Abstract
Фагоцитоз является фундаментальным процессом, через который врожденные иммунные клетки поглощают бактерии, апоптоза клеток или других инородных частиц для того, чтобы убивать или нейтрализовать проглоченного материала, или представить его в качестве антигенов и инициировать адаптивные иммунные реакции. РН фагосом является критическим параметром регулирования деление или слияние с endomembranes и активации протеолитических ферментов событий, которые позволяют фагоцитарная вакуоль, чтобы созреть в деструкции органелл. Кроме того, перемещение Н + необходим для производства высоких уровней активных форм кислорода (ROS), которые необходимы для эффективного уничтожения и сигнализации на другие ткани хозяина. Многие внутриклеточных возбудителей подорвать фагоцитарную убийство путем ограничения подкисление phagosomal, подчеркнув важность рН в фагосом биологии. Здесь мы опишем логометрического метод для измерения рН в phagosomal нейтрофилов с использованием флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) меченных зимозаном в фагоцитарной ТаргETS, и изображения живых клеток. Анализ основан на флуоресценции FITC свойств, который гасили кислом рН при возбуждении при 490 нм, но не при возбуждении при 440 нм, что позволяет количественно определить соотношение рН-зависимой, а не абсолютной флуоресценции, из одного красителя. Подробный протокол выполнения калибровки красителя месте и конверсии в соотношении реальных значений рН также предоставляется. Одноместный красителях логометрических методы, как правило, считается выше одной длины волны или двойной красителя псевдо-пропорциональный протоколов, так как они менее чувствительны к возмущениям, таких как отбеливание, изменение фокуса, лазерные изменения и неравномерное маркировку, которые искажают измеряемый сигнал. Этот метод может быть легко модифицирован для измерения рН в других фагоцитирующих клеточных типов, и зимозан можно заменить любым другим амина, содержащего частицы, из инертных бисера для живых микроорганизмов. Наконец, этот метод может быть адаптирован, чтобы сделать использование других флуоресцентных зондов, чувствительных к различным диапазонам рН или другой phagosomДеятельность аль, что делает его обобщенное протокол для функциональной визуализации в фагосом.
Protocol
О себе этика: Все манипуляции животных проводились в строгом соответствии с руководящими принципами Исследовательского комитета животных из Университета Женевы.
1. Подготовка фагоцитарной Цели
- Добавьте 20 мг сухого зимозаном 10 мл стерильной фосфатно-солевой буфер (PBS). Вихревые и тепло в водяной бане кипения в течение 10 мин. Прохладный и центрифуге при 2000 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант, ресуспендируют в 1 мл PBS и гомогенат в течение 10 мин на водяной бане ультразвуком. Перевести 500 мкл до двух 1,5 мл пробирки. Центрифуга при 11000 мкг в течение 5 мин.
- Повторите мыть с 500 мкл PBS. Вареные зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
- Промыть зимозаном дважды в 500 мкл свежеприготовленного 0,1 М Na 2 CO 3, рН 9,3, как описано выше (этап 1.2).
- Ресуспендируют в 490 мкл После последней промывки. Добавить 10 мкл 10 мг / мл FITC, растворенного в диметилсульфоксиде sulfoxidе (ДМСО), вихревые, накрыть фольгой и инкубируют при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре.
- Для удаления несвязанного красителя, мыть, как описано выше (шаг 1.2), сначала с 0,5 мл ДМСО + 150 мкл PBS, затем 0,5 мл ДМСО + 300 мкл PBS, а затем 0,5 мл ДМСО + 450 мкл PBS, а затем PBS в одиночку.
- Граф зимозаном использованием гемоцитометра. Добавить 1 мкл зимозаном 500 мкл PBS, вихря, затем добавить 10 мкл на краю гемоцитометра камеру, где он встречает покровное находиться над центральной сетки. Установите гемоцитометра на ярко-поля микроскопа, снабженного целью 20X.
- Сосредоточьтесь на верхней левом углу, содержащей 16 квадратов и рассчитывать все зимозаном частиц в этой области, используя руки Tally счетчик. Повторите с правом нижнем углу. Рассчитывают концентрацию зимозаном используя следующее уравнение: зимозан концентрации = Count / 2 х 500 х 10 4 зимозаном / мл. Маркированный зимозан может быть аликвоты, замораживали и хранили при -20 ° С.
- Opsonize меченого зимозаном Wiго кролика против зимозаном антитело при разведении 1: 100. Вихревые и инкубировать в течение 1 часа в водяной бане при 37 °. Промыть 500 мкл PBS, как описано выше (этап 1.2).
Примечание: Озвучивание настоятельно рекомендуется, особенно после опсонизации, а зимозан имеет тенденцию к образованию комков, которые могут сделать анализ более трудным позже. Опсонизация с 65% об / об крысы или человеческой сыворотки могут быть использованы в качестве альтернативы. - Граф зимозаном помощью гемоцитометра, как описано в шагах 1,7-1,8, и разбавить до 100 х 10 6 частиц / мл. Опсонизация с другими фагоцитирующих стимуляторов, таких как дополнение или нет опсонизация, может быть альтернативно выполнено.
2. Live Video микроскопия
- Изолировать первичных нейтрофилы мыши, как описано подробно в другом месте 38.
- В качестве альтернативы, можно использовать любой тип клеток фагоцитарной. Хранить нейтрофилов на льду в Roswell Park Memorial института (RPMI 1640) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (об / об), 200 Е пенициллина / streptomyciN, при концентрации 10 х 10 6 клеток / мл до готовности к использованию. Другие типы клеток могут быть посеяны 1-4 дней раньше.
- Добавить 2 х 10 5 (20 мкл) нейтрофилов к центру 35 мм со стеклянным дном тарелки, распространение капельным путем добавления 50 мкл среды и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин, чтобы позволить клетки придерживаться.
- Добавить 1 мл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) нагревают до 37 ° С, содержащей специфический ингибитор MPO 4-аминобензойной гидразида (4-ABH, 10 мкМ). Неспецифические ингибиторы MPO, такие как азид натрия (5 мм), также могут быть использованы, но были недавно предложили оказывать дополнительные неспецифические эффекты на рН 39.
- Установите блюдо на флуоресценции Widefield микроскопа, снабженного 37 ° С системы отопления и нефти целью 40X. Инкубируйте клетки без изображения в течение 10 мин, чтобы позволить клетки и оборудование для уравновешивания.
- Настройте параметры микроскопа приобрести имидж передачи ярко-поле [PHAсебе или дифференциального интерференционного контраста (ДИК), если имеется] с 440 нм или 490 нм возбуждения и 535 нм излучения каждые 30 сек.
- Отрегулируйте время экспозиции и частоты сбора в соответствии с микроскопа системы, чтобы избежать слишком много фотообесцвечивание и фототоксичность и в зависимости от экспериментальных задаваемых вопросов. Начните получения изображения.
- Через 2 мин, добавить 10 х 10 6 (50 мкл) опсонизированным зимозаном FITC-к центру блюда. Регулировка целевой: коэффициенты клеток в зависимости от типа фагоцитов и цели используется.
- Продолжить изображений в течение 30 мин. Через 30 мин остановить приобретение покадровой и запустить таймер. Перемещение на сцену и захватить 10 или более снимков в различных областях в целях изображения других фагосом, все в пределах 5 мин.
3. Калибровка и контрольные эксперименты
- Подготовка к калибровке рН решения (рецепты описаны в таблице 1) до дня эксперимента и заморозить в 10 мл аликвоты.Растаяйте калибровочных растворов и теплой до 37 ° С на водяной бане. Проверяют рН с помощью рН-метра и записывать фактическую рН растворов.
- Установите перистальтического насоса на дно стакана блюдо до получения изображения и выполнять живого видео микроскопии, как описано выше (раздел 2).
- В конце периода сбора 30 мин повернуть насос на удалить решение в чашке, добавить 1 мл первого раствора калибровки и останавливает насос.
- Подождите, пока сигнал не стабилизируется, как правило, 5 мин. Повторите с каждой калибровочного раствора.
- Выполнение по крайней мере, один калибровочный за день эксперимента, и калибровки, начиная с самой высокой рН и работает последовательно с самым низким, а также начиная с самой низкой рН и последовательно работает в направлении самой высокой.
- В качестве контроля, добавляют 100 мкл 100 мкМ йодида ингибитор НАДФН-оксидазы дифенил propionium (ДОИ) разводят в HBSS в клетки в 900 мкл HBSS в стеклянным дном блюда, иинкубировать в течение 10 мин.
- Начните приобретение и добавить зимозаном, как описано выше (шаг 2.7). Через 15 мин фагоцитоза, добавить 10 мкл 10 мкМ V-АТФазы ингибитора concanamycin A (CONCA), разбавленный в HBSS и продолжают визуализации в течение дополнительных 15 мин.
4. Анализ
- Анализ покадровой фильмов и фагосомы снимков.
Примечание: Следующие инструкции являются специфическими для ImageJ. Шаг за шагом инструкции могут широко варьироваться в зависимости от используемого программного обеспечения, но функции, описанные в этом разделе, доступны в большинстве профессиональных программ для анализа изображений.- Откройте изображение с профессиональным программным обеспечением для анализа изображений. Вычтите фон в 490 канала, рисуя небольшую квадратную ROI с квадратной инструмент выбора многоугольника в области, где нет никаких клеток и нажав Плагины> BG вычитание из ROI. Тогда загрузите же ROI на 440 канала, нажав кнопку Изменить> Выбор> Восстановить выделенные и повторите.
- Сделайте соотношение 32-битное изображение в 490 канала, деленная на 440 канала, нажав процесса> Image Calculator ..., выбрав соответствующие изображения в раскрывающихся меню Image1 и image2, выбрав 'Divide' в раскрывающемся меню Операция и проверки результатов флажок 32-бит (с плавающей точкой).
- Изменение справочной таблицы цвета кодирования в колоризации отношение-совместимый, нажав на изображение> таблицы поиска> Радуга RGB. Порог отношение изображения по ликвидации 0 и бесконечность пикселей, нажав изображение> Adjust> Threshold .... Отрегулируйте полосы прокрутки, так что зимозан отображается красным цветом и нажмите кнопку Применить, убедившись, что набор фоновых пикселей флажок NaN в выборе.
- Добавьте к этому отношение стек с каналом ярко-поля в многоканальной композита, нажав изображение> Цвет> Объединить каналы, и выбора изображения ярко-поля в меню серым выпадающего канала и отношение изображения в выпадающем меню зеленый коридор, и выбравДержите исходные изображения флажок. Сканирование покадровой фильмы или снимки, чтобы определить, который фагосомы которые должны быть проанализированы. Канал ярко-поле полезно для этого.
- Нарисуйте регионы процентной (ROI), используя овальную полигон инструмент выбора вокруг фагосом, и добавить их к менеджеру ROI, нажав Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI> Добавить. Измерьте их отношение зимозаном интенсивности, нажав Дополнительно> Multi-Мера и де-выбору одной строке на срез флажке.
- Для покадровой фильмы, трек Фагосомы по одному, опираясь окупаемости инвестиций, набрав Ctrl + M, чтобы измерить каждый момент времени, и перемещение ROI, когда необходимо отслеживать значения интенсивности в течение долгого времени. Скопируйте измерения в окне результатов в программное обеспечение электронной таблицы.
Примечание: Анализ 15 (5 времени курсов в эксперименте х 3) независимых экспериментов является идеальным, но более или менее может потребоваться в зависимости от изменчивости наблюдается. Сохранение трансформирования всегда рекомендуется. Некоторые программные пакеты позволяют изображения RegiStration и динамическое обновление трансформирования, облегчая эту часть анализа.
- Переход от флуоресценции в значениях рН
- Измерьте соотношение 490/440 для фагосом в калибровочных покадровой фильмов, как описано в разделе 4.1.
- В таблице, участок значения соотношения с течением времени, и вычислить средние значения соотношении от всех фагосомах в поле зрения (обычно, 5-20) от 5 временных точках в пределах середине периода времени, соответствующего каждой калибровки рН решение. (Смотрите также красные коробки на рисунке 5а.)
- Участок эти средние значения 490/440 соотношение против фактического измеряемого рН. Комбинат по крайней мере 3 независимых калибровки в одном графике. Используйте статистическую или числовое пакет программного обеспечения для выполнения нелинейной регрессии (лучше подходит кривая), как правило, сигмоидальной уравнения.
Примечание: Например, на рисунке 5В уравнение использовали сигмоидальной Больцмана [Y = Низ + ((верх-низ)/ (1 + EXP ((V50-Х) / Наклон))], где значения Y являются 490/440 отношения, Х являются значения рН и сверху, снизу, V50 и наклон параметры, рассчитанные с помощью программного обеспечения. - Используйте полученное уравнение для преобразования значения соотношения рН.
Примечание: Например, на фиг.5В уравнение получено для калибровочной кривой в присутствии азида натри 490/440 Коэффициент = 1,103 + [(2.89-1.103) / (1 + EXP ((6,993-рН) /0.9291)] . Решение для рН дает следующее уравнение: рН = 6,993 - 0,9291 * [Ln ((1,178 / (Коэффициент-1,103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ниже приведены представительные результаты эксперимента, где phagosomal рН первичных нейтрофилов мыши, выделенных из костного мозга дикого типа или Hvcn1 - / - мышей по сравнению. Для успешного эксперимента, важно, чтобы получить достаточное количество Фагосомы в поле зрения в течение всего срока действия покадровой фильма, избегая слишком много Фагосомы, которые впоследствии будут более трудно сегмента во время анализа изображений. Рисунок 1 показывает примеры хороших и плохих. confluencies Для зависящих от времени и снимок анализирует внешние частицы зимозаном следует отличать от фагосом и исключены из анализа. Рисунок 2 иллюстрирует, как образ ярко-поле может быть полезно, чтобы помочь отличить внешние частицы зимозаном от фагосом. Рисунок 3 показывает примеры типичных фагосомы рН временные курсы дикого типа по сравнению с Hvcn1 - / - Рисунок 4 иллюстрирует влияние добавления НАДФН-оксидазы ингибитор DPI, что приводит к быстрому подкисления, с последующим добавлением в V-АТФ-азы ингибитора Конка, который компенсирует подкисление. Такие эксперименты могут иметь решающее значение, чтобы доказать, что рН-чувствительные датчики работают в фагосом, как они должны. Типичный калибровки времени Конечно представлена на фигуре 5, с прямоугольниками, указывающими диапазон значений соотношение, используемое для создания калибровочной кривой. Фиг.5 дополнительно показано, как краситель хлорирование через MPO активности может влиять на intraphagosomal рН реакцию FITC, выделив тот факт, что зонды могут реагировать иначе, чем ожидалось в phagoso ТЗА окружающей среды и важность калибровки месте.
Рисунок 1. Подходит конфлюентности и цель: соотношение клеток Левая панель показывает пример, в котором клетки конфлюентности слишком редкие и цель:. Соотношение клеток является слишком низкой, уменьшая вероятность того, что фагоцитарная событие произойдет в поле зрения. В средней части показан пример, где клетки конфлюентности слишком высокой и клетки переполнены. В этих условиях, клетки могут не иметь достаточно места, чтобы двигаться и найти свои цели, или может ползать по каждому другой анализа решений более трудным позже. На правой панели показывает идеальную слияния клеток и первоначальный цель: соотношение клеток, где многие клетки и цели могут уже видели и еще до сих пор четко отличаются друг от другой. FITC-зимозан показано на зеленый и масштаб бар представляет 10 мкм. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Отличительные фагосомы и uningested зимозан. Левая панель показывает объединенный ярко-поля файл и 490/440 FITC-зимозаном соотношение, в то время как правая панель показывает изображение ярко-поле в одиночку. Фагосомы (небольшие зеленые стрелки) можно отличить от внешних частиц, которые либо не ко-локализуются с клетками (короткая красная стрелка) или чьи флуоресценции не совпадать с темным центром (долго красная стрелка) в окружении яркого кольца, характерных из фагосом в ярко-поля изображения (зеленые стрелки). Масштабные бары представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Время курсы, среднее значение рН и соотношение гистограммы дикого типа и Hvcn1 - / -. Нейтрофилов фагосом (A) Типичные курсы временные phagosomal рН показывает, что в то время как в дикого типа нейтрофилы (синий) рН нейтрален (пунктирная линия ) или слегка щелочной (сплошная линия) во время ранних временных точках после приема, то фагосомы из Hvcn1 - / - нейтрофилы (красные) могут либо подщелачивать (сплошная линия) или подкисления (пунктирная линия). (Б) Составление снимков, сделанных 30-35 мин после добавления целей позволяет в среднем phagosomal населения рН должны быть рассчитаны с большим количеством фагосомах (дикого типа: N = 5/1898/383 и Hvcn1 - / - N = 6 / 1433/451 / эксперименты фагосомы / клетки, бары средством ± SEM, нс, не существенно). (С) Гистограммы FITC-zymosaп коэффициенты показывают разницу в phagosomal рН между дикого типа и Hvcn1 - / - нейтрофилов. (Эта цифра была изменена с [19], с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Влияние ингибитора НАДФН-оксидазы DPI и V-АТФазы ингибитора CONCA на phagosomal рН. Прединкубационная в 10 мкМ DPI привело к быстрому подкисления фагосомах вскоре после приема пищи, которое было отменено добавлением 100 нМ CONCA (стрелка). (Эта цифра была изменена с [19], с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. рН калибровки времени курс и эффекты MPO торможения на калибровки FITC-зимозаном. (А) Типичный калибровки рН кривая intraphagosomal FITC-зимозан. Красные прямоугольники обозначают диапазон значений отношения, используемых для построения калибровочной кривой. Фактические значения рН растворов, используемых и времени их решения параметры указаны стрелками. Кривая представляет собой среднее из 10 фагосом в пределах одного поля зрения. (В) Ингибирование МПО с неспецифическим ингибитором азида натрия (5 мМ, МПО инг) увеличивает динамический диапазон intraphagosomal FITC-зимозаном рН-зависимой реакции. Очки средства ± SEM (Эта цифра была изменена с [19], с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть лаrger версия этой фигуры.
| 1.1 | (2x) База | |||||
| Буферы | Акции | Финал (1x) | Для 500 мл (2x) | |||
| KCl | 1 М | 140 мм | 140 мл | |||
| MgCl 2 | 1 М | 1 мм | 1 мл | |||
| ЭГТА | 1 М | 0,2 мм | 0,2 мл | |||
| NaCl | 1 М | 20 мм | 20 мл | |||
| 1.2 | Буферы | Акции | Окончательный(1x) | Цель | ||
| МОН | 1 М | 20 мм | для рН 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 М | 20 мм | для рН 7,0-7,5 | |||
| Трис | 1 М | 20 мм | для рН 5.5-6.7 | |||
| NMDG | 1 М | 20 мм | для рН 5.5-6.8 | |||
| 1.3 | Ионофоры | Сток (100% этанола) | Финал (1x) | |||
| Нигерицина | 5 мг / мл | 5 мкг / мл | ||||
| Монензин | 50 мм | 5 мкМ | ||||
| 1.4 | Для 50 мл | |||||
| pH | 2x База | Буфер Тип | Буфер т. | Нигерицина | Монензин | |
| 5.0 | 25 мл | МОН | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 5.5 | 25 мл | МОН | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 6.0 | 25 мл | МОН | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 6.5 | МОН | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | ||
| 7.0 | 25 мл | HEPES | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 7.5 | 25 мл | HEPES | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 8.0 | 25 мл | Трис | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 8.5 | 25 мл | Трис | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 9.0 | 25 мл | Трис | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| 9.5 | 25 мл | NMDG | 1 мл | 50 мкл | 5 мкл | |
| Отрегулируйте рН сКОН или HCl | ||||||
Таблица 1. Рецепт приготовления калибровочных растворов. 1,1) Рецепт для приготовления 500 мл 2 раза раствором основания. 1,2) Рецепт для приготовления различных буферов, используемых в соответствии с рН калибровочного раствора. 1,3) Рецепт для приготовления ионофоры, используемые в калибровочных растворов. 1,4) Рецепт для приготовления 50 мл каждого калибровочного раствора с помощью основания, буферы и ионофоры, описанные в 1.1-1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя больше времени, чем альтернативных методов, таких, как спектроскопии и FACS, которые используют подобную стратегию использования конфиденциальной рН красителя в сочетании с целями, но измеряют среднее значение рН населением фагосом, микроскопия имеет ряд преимуществ. Первое, что внутренняя и внешняя связаны, но не усвоены, частицы могут быть легко отличить без добавления других химических веществ, таких, как трипанового синего или антител, чтобы утолить или обозначить внешние частицы, соответственно. Во-вторых, что после клетки в режиме реального времени позволяет исследователям наблюдать несколько аспектов процесса фагоцитоза одновременного и так воздействие на миграции, зондирования и связывающих частиц может быть легко различить здесь, в то время как это может быть пропущено с методами, основанными населения. Кроме того, синхронизация начала фагоцитоза, часто осуществляется путем размещения клеток при 4 ° С, которая может возмущать других мероприятий в связи с оборотом холодового шока 40,41, нетт необходимо, как нулевой момент времени можно выделить непосредственно. Действительно, при выполнении живой микроскопии, этот метод С синхронизации 4 ° не рекомендуется, если захват периоды времени, близкие к инициации фагоцитоза как конденсации, которая образуется на дне чашки за смену температуры может смешиваться с объективной иммерсионного масла и температурные различия между потепление блюдо и микроскопов компонентов может привести к фокус сдвиги. Третье преимущество вытекает из того факта, что фагосомы неразрывно гетерогенной от нескольких параметров, включая, но не ограничиваясь этим, рН 42, и некоторые эффекты на фагосом рН может быть более тонким, изменяя распределение phagosomal рН, а не средней численности населения, а Показано на рисунке 3. Такие наблюдения могут дать более глубокое понимание механистических регулирования phagosomal рН.
В настоящем исследовании, FITC был выбран в качестве рН-чувствительного красителя выбора, потому что этонедорогой, широко доступны, и, что важно имеет рКа 6,5 с динамическим диапазоном, охватывающий рН от 3 до 9 в свободной форме 37 и находился на первоначально предполагалось диапазоне рН от нейтрального до слабо щелочной, в зависимости от предыдущих исследований 29,30. Совсем недавно исследование с использованием другого зонда рН названием перехватить, которая имеет более основной рКа 7,5, неожиданно оценочные значения рН в пределах 1-2 единиц рН более щелочной, как для дикого типа и Hvcn1 - / - нейтрофилов Фагосомы 39. Таким образом, выбор датчика рН является важным параметром, чтобы рассмотреть в зависимости от применения. В принципе, способ, представленный здесь могут быть легко адаптированы использовать другие рН-чувствительные красители, такие как Snarf и 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и-6) -carboxyfluorescein (BCECF), , производные сложных эфиров сукцинимидил-легко соединена с амином, содержащий частицы, такие как зимозаном. Действительно, датчики не должны быть ограничены флуоресцентных красителей, а ratiometRIC рН чувствительные белки, такие SypHer 43, может быть трансдуцированные и выраженные микроорганизмов. Несколько без логометрических альтернативы существуют, в частности, красный вариант красителя pHrodo, которые могут быть использованы в сочетании с зеленого флуоресцентного белка (GFP) -tagged белки или рН-чувствительных белок pHluorin. Тем не менее, из-за потенциально высоких эффектов, что жесткая intraphagosomal среда может оказать на красителей и белков целевых нем, эти зонды должны быть, как минимум, в сочетании с рН нечувствительных зондов для быть использованы при получении псевдо-соотношение. Как проиллюстрировано на фиг.5, калибровки эксперименты могут подвергнуть воздействие ущерба красителя в виде уменьшенной искажено или динамического диапазона. На практическом отметить, калибровочных экспериментов не всегда совершенны и могут быть неосуществимо выполнить после каждого эксперимента. Следовательно, значения отношения могут иногда выпасть из диапазона калибровки и дают невозможные значения при преобразовании к рН. Это может быть approprИАТЭ либо выразить эти зашкаливать значения, как "больше / меньше, чем или равно" максимальные и минимальные значения рН калибровки, или, чтобы выразить все значения как отношения и оценивайте рН колеблется, что средние показатели представляют.
Как подчеркнул DPI и Конка контролирует АФК производство и V-АТФазы являются основными факторами, которые определяют phagosomal рН. Действительно, во многих ситуациях, изменения в уровне продукции АФК может лежать в основе различий в phagosomal рН, особенно нейтрофилов и измерение phagosomal продукции АФК и рН часто идут рука об руку. Одно слово предостережения, что оба препарата кредитовать понимание активности ферментов они ингибируют, но не от их расположения в клетке. Оба ферменты нескольких субъединиц комплексов, индивидуальные компоненты должны трафик фагосом 4, и их отсутствие активности на фагосом может привести от торговли людьми или дефектов сборки, а не прямых эффектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
