Abstract
Phagozytose ist ein grundlegender Prozess, durch den angeborenen Immunzellen zu verschlingen Bakterien, apoptotischen Zellen oder andere Fremdkörper, um zu töten oder zu neutralisieren, die verschluckt Material oder um sie als Antigene zu präsentieren und zu initiieren adaptiven Immunantwort. Der pH der Phagosomen ist ein kritischer Parameter zur Regelung Spaltung oder Fusion mit Endomembranen und Aktivierung der proteolytischen Enzyme, Ereignisse, die phagozytischen Vakuolen in eine abbau Organell ausreifen. Zusätzlich wird die Translokation von H + zur Herstellung hoher Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für eine effiziente Töten und Signalisierung zu anderen Wirtsgeweben erforderlich. Viele intrazelluläre Pathogene zu untergraben phagocytic Tötung durch Begrenzung phagosomalen Versauerung, der die Bedeutung der pH-Wert im Phagosom Biologie. Hier beschreiben wir eine ratiometrische Verfahren zur Messung phagosomalen pH in Neutrophilen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem Zymosan als phagozytischen targets, und Live-Cell-Imaging. Der Test basiert auf der Fluoreszenzeigenschaften von FITC, die durch saure pH abgeschreckt wird, wenn bei 490 nm angeregt wird, aber nicht, wenn sie bei 440 nm angeregt wird, so dass die Quantifizierung von einer pH-abhängigen Verhältnis statt der absoluten Fluoreszenz eines einzelnen Farbstoffs. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer in situ-Farbstoff Kalibrierung und Umwandlung des Verhältnisses realen pH-Werten ist ebenfalls vorgesehen. Single-Farbstoff ratiometrische Verfahren werden im Allgemeinen als überlegen einzigen Wellenlänge oder Dual-Farbstoff pseudo-ratiometrische Protokolle, da sie weniger empfindlich auf Störungen, wie beispielsweise Bleich sind, konzentrieren sich ändert, Laser-Variationen und unebene Kennzeichnung, die das Messsignal verfälschen. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um in anderen pH phagozytischen Zelltypen zu messen und Zymosan durch jede andere aminhaltige Teilchen ersetzt werden, von inerten Kügelchen zu lebenden Mikroorganismen. Schließlich kann dieses Verfahren angepaßt werden, um die Verwendung von anderen fluoreszierenden Sonden empfindlich auf unterschiedliche pH-Bereiche oder andere phagosom machenal-Aktivitäten, so dass es eine allgemeine Protokoll für die funktionelle Bildgebung des Phagosomen.
Protocol
Ethik Hinweise: Alle Tier Manipulationen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierforschungsausschuss der Universität Genf durchgeführt.
1. Herstellung von Phagozytische Ziele
- Werden 20 mg getrocknetes Zymosan bis 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Wirbel und in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Kühl und Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand resuspendieren in 1 ml PBS und beschallen für 10 Minuten in einem Wasserbad Ultraschallgerät. Übertragen Sie 500 ul zu zwei 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 500 ul PBS. Die gekochten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert.
- Zweimal waschen Zymosan in 500 ul frisch hergestellte 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3, wie oben beschrieben (Schritt 1.2).
- Resuspendieren in 490 & mgr; l nach dem letzten Waschen. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml FITC in Dimethylsulfoxid gelöst sulfoxide (DMSO), Wirbel, mit Folie abdecken, und Inkubation unter Rühren 4 Stunden bei RT.
- Um ungebundene Farbe zu entfernen, wie oben (Schritt 1.2) waschen, zuerst mit 0,5 ml DMSO + 150 & mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 300 & mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 450 & mgr; l PBS, dann PBS alleine.
- Graf Zymosan mit einem Hämocytometer. 1 ul Zymosan zu 500 ul PBS, Wirbel, dann werden 10 & mgr; l an den Rand des Hämocytometer Kammer, wo es das Deckglas über das zentrale Netz platziert erfüllt. Montieren Sie das Hämocytometer auf einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv ausgestattet.
- Konzentrieren Sie sich auf der oberen linken Ecke, die 16 Plätze und zählt alle Zymosan Partikel in diesem Bereich mit einem Handtallykostenzähler. Wiederholen Sie mit der rechten unteren Ecke. Berechnen die Zymosan-Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung: Zymosan Konzentration = Count / 2 x 500 x 10 4 Zymosan / ml. Markierten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert.
- Opsonisieren das markierte Zymosan with ein Kaninchen-Anti-Zymosan Antikörper bei 1: 100 Verdünnung. Vortex und Inkubation für 1 Stunde in einem 37 ° C Wasserbad. Mit 500 & mgr; l PBS waschen, wie oben beschrieben (Schritt 1.2).
Hinweis: Die Beschallung ist sehr zu empfehlen, vor allem nach Opsonisierung, wie Zymosan neigt dazu, Klumpen, die später auf der Analyse erschweren kann bilden. Opsonisierung mit 65% v / v Ratten- oder Humanserum kann als Alternative verwendet werden. - Zählen Zymosan mit einem Hämocytometer wie in den Schritten 1.7-1.8 beschrieben, und mit Wasser auf 100 x 10 & sup6; Teilchen / ml. Opsonisierung mit anderen phagozytischen Stimulatoren wie Komplement oder keinen Opsonierung kann alternativ durchgeführt werden.
2. Live Video-Mikroskopie
- Isolieren primäre Maus Neutrophilen, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben 38.
- Alternativ können Sie jede phagozytischen Zelltyp. Halten Neutrophilen auf Eis in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5% fötalem Kälberserum (v / v), 200 U Penicillin / streptomyci ergänztn, in einer Konzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml bis zur Verwendung. Andere Zelltypen kann 1-4 Tage vor ausgesät werden.
- In 2 × 10 5 (20 ul) von Neutrophilen an der Mitte einer 35 mm Glasbodenschale, verbreiten sie den Tropfen durch Zugabe von 50 ul Medium und bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Zellen zu haften.
- 1 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) bis 37 ° C, die die spezielle MPO-Inhibitor 4-Amino-hydrazid (4-ABH, 10 & mgr; M) erwärmt. Unspezifische MPO-Inhibitoren, wie Natriumazid (5 mM), können ebenfalls verwendet werden, jedoch wurden kürzlich vorgeschlagen, um zusätzliche nicht-spezifischen Effekte auf pH 39 auszuüben.
- Montieren Sie den Teller auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem 37 ° C Heizungsanlage und einem 40X Öl-Objektiv ausgestattet. Inkubieren Zellen ohne Bildgebung für 10 Minuten, damit Zellen und Anlagen ins Gleichgewicht.
- Passen Sie die Mikroskopeinstellungen, um eine TEM-Hellfeldbild zu erwerben [phase oder Differentialinterferenzkontrast (DIC), falls verfügbar] mit 440 nm oder 490 nm Anregungs- und 535 nm Emissions alle 30 sec.
- Die Belichtungszeit und die Erfassungsfrequenz entsprechend dem Mikroskopsystem zu viel Photobleichen und Phototoxizität und in Abhängigkeit von den experimentellen Fragen gestellt vermeiden. Start der Bildaufnahme.
- Nach 2 min, fügen Sie 10 x 10 6 (50 ul) opsonisiertes FITC-Zymosan in die Mitte der Schale. Einstellen target: Zellverhältnissen in Abhängigkeit von der Art von Phagozyten und Ziel verwendet.
- Weiterhin Bildgebung für 30 min. Nach 30 Minuten beenden Sie den Zeitraffer-Akquisition und starten Sie einen Timer. Bewegen Sie die Bühne und erfassen 10 oder mehr Snapshots in unterschiedlichen Sicht für Bild in anderen Phagosomen, alle innerhalb von 5 min.
3. Kalibrierung und Kontrollexperimente
- Vorbereitung der pH Kalibrierlösungen (Rezepturen sind in Tabelle 1 beschrieben) vor dem Tag des Experiments und gefrier in 10 ml-Aliquots.Tauen die Kalibrierungslösungen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Den pH-Wert mit einem pH-Meter und Aufzeichnung der tatsächlichen pH-Wert der Lösungen.
- Montieren Sie eine peristaltische Pumpe an der Bodenschale Glas vor der Bildaufnahme und führen Sie Live-Videomikroskopie, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben.
- Am Ende der 30 Minuten Erfassungsperiode schalten Sie die Pumpe auf, um die Lösung in der Schale zu entfernen, fügen Sie 1 ml der erste Kalibrierungslösung und die Pumpe stoppen.
- Warten Sie, bis das Signal stabilisiert, in der Regel 5 min. Wiederholen Sie mit die Eichlösungen.
- Zuführen mindestens eine Kalibrierung pro Versuchstag und kalibrieren, beginnend mit dem höchsten pH-Wert und arbeiten sequentiell auf den niedrigsten, sowie ausgehend von dem niedrigsten pH-Wert und arbeiten sequentiell in Richtung der Höhe.
- Als Kontrolle wurden 100 ul 100 uM NADPH-Oxidase-Hemmer diphenyl propionium Iodid (DPI) in HBSS, um Zellen in der Bodenschale Glas verdünnt in 900 & mgr; l HBSS, undInkubation für 10 min.
- Starten Akquisition und fügen Zymosan wie oben (Schritt 2.7). Nach 15 min der Phagozytose, mit 10 ul 10 uM V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A (ConcA) in HBSS verdünnt und weiter Bildgebung für weitere 15 min.
4. Analyse
- Analyse von Zeitraffer-Filmen und Phagosom Snapshots.
Hinweis: Die folgenden Anweisungen spezifisch für ImageJ sind. Schritt-für-Schritt-Anleitungen können in Abhängigkeit von der verwendeten Software unterschiedlich sein, aber die in diesem Abschnitt beschriebenen Funktionen sind in den meisten professionellen Bildanalyse-Software.- Öffnen Sie die Bilder mit professionellen Bildanalyse-Software. Subtrahieren Sie den Hintergrund in der 490-Kanal, indem ein kleines Quadrat ROI mit dem Quadrat Polygon Auswahl-Werkzeug in einem Bereich, wo es keine Zellen, und klicken Sie auf Plugins> BG Subtraktion von ROI. Dann laden Sie die gleiche ROI auf der 440-Kanal, indem Sie auf Bearbeiten> Auswahl> Auswahl wiederherstellen und wiederholen.
- Machen Sie eine 32-Bit-Verhältnis Bild des 490 Kanal geteilt durch die 440-Kanal, indem Sie Prozess> Bild Calculator ..., eine entsprechende Bilder in den Image1 und Image2 Dropdown-Menüs, wählen Sie dann 'Teilen' im Dropdown-Menü Bedienung und die Überprüfung der 32-bit (float) Ergebnis Kontrollkästchen.
- Ändern Sie die Farbcodierung Verweistabelle auf ein Verhältnis-kompatiblen Farbcodierung, indem Sie auf Bild> Lookup Tables> Rainbow RGB. Threshold das Verhältnis Bild, um es durch Anklicken zu beseitigen Bild 0 und unendlich Pixel> Anpassen> Schwellenwert .... Passen Sie die Bildlaufleisten, so dass Zymosan in rot angezeigt wird, und klicken Sie auf Anwenden, sicherstellen, dass die Set Hintergrundpixel Kontrollkästchen NaN, um ausgewählt.
- Kombinieren Sie dieses Verhältnis Stapel mit der Hellfeld-Kanal in einem Mehrkanal-Verbund indem Sie auf Bild> Farbe> Merge Kanäle, und die Auswahl der Hellfeldbild in der grauen Kanal Dropdown-Menü und das Verhältnis Bild im Grünkanal im Dropdown-Menü, und Auswählen desHalten Sie Quellbilder Check-Box. Scannen Sie die Zeitraffer-Filme oder Snapshots, um festzustellen, die Phagosomen analysiert werden sollen. Die Hellfeldkanal ist sinnvoll, für diese.
- Zeichnen Sie Bereiche von Interesse (ROI) mit dem ovalen Polygon-Auswahl-Werkzeug in der Umgebung von Phagosomen und fügen Sie sie der ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren> Tools> ROI Manager> hinzufügen. Messen Sie ihren Zymosan Intensitätsverhältnis, indem Sie auf Mehr> Multi-Measure und Abwahl der eine Zeile pro Stück Kontrollkästchen.
- Für Zeitraffer-Filme, Phagosomen Spur ein zu einer Zeit, indem eine ROI, tippen Sie Strg + M zu jedem Zeitpunkt zu messen, und das Bewegen des ROI, wenn notwendig, um Intensitätswerte über die Zeit zu verfolgen. Kopieren Sie die Messungen aus dem Ergebnisfenster in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
Anmerkung: Analyse von 15 (5 Zeitverläufe pro Experiment x 3) unabhängigen Experimenten ist ideal, aber in Abhängigkeit von der beobachteten Variabilität kann mehr oder weniger erforderlich sein. Speichern der ROIs wird immer empfohlen. Einige Softwarepakete ermöglichen Bild registration und dynamische Aktualisierung von ROIs, diesen Teil der Analyse zu erleichtern.
- Umwandlung von Fluoreszenz auf pH-Werte
- Messen Sie das Verhältnis 490/440 für Phagosomen in den Kalibrierungs Zeitraffer-Filme, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
- In einer Tabellenkalkulation, zeichnen die Verhältniswerte über die Zeit und berechnet die Durchschnittsverhältniswerte von allen Phagosomen innerhalb des Sichtfeldes (gewöhnlich 5-20) 5 Zeitpunkten innerhalb der Mitte der Zeitperiode entsprechend jedem pH-Kalibrierung Lösung. (Siehe auch die roten Kästen in 5A.)
- Zeichnen Sie diese durchschnittlich 490/440 Ratio-Werte gegenüber dem tatsächlich gemessenen pH-Wert. Kombinieren Sie mindestens 3 unabhängigen Kalibrierungen in einem einzigen Graphen. Verwenden Sie einen statistischen oder numerische Software-Paket, um eine nichtlineare Regression (Best-Fit-Kurve) durchführen, in der Regel an einen sigmoidalen Gleichung.
Hinweis: Zum Beispiel in 5B die Gleichung verwendet wurde, war eine Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Oben-Unten)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], wobei Y-Werte sind die 490/440-Verhältnisse, X sind die pH-Werte und die Oben, Unten, sind V50 und Steigungsparameter von der Software berechnet. - Verwenden Sie die erhaltene Gleichung zur Verhältniswerte um pH zu verwandeln.
Hinweis: Zum Beispiel in 5B die für die Eichkurve in Gegenwart von Natriumazid erhalten Gleichung 490/440 Verhältnis = 1,103 + [(2,89 bis 1,103) / (1 + EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Die Auflösung nach pH ergibt die folgende Gleichung: pH = 6,993 - 0,9291 * [LN ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
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Representative Results
Die folgenden sind repräsentative Ergebnisse für ein Experiment, wo die phagosomalen pH-Wert der primären Maus Neutrophile aus dem Knochenmark von Wildtyp oder isoliert Hvcn1 - / - Mäuse wurden verglichen. Für ein erfolgreiches Experiment ist es wichtig, genug Phagosomen im Sichtfeld während der gesamten Dauer des Zeitraffer-Film zu erhalten, bei gleichzeitiger Vermeidung zu viele Phagosomen, die später sein wird schwieriger Segment während der Bildanalyse. 1 schema Beispiele für gute und schlechte confluencies. Für zeitabhängige und Schnappschuss analysiert, müssen externe Zymosan Partikel aus Phagosomen unterschieden werden und aus der Analyse ausgeschlossen. 2 zeigt, wie der Hellfeldbild kann nützlich zur Unterscheidung externen Zymosan Partikel aus Phagosomen sein. Figur 3 zeigt Beispiele von typischen phagosome pH zeit Kurse in Wildtyp im Vergleich zu Hvcn1 - / - 4 zeigt die Wirkung der Zugabe der NADPH-Oxidase-Hemmer DPI, die in einem schnellen Ansäuerung ergibt, gefolgt von der Zugabe der V-ATPase-Inhibitor ConcA, die die Ansäuerung umkehrt. Solche Experimente kann kritisch sein zu beweisen, dass die pH-empfindliche Sonden werden innerhalb von Phagosomen arbeiten, wie sie sollten. Eine typische Kalibrierung Zeitverlauf ist in Abbildung 5 dargestellt, mit Rechtecken, die den Bereich von Ratio-Werte verwendet, um die Eichkurve. Abbildung 5 zeigt außerdem, wie Farbstoff Chlorierung durch MPO-Aktivität können die intraphagosomal pH-Antwort des FITC beeinflussen, Hervorhebung der Tatsache, daß Sonden können anders ansprechen als im phagoso erwartet mal Umwelt und die Bedeutung der in situ-Kalibrierung.
Abbildung 1. Angemessene Konfluenz und Ziel: Zellverhältnis der linken Seite zeigt ein Beispiel, wo Zellkonfluenz ist zu spärlich und das Ziel:. Zellverhältnis zu niedrig ist, Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass eine phagozytische Ereignis wird in das Blickfeld auf. Das mittlere Feld zeigt ein Beispiel, wo Zellkonfluenz zu hoch ist und die Zellen werden überfüllt. Unter diesen Bedingungen können die Zellen nicht genug Platz hat, und finden ihre Ziele oder können übereinander Herstellung Analyse schwieriger später kriechen. Das rechte Bild zeigt eine ideale Zellkonfluenz und ursprüngliche Ziel: Zellverhältnis, in dem viele Zellen und Ziele können sich gezeigt, und dennoch klar voneinander voneinander unterschieden werden. FITC-Zymosan wird grün angezeigt und die Waage Balken stellt 10 um. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Unterscheidungs Phagosomen und uningested Zymosan. Die linke Tafel zeigt eine zusammengeführte Hellfeldbild und ein 490/440 FITC-Zymosan-Verhältnis, während das rechte Bild zeigt die Hellfeldbild allein. Phagosomen (kleine grüne Pfeile) können aus externen Teilchen unterschieden werden können, die entweder nicht co-lokalisieren mit Zellen (kurz roter Pfeil) oder deren Fluoreszenz nicht übereinstimmt mit einem dunklen Zentrum (lang roter Pfeil) um einen helleren Ring umgeben, charakteristisch von Phagosomen in der Hellfeldbild (grüne Pfeile). Die Maßstabsbalken entspricht 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Zeitkurse, durchschnittliche pH-Wert und das Verhältnis Histogramme von Wildtyp und Hvcn1 - / -. Neutrophile Phagosomen (A) Typische Zeitverläufe der phagosomalen pH zeigt, dass, während in Wildtyp-Neutrophilen (blau) der pH-Wert neutral ist (gepunktete Linie ) oder leicht alkalischen (durchgezogene Linie) während der frühen Zeitpunkten nach der Einnahme, die Phagosomen von Hvcn1 - / - Neutrophilen (rot) kann entweder alkalisch (durchgezogene Linie) oder säuern (gestrichelte Linie). (B) Das Kompilieren Schnappschüsse 30-35 min nach Zugabe von Zielen kann der Durchschnittsbevölkerung phagosomalen pH-Wert auf eine große Anzahl von Phagosomen (Wildtyp berechnet werden: n = 5/1898/383 und Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 Experimente / Phagosomen / Zellen, Bars sind Mittelwerte ± SEM, NS nicht signifikant). (C) Histogramme der FITC-zymosaN-Verhältnisse offenbaren Unterschiede in phagosomalen pH-Wert zwischen Wildtyp und Hvcn1 - / - Neutrophilen. (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4. Wirkung von NADPH-Oxidase-Hemmer DPI und V-ATPase-Inhibitor ConcA auf phagosomalen pH. Vorinkubation bei 10 uM DPI ergab eine rasche Säuerung Phagosomen kurz nach der Einnahme, die durch Zugabe von 100 nM ConcA (Pfeil) umgekehrt wurde. (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. pH-Kalibrierung Zeitverlauf und die Auswirkungen der MPO-Hemmung auf die Kalibrierung von FITC-Zymosan. (A) Ein typischer pH Eichkurve intraphagosomal FITC-Zymosan. Rote Felder zeigen den Bereich der Verhältniswerte verwendet, um die Kalibrierungskurve zu konstruieren. Die pH-Werte der Lösungen verwendet, und die Zeiten, zu denen die Lösungen geändert werden, werden durch Pfeile angezeigt. Die Kurve stellt den Mittelwert von 10 Phagosomen innerhalb eines einzelnen Sehfeld. (B) Hemmung von MPO mit dem nicht-spezifischen Inhibitors Natriumazid (5 mM, MPO Inh) erhöht den Dynamikbereich des intraphagosomal FITC-Zymosan Antworten pH-abhängig. Punkte sind Mittelwerte ± SEM (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) Bitte klicken Sie hier, um ein la ansehenrger-Version dieser Figur.
| 1.1 | (2x) Basis | |||||
| Puffer | Stock | Final (1x) | 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mM | 140 ml | |||
| MgCl 2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Puffer | Stock | Finale(1x) | Zweck | ||
| MES | 1 M | 20 mM | zur pH-Wert 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | zur pH-Wert 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | zur pH-Wert von 5,5 bis 6,7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | zur pH-Wert von 5,5 bis 6,8 | |||
| 1.3 | Ionophore | Lizenz (100% EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mM | 5 & mgr; M | ||||
| 1.4 | Für 50 ml | |||||
| pH | 2x Basis | Buffer Type | Puffer Vol. | Nigericin | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 8.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 & mgr; | 5 & mgr; | |
| Einstellen des pH mitKOH oder HCl | ||||||
Tabelle 1 Rezept zur Herstellung von Kalibrierlösungen. 1.1) Rezept zur Herstellung von 500 ml eines 2x-Basislösung. 1.2) Rezeptur für die Herstellung nach dem pH-Wert der Probenlösung, die verschiedene Puffer verwendet. 1.3) Rezeptur für die Herstellung der in den Eichlösungen verwendet Ionophore. 1.4) Rezept zur Herstellung von 50 ml jeder Kalibrierungslösung mit Hilfe der Basis, Puffer und Ionophore in 1.1-1.3 beschriebenen.
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Discussion
Obwohl zeitaufwendiger als alternative Verfahren, wie Spektroskopie und FACS, die eine ähnliche Strategie unter Verwendung eines pH-empfindlichen Farbstoff, Ziele gekoppelt einzusetzen, sondern messen die durchschnittliche pH-Wert einer Population von Phagosomen, bietet mikroskopische mehrere Vorteile. Erste ist, dass innere und äußere gebunden, aber nicht internalisierten Partikel können leicht unterschieden werden, ohne andere Chemikalien, wie Trypan-Blau oder Antikörper hinzuzufügen, Abschreckhärtung oder Etikett externen Teilchen sind. Zweite ist, dass im Anschluss an die Zellen in Echtzeit ermöglicht es den Forschern, mehrere Aspekte der phagozytischen Prozess gleichzeitige und so Auswirkungen auf die Migration, Erkundung und bindende Partikel könnten hier leicht zu erkennen ist, während es könnte mit der Bevölkerung basierte Methoden übersehen werden, zu beobachten. Zusätzlich Synchronisation der Initiierung der Phagozytose, oft indem Zellen bei 4 ° C, das andere Handel Ereignisse durch Kälteschock 40,41 stören könnte durchgeführt werden, ist nichtt erforderlich, da zum Zeitpunkt Null kann direkt festgestellt werden. Tatsächlich wird beim Live Mikroskopie, das 4 ° C Synchronisationstechnik wird nicht empfohlen, wenn die Erfassung Zeiträume nahe der Einleitung die Phagozytose als Kondensations, die während der Temperaturverschiebung auf dem Boden der Schale bildet, kann mit dem Ziel Sionsöl vermischen und Temperaturunterschiede zwischen der Erwärmung Gericht und Mikroskopkomponenten können Fokus verschiebt verursachen. Ein dritter Vorteil ergibt sich aus der Tatsache, dass Phagosomen intrinsisch heterogenen von mehreren Parametern ab, einschließlich, aber nicht beschränkt auf pH 42 beschränkt und bestimmte Effekte auf phagosome pH könnte subtiler sein, die Änderung der Verteilung der phagosomalen pH anstatt der durchschnittlichen Bevölkerung, wurde in 3 dargestellt ist. Solche Beobachtungen können tiefere mechanistische Einblicke in die Regulation der phagosomalen pH geben.
In der vorliegenden Studie wurde FITC als das pH-empfindliche Farbstoff der Wahl ausgewählt, da espreiswerte, überall verfügbar ist, und vor allem einen pKa von 6,5 mit einem Dynamikbereich umfassenden pH 3-9 in seiner freien Form 37, der den ursprünglich erwarteten pH-Bereich von neutral bis schwach alkalisch abgestimmt nach den bisherigen Untersuchungen 29,30. Vor kurzem eine Studie unter Verwendung eines unterschiedlichen pH-Sonde genannt SNARF, die eine Grund pKa-Wert von 7,5, unerwartet geschätzten pH-Werte im Bereich 1-2 pH-Einheiten alkali sowohl für Wildtyp und Hvcn1 hat - / - Neutrophilen Phagosomen 39. Somit ist die Wahl des pH-Sensors ein wichtiger Parameter je nach Anwendungsfall zu berücksichtigen. Grundsätzlich kann das hier vorgestellte Verfahren leicht an andere pH-empfindliche Farbstoffe, wie SNARF und 2 ', 7'-bis- einzusetzen (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein (BCECF) deren Succinimidyl-Ester-Derivate werden leicht verbunden, um aminhaltige Teilchen, wie Zymosan. Tatsächlich Sensoren brauchen nicht fluoreszierende Farbstoffe als ratiomet beschränken,ric pH-empfindliche Proteine, wie ein sypher 43 könnte transduziert und durch Mikroorganismen exprimiert werden. Mehrere nicht-ratiometrische Alternativen bestehen auch, insbesondere die rote Version des Farbstoffs pHrodo, die in Verbindung mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) verwendet werden kann -markierte Proteine oder dem pH-sensitiven Protein pHluorin. Jedoch wegen der potenziell großen Auswirkungen, die das harte intraphagosomal Milieu kann Farbstoffe und Proteine darin betreffen, haben diese Sonden sollten mindestens in Verbindung mit pH-Sonden unempfindlich sein, bei der Ableitung eines pseudo-Verhältnis eingesetzt werden. Wie in Figur 5 beispielhaft dargestellt, können Kalibrierungen Experimenten die Wirkungen von Farbschädigung als reduzierte oder verzerrt Dynamikbereich freizulegen. Auf einer praktischen Anmerkung, sind Kalibrierungsexperimente nicht immer perfekt und kann nicht durchführbar, um nach jedem Experiment durchzuführen. Folglich kann Verhältniswerte gelegentlich aus dem Bereich der Kalibrierung fallen und Ertrag nicht Werte, auf die Umstellung auf pH-Wert. Es kann appropr werdenIATE entweder zum Ausdruck bringen, diese außerhalb des Messwerte als "größer / kleiner-als oder gleich" maximale und minimale Kalibrierung pH-Werte oder alle Werte als Kennzahlen und Schätzung pH auszudrücken reicht, dass die durchschnittlichen Verhältnisse darzustellen.
Wie von DPI hervorgehoben und ConcA steuert, ROS-Produktion und V-ATPase-Aktivität sind wichtige Faktoren, die phagosomalen pH zu bestimmen. In der Tat, in vielen Situationen, Veränderungen in der Ebenen der ROS-Produktion können Unterschiede in phagosomalen pH zugrunde liegen, insbesondere in Neutrophilen, und Messung der phagosomalen ROS-Produktion und pH oft Hand in Hand gehen. Ein Wort zur Warnung ist, dass beide Medikamente verleihen Einblick in die Wirksamkeit der Enzyme hemmen sie aber nicht, um ihre Position innerhalb der Zelle. Beide Enzyme sind Multi-Untereinheiten-Komplexen, deren einzelne Komponenten müssen Besucher auf Phagosomen 4, und deren Mangel an Aktivität auf Phagosomen können von Menschenhandel oder Montagefehler, anstatt direkte Auswirkungen zur Folge haben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
