aliquoted, קפוא ומאוחסן ב -20 ° C.
  9. Opsonize Wi zymosan הכותרתth נוגדן אנטי zymosan ארנב ב 1: 100 דילול. מערבולת דגירה עבור שעה 1 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl PBS כאמור לעיל (שלב 1.2).
    הערה: Sonication מומלץ מאוד, במיוחד לאחר opsonization, כzymosan נוטה ליצור גושים שיכולים לעשות ניתוח קשה יותר בהמשך. Opsonization עם 65% חולדה V / V או סרום אדם עשוי לשמש כחלופה.
  10. רוזן zymosan באמצעות haemocytometer כפי שמתואר בשלבים 1.7-1.8, ולדלל עד 100 x 10 6 מיליליטר / חלקיקים. Opsonization עם גירוי phagocytic אחר, כגון השלמה או לא opsonization, ניתן לבצע לחלופין.

2. חיים מיקרוסקופית וידאו

  1. לבודד נויטרופילים עכבר עיקריים כפי שתואר בפירוט במקום אחר 38.
    1. לחלופין, להשתמש בכל סוג תא phagocytic. שמרו נויטרופילים על קרח ברוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 בתוספת 5% בסרום עגל עוברי (V / V), 200 פניצילין U / streptomycin, בריכוז של 10 x 10 6 תאים / מיליליטר עד מוכן לשימוש. סוגי תאים אחרים יכולים להיות שנזרעו 1-4 ימים לפני.
  2. הוסף 2 x 10 5 (20 μl) של נויטרופילים למרכז צלחת זכוכית תחתונה 35 מ"מ, להפיץ את הירידה על ידי הוספת 50 μl של מדיום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.
  3. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) חימם עד 37 ° C המכיל hydrazide מעכב 4-aminobenzoic MPO הספציפי (4-ABH, 10 מיקרומטר). גם מעכבי MPO שאינם ספציפיים, כגון אזיד הנתרן (5 מ"מ), ניתן להשתמש אך הוצעו לאחרונה להפעיל אפקטים שאינם ספציפיים נוספים על pH 39.
  4. הר הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield מצויד במערכת חימום 37 ° C ואובייקטיביים שמן 40X. דגירה תאים בלי הדמיה במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים וציוד לאזן.
  5. התאם את הגדרות מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונת שידור בהיר שדה [PHAse או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אם קיימים] עם 440 ננומטר או 490 ננומטר עירור ופליטת 535 ננומטר כל 30 שניות.
  6. התאם זמן חשיפה ותדירות רכישה בהתאם למערכת מיקרוסקופ כדי למנוע photobleaching יותר מדי וphototoxicity ובהתאם לשאלות הניסיוניות שהתבקש. בגין רכישת תמונה.
  7. אחרי 2 דקות, להוסיף 10 x 10 6 (50 μl) opsonized FITC-zymosan למרכז הצלחת. התאם יעד: יחסי תא בהתאם לסוג של תָא בַּלעָן ויעד בשימוש.
  8. המשך הדמיה למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות להפסיק את רכישת הזמן לשגות ולהתחיל טיימר. הזז את הבמה וללכוד 10 או יותר תמונות בתחומים שונים של נוף לphagosomes אחר התמונה, כל זאת במסגרת 5 דקות.

3. ניסויי כיול והבקרה

  1. הכן את פתרונות כיול pH (מתכונים מתוארים בטבלה 1) לפני היום של ניסוי ולהקפיא בaliquots 10 מיליליטר.להפשיר את פתרונות כיול וחמים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בדוק את ה- pH עם מד pH ולהקליט את ה- pH בפועל של פתרונות.
  2. הר משאבת peristaltic על צלחת תחתית הזכוכית לפני רכישת תמונה ולבצע מיקרוסקופיה וידאו החי כפי שתואר לעיל (סעיף 2).
  3. בתום תקופת הרכישה 30 דקות להפוך את המשאבה בלהסיר את הפתרון בתוך הצלחת, להוסיף 1 מיליליטר של פתרון הכיול הראשון ולעצור את המשאבה.
  4. חכה עד שהאות תתייצב, בדרך כלל 5 דקות. חזור עם כל פתרון כיול.
    1. לבצע כיול לפחות אחת ליום ניסיוני, ולכייל מתחיל עם pH הגבוה ביותר ועובד ברצף לרמה הנמוכה ביותר, כמו גם החל מה- pH הנמוך ביותר ועובד ברצף לקראת הגבוה ביותר.
  5. כביקורת, להוסיף של יודיד propionium diphenyl מעכבי מונואמין NADPH 100 מיקרומטר 100 μl (DPI) בדילול מלא בHBSS לתאים ב900 μl HBSS בצלחת תחתית הזכוכית, ודגירה של 10 דקות.
  6. התחל רכישה ולהוסיף zymosan כאמור לעיל (שלב 2.7). לאחר 15 דקות של phagocytosis, להוסיף 10 μl של 10 מיקרומטר מעכב V-ATPase concanamycin (קונקה) בדילול מלא HBSS ולהמשיך הדמיה ל-15 דקות נוספות.

4. ניתוח

  1. ניתוח של הזמן לשגות סרטים ותמונות phagosome.
    הערה: ההוראות הבאות הן ספציפיות לImageJ. צעד אחר צעד הוראות עשויות להשתנות במידה רבה בהתאם לתוכנה בשימוש, אבל הפונקציות מתוארות בסעיף זה זמינות ברוב תוכנות ניתוח תמונה מקצועיות.
    1. פתח את התמונות עם תוכנת ניתוח תמונה מקצועית. הפחת את הרקע בערוץ 490 על ידי ציור ROI כיכר קטן עם כלי בחירת מצולע מרובעים באזור שבו אין תאים, ולחיצה חיסור התוספים> BG מהחזר על ההשקעה. לאחר מכן להעלות אותו ההחזר על ההשקעה בערוץ 440 בעריכה> בחירת לחיצה> שחזור בחירה וחזור.
    2. הפוך תמונת יחס 32 סיביות של הערוץ 490 מחולק בערוץ 440 על ידי לחיצה על תהליך> מחשבון תמונה ..., בחירת התמונות המתאימות בתפריטים הנפתחים Image1 וImage2, ולאחר מכן בחירה "הפרד" בתפריט הנפתח מבצע , ובדיקה של 32 סיביות (לצוף) תיבת סימון תוצאה.
    3. שנה את הטבלה להסתכל למעלה קידוד הצבע לצבע-קידוד יחס תואם על ידי לחיצה שולחנות תמונה> בדיקה> קשת RGB. סף את תמונת היחס לחסל 0 ואינסוף פיקסלים על ידי לחיצה תמונה> התאם> סף .... התאם את פסי הגלילה כך zymosan שמופיע באדום ולחץ על החל, ולוודא פיקסלים רקע הסט לתיבת סימון נאן הוא נבחר.
    4. לשלב ערימת יחס זה עם הערוץ הבהיר שדה למרוכבים רב-ערוצים על ידי לחיצה תמונה> צבע> מיזוג ערוצים, ובחירת התמונה הבהיר השדה בתפריט הנפתח ערוץ האפור ותמונת היחס בתפריט הנפתח הערוץ הירוק, ו בחירהשמור את תמונות מקור תיבת סימון. סרוק את הזמן לשגות סרטים או תמונות כדי לקבוע אילו phagosomes הן להיות מנותח. הערוץ בהיר השדה הוא שימושי עבור זה.
    5. לצייר אזורים של העניין (ROI) באמצעות כלי בחירת מצולע הסגלגלים סביב phagosomes, ולהוסיף אותם למנהל את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה לנתח> כלים> מנהל ROI> להוסיף. למדוד יחס עוצמת zymosan על ידי לחיצה נוסף> Multi-מדוד ודה-בחירת השורה אחת לכל תיבת סימון פרוסה.
    6. לזמן לשגות סרטים, מסלול phagosomes אחד בכל פעם על ידי ציור את ההחזר על ההשקעה, הקלדת Ctrl + M כדי למדוד כל נקודת זמן, ונע ההחזר על ההשקעה בעת צורך לעקוב אחר ערכי עוצמה לאורך זמן. העתק את המדידות מחלון התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
      הערה: ניתוח של 15 (5 קורסי זמן לניסוי x 3) ניסויים בלתי תלויים היא אידיאלית, אבל פחות או יותר עשוי להידרש בהתאם להשתנות נצפתה. שמירת ROIs תמיד מומלץ. כמה חבילות תוכנה מאפשרות Regi תמונהstration ועדכון דינמי של ROIs, להקל בחלק זה של הניתוח.
  2. המרה מקרינה לערכי pH
    1. מדוד את היחס 490/440 לphagosomes בזמן לשגות סרטי הכיול, כמתואר בסעיף 4.1.
    2. בגיליון אלקטרוני, להתוות ערכי היחס לאורך זמן, ולחשב את ערכי יחס הממוצע מכל phagosomes בתוך שדה הראייה (בדרך כלל, בין 5-20) מ -5 נקודות זמן בתוך אמצע תקופת הזמן המתאים לכל כיול pH פִּתָרוֹן. (ראה גם את התיבות האדומות באיור 5 א.)
    3. עלילה ערכים אלה ממוצע 490/440 יחס נגד pH נמדד בפועל. לשלב לפחות 3 כיולים עצמאיים לגרף אחד. השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית או מספרית לבצע רגרסיה ליניארית (עקומה בכושר הטובה ביותר), בדרך כלל למשוואת sigmoidal.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה השתמשה הייתה sigmoidal ולצמן [Y = + תחתון ((למעלה-למטה)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], שבו ערכי Y הם 490/440 יחסים, X הם ערכי pH ולמעלה, למטה, פרמטרים V50 ומדרון מחושבים על ידי התוכנה.
    4. השתמש במשוואה שהתקבלה להפוך ערכי יחס לpH.
      הערה: לדוגמא, באיור 5 המשוואה שהתקבלה עבור עקומת הכיול בנוכחות אזיד הנתרן היא 490/440 יחס = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . פתרון לpH נותן את המשוואה הבאה: pH = 6.993-.9291 * [LN ((1.178 / (יחס-1.103)) - 1))].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הם הבאים תוצאות נציג לניסוי שבו ה- pH phagosomal של נויטרופילים עכבר העיקריים מבודדים ממח העצם של פרא-סוג או Hvcn1 - / - עכברים הושוו. לניסוי מוצלח, חשוב להשיג מספיק phagosomes בתוך שדה הראייה בכל משך סרט הזמן לשגות, תוך הימנעות phagosomes רב מדי, שמאוחר יותר יהיה קשה יותר למגזר במהלך ניתוח התמונה. איור 1 מציג דוגמאות של confluencies הטוב והרע. לתלוי זמן ותמונת הניתוחים, חלקיקי zymosan חיצוניים יש להבחין בין phagosomes ונכללים בניתוח. איור 2 מדגים כיצד התמונה הבהיר השדה יכולה להיות שימושית כדי לעזור להבחין חלקיקי zymosan חיצוניים מphagosomes. איור 3 מציג דוגמאות של phagosome הטיפוסי pH בזמן קורסים בפרא-סוג לעומת Hvcn1 - / - תרשים 4 מתאר את ההשפעה של הוספת מעכבי מונואמין NADPH DPI, וכתוצאה מכך החמצה מהירה, ואחריו תוספת של V-ATPase מעכב קונקה, אשר הופך את החמצה. ניסויים כאלה יכולים להיות קריטיים כדי להוכיח שבדיקות pH רגיש עובדות בתוך phagosomes כמו שצריך. בזמן קורס כיול טיפוסי מיוצג באיור 5, עם מלבנים המציינים את טווח ערכי יחס המשמשים לבניית עקומת הכיול. איור 5 בנוסף מראה כיצד לצבוע הכלרה באמצעות פעילות MPO יכול להשפיע על intraphagosomal pH-התגובה של FITC, המדגישה את העובדה כי בדיקות עשויות להגיב באופן שונה מהצפוי בתוך phagoso סביבת mal ואת החשיבות של כיול באתר.

איור 1
איור 1. מתאים confluency ויעד: יחס תא הפנל השמאלי מציג דוגמא בי confluency התא הוא דליל מדי והיעד:. יחס תא הוא נמוך מדי, הולכת ופוחתת ההסתברות שאירוע phagocytic יתרחש בשדה הראייה. הפנל באמצע מראה דוגמא בי confluency התא הוא גבוה מדי ותאים צפופים. בתנאים אלה, תאים לא יכולים להיות מספיק מקום לזוז ולמצוא המטרות שלהם, או עלול לזחול על כל ניתוח קבלת אחר יותר קשה בהמשך. הפנל הימני מראה confluency אידיאלי תא והיעד ראשוני: יחס תא, שבו תאים ויעדים רבים יכולים היו לראות, ובכל זאת עדיין להבחין בין כל עוד ברורה. FITC-zymosan מוצג בירוק וסרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר. "Target =" _ /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. phagosomes ההבחנה וzymosan uningested. הלוח השמאלי מציג תמונה בהירה שדה ממוזגת ויחס 490/440 FITC-zymosan, ואילו הפנל הימני מראה את התמונה הבהיר השדה לבד. Phagosomes (חיצים ירוקים קטנים) ניתן להבחין בין חלקיקים חיצוניים, כי אם לא ישתף למקם עם תאים (חץ אדום קצר) או הקרינה שאינו תואם עם מרכז כהה (חץ אדום ארוך) מוקפים בטבעת בהירה, אופייניים של phagosomes בתמונה הבהיר השדה (חיצים ירוקים). הברים בקנה מידה מייצגים 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אף אוזן גרון "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 "> איור 3
קורסי איור 3. זמן, היסטוגרמות pH ויחס ממוצעת של פרא-סוג וHvcn1 - / -. phagosomes נויטרופילים () קורסי זמן אופייניים של pH phagosomal מראה כי בעוד שבפרא-סוג נויטרופילים (כחול) pH הוא (קו מקווקו ניטראלי ) או בסיסי מעט (קו מוצק) בנקודתי זמן המוקדמות הבאים בליעה, phagosomes של Hvcn1 - / - הנויטרופילים (אדום) יכול גם alkalinize (קו מוצק) או להפוך לחומצה (קו מקווקו). (ב) ליקוט תמונות שצולמו 30-35 דקות לאחר התוספת של מטרות מאפשרת pH phagosomal האוכלוסייה הממוצע שיחושב ממספר גדול של phagosomes (wild-type: n = 5/1898/383 וHvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 ניסויים / phagosomes / תאים, ברים הם אמצעי ± SEM, NS לא משמעותיים). (ג) היסטוגרמות של FITC-zymosa n יחסים לחשוף הבדלים בpH phagosomal בין wild-type וHvcn1 - / - נויטרופילים. (נתון זה שונה מ[ 19], באישור.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. השפעות של מעכבי מונואמין NADPH DPI ו- V-ATPase מעכב קונקה על pH phagosomal. טרום דגירה 10 מיקרומטר בDPI הביא החמצה מהירה של phagosomes זמן קצר לאחר בליעה, שהתהפכה על ידי תוספת של 100 ננומטר קונקה (חץ). (נתון זה שונה מ[ 19], באישור.) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

FO: לשמור-together.within עמודים = "1"> איור 5
איור 5. pH כיול בזמן קורס ואת השפעות של עיכוב MPO על הכיול של FITC-zymosan. () עקום כיול pH אופייני intraphagosomal FITC-zymosan. תיבות אדומות מציינות את טווח ערכי יחס המשמשים לבניית עקומת הכיול. ערכי ה- pH בפועל של הפתרונות המשמשים וזמנים שבם הפתרונות משתנים מסומנים על ידי חצים. העקומה מייצגת את הממוצע של 10 phagosomes בתוך שדה יחיד של השקפה. (ב) עיכוב של MPO עם אזיד הנתרן מעכב שאינו ספציפי (5 מ"מ, MPO Inh) מגדיל את הטווח הדינמי של תגובות pH תלוי FITC-zymosan intraphagosomal. נקודות אמצעי ± SEM (נתון זה שונה מ[ 19], באישור.) אנא לחץ כאן לצפייה בlaגרסת rger של נתון זה.

1.1 Base (2x)
מאגרים מלאי סופי (1x) עבור 500 מיליליטר (2x)
KCl 1 M 140 מ"מ 140 מיליליטר
MgCl 2 1 M 1 מ"מ 1 מיליליטר
EGTA 1 M 0.2 מ"מ 0.2 מיליליטר
NaCl 1 M 20 מ"מ 20 מיליליטר
1.2 מאגרים מלאי בחינת בגרות(1x) מַטָרָה
MES 1 M 20 מ"מ לpH 5.5-6.5
HEPES 1 M 20 מ"מ לpH 7.0-7.5
טריס 1 M 20 מ"מ לpH 5.5-6.7
NMDG 1 M 20 מ"מ לpH 5.5-6.8
1.3 יונופורים במלאי (100% EtOH) סופי (1x)
Nigericin 5 מ"ג / מיליליטר 5 מיקרוגרם / מיליליטר
Monensin 50 מ"מ 5 מיקרומטר
1.4 50 מיליליטר
pH 2x בסיס סוג החיץ מאגר כרך. Nigericin Monensin
5.0 25 מיליליטר MES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
5.5 25 מיליליטר MES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
6.0 25 מיליליטר MES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
6.5 MES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
7.0 25 מיליליטר HEPES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
7.5 25 מיליליטר HEPES 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
8.0 25 מיליליטר טריס 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
8.5 25 מיליליטר טריס 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
9.0 25 מיליליטר טריס 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
9.5 25 מיליליטר NMDG 1 מיליליטר 50 μl 5 μl
התאם את ה- pH עםKOH או HCl

שולחן מתכון 1. להכנת פתרונות כיול. 1.1) מתכון להכנת 500 מיליליטר של פתרון בסיס 2x. 1.2) מתכון להכנת המאגרים השונים המשמשים על פי ה- pH של תמיסת הכיול. 1.3) מתכון להכנת יונופורים המשמשים בפתרונות הכיול. 1.4) מתכון להכנה 50 מיליליטר של כל פתרון כיול באמצעות הבסיס, המאגרים ויונופורים מתוארים ב1.1-1.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות זמן רב יותר מאשר שיטות חלופיות, כגון ספקטרוסקופיה וFACS, אשר מעסיקות אסטרטגיה דומה של שימוש בצבע רגיש pH מצמידים את המטרות אבל למדוד את ה- pH הממוצע של אוכלוסיית phagosomes, מיקרוסקופיה מציעה מספר יתרונות. הראשון הוא שפנימי וחיצוני קשורים, אבל לא הפנים, חלקיקים יכולים בקלות להיות מכובדים מבלי להוסיף כימיקלים אחרים, כגון כחול או נוגדני trypan, כדי להרוות או תווית חלקיקים חיצוניים, בהתאמה. שני הוא שלאחר התאים בזמן אמת מאפשר לחוקרים לבחון היבטים שונים של תהליך phagocytic בו זמנית וכן השפעות על הגירה, חישה וחלקיקים מחייבים עשויות להבחין בקלות כאן, ואילו זה יכול להתעלם בשיטות מבוססות אוכלוסייה. בנוסף, סנכרון של החניכה של phagocytosis, שבוצע לעתים קרובות על ידי תאי הצבה על 4 מעלות צלזיוס, שעלול להפריע אירועי סחר אחרים בשל הלם קר 40,41, איןלא הכרחי ככל שזמן אפס ניתן להבחין באופן ישיר. ואכן, בעת ביצוע מיקרוסקופיה חיות, טכניקת סנכרון 4 ° C זה לא מומלץ אם לכידת תקופות זמן קרובות לתחילתו של phagocytosis כעיבוי הנוצר על תחתית הצלחת במהלך משמרת הטמפרטורה יכול לערבב עם שמן טבילה האובייקטיבי ו הבדלי טמפרטורה בין מרכיבי מנה ומיקרוסקופ ההתחממות יכולים לגרום למשמרות מוקד. יתרון שלישי נובע מהעובדה שהם במהות phagosomes הטרוגנית על מספר פרמטרים הכוללים, אך לא רק, pH 42, והשפעות מסוימות על pH phagosome יכולות להיות עדינות יותר, לשנות את חלוקת pH phagosomal ולא באוכלוסייה הממוצעת, כ היה מוצג באיור 3. תצפיות אלה עשויות לתת תובנות מכניסטית עמוק יותר לתוך הרגולציה של ה- pH phagosomal.

במחקר הנוכחי, FITC נבחר כצבע רגיש pH של בחירה כי זהזול, זמין באופן נרחב, וחשוב מכך יש pKa של 6.5 עם טווח דינמי הכולל pH 3 עד 9 בצורתו החופשית 37, שתאמה את טווח pH הצפוי במקור של ניטראלי למעט בסיסי, על פי מחקרים קודמים 29,30. לאחרונה מחקר המעסיק בדיקה שונה pH נקראת SNARF, שבו יש pKa בסיסי יותר של 7.5, ערכי ה- pH מוערכים באופן בלתי צפוי, החל 1-2 יחידות pH בסיסיים יותר עבור שניהם הפראי-הסוג וHvcn1 - phagosomes נויטרופילים 39 - /. לפיכך, הבחירה של חיישן pH הוא פרמטר חשוב לשקול בהתאם ליישום. באופן עקרוני, ניתן להתאים את השיטה שהוצגה כאן בקלות להעסיק צבעי pH רגיש אחרים, כגון SNARF ו -2 ", 7'-ביסה (2-carboxyethyl) -5- (ו- 6) -carboxyfluorescein (BCECF), נגזרי succinimidyl-אסתר שהם מצמידים בקלות לאמינה המכילים חלקיקים, כגון zymosan. ואכן, חיישנים לא צריכים להיות מוגבלים לצבעי ניאון, כratiometחלבוני pH ריק רגישים, כגון SypHer 43, יכול להיות transduced והביע על ידי מיקרואורגניזמים. כמה חלופות שאינן ratiometric גם קיימות, בעיקר בגרסה האדומה של הצבע pHrodo, אשר עשוי לשמש בשילוב עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged חלבונים או חלבון pH רגיש pHluorin. עם זאת, בגלל תופעות שעלולים להיות גדולות שסביבת intraphagosomal הקשה יכולה להיות על צבעים וחלבונים הממוקדים בה, בדיקות אלה צריכים להיות במינימום בשילוב עם בדיקות רגישות pH להיות מועסקות בנובע פסאודו-יחס. כפי שהודגם באיור 5, ניסויי כיולים יכולים לחשוף את ההשפעות של נזק צבע כטווח דינמי מופחת או מעוותים. בנימה מעשית, ניסויי כיול לא תמיד מושלמים ועשויים להיות ישים לבצע לאחר כל ניסוי. כתוצאה מכך, ערכי יחס ייתכן שמדי פעם נופלים מחוץ לטווח של הכיול ולהניב ערכים בלתי אפשריים בעת ההמרה ל- pH. זה יכול להיות approprמאחר לאו להביע ערכים מחוץ לקנה מידה אלה "גדולים יותר / פחות או שווים ל" מרביים וערכי pH כיול מינימליים, או להביע את כל הערכים כיחסים וpH הערכת הטווחים שהיחסים ממוצע מייצגים.

כמודגש על ידי DPI וקונקה שולטת, ייצור ROS ופעילות V-ATPase הם גורמים עיקריים הקובעים pH phagosomal. ואכן, במצבים רבים, שינויים ברמות של ייצור ROS עשויים בבסיס הבדלים בpH phagosomal, במיוחד בנויטרופילים, ומדידה של ייצור ROS phagosomal וpH לעתים קרובות הולכים יד ביד. מילה אחת של זהירות היא ששני התרופות להשאיל תובנה הפעילות של האנזימים שהם מעכבים אך לא למיקום שלהם בתוך התא. שני האנזימים מתחמים רב למקטע שפרט רכיבים חייבת תנועה לphagosomes 4, וחוסר הפעילות בphagosomes עלולה לגרום לפגמים בסחר או הרכבה במקום השפעות ישירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymosan A powder Sigma-Aldrich Z4250 Various providers exist
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) Life Technologies Z2850 Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) Santa Cruz sc-204107 Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA) Sigma-Aldrich 27689 Toxic, use gloves, various providers exist
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Monensin Enzo ALX-380-026-G001 Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14200-075 Toxic, use gloves, various providers exist
Hank's balance salt solution Life Technologies 14025092 Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795 Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671  Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG) Sigma-Aldrich M2004  Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich 3777 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) World Precision Instruments FD35-100 Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bath O. Kleiner AG A sonicator may be used instead, various instrument providers exist
Heamocytometer Marienfeld GmbH Various instrument providers exist
Widefield live imaging microscope Carl Zeiss AG Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.  
Peristaltic pump (Dynamax RP-1) Rainin Various instrument providers exist
pH meter Schott Gerate GmbH Various instrument providers exist
Manual Counter Milian SA Various instrument providers exist

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 106 phagocytosis החמצה חומציות pH הדמיה ratiometric הדמיה תפקודית מיקרוסקופ פלואורסצנטי נויטרופילים חסינות מולדת מיני חמצן מגיבים
מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N.… More

Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (106), e53402, doi:10.3791/53402 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter