Abstract
食作用は、先天性免疫細胞が死滅させるかまたは中和摂取材料を、または抗原としてそれを提示し、適応免疫応答を開始するために、細菌、アポトーシス細胞または他の異物を飲み込み、それを通して基本的な過程です。ファゴソームのpHは、内膜およびタンパク質分解酵素の活性化、食作用性空胞が分解オルガネラに成熟することを可能にするイベントと核分裂や核融合を制御する重要なパラメータです。加えて、H +との転座は、他の宿主組織への効率的な殺傷及びシグナリングのために必須である活性酸素種（ROS）の高レベルの産生のために必要とされます。多くの細胞内病原体は、ファゴソームの生物学におけるpHの重要性を強調し、ファゴソーム酸性化を制限することにより、食細胞死滅を覆します。ここでは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を使用して、好中球にファゴソームのpHを測定するためのレシオメトリック法は貪食TARGとしてザイモサンを標識説明しますETS、ライブセルイメージング。アッセイは、単一色素の蛍光よりもむしろ絶対的なpH依存性比の定量を、可能にする、440 nmで励起した場合、490nmで励起した場合、酸性pHによりクエンチされないが、FITCの蛍光特性に基づいています。 インサイチュ染料較正及び実際のpH値との比の変換を行うための詳細なプロトコルも提供されます。彼らは、このような漂白などの摂動に対する感度が低いなどの単一染料レシオメトリック法は、一般的に測定された信号を歪ま変化、レーザーの変動、および不均一なラベルを、集中、単一の波長またはデュアル色素擬似レシオメトリックのプロトコルよりも優れて考えられています。この方法は、容易に他の食細胞タイプのpHを測定するために変更することができ、及びザイモサンは、不活性ビーズからの生きた微生物を、任意の他のアミン含有粒子で置き換えることができます。最後に、この方法は、異なるpH範囲に感受性の他の蛍光プローブまたは他のphagosomを利用するように適合させることができますアル活動は、それファゴソームの機能イメージングのための一般的なプロトコルとなっています。
Protocol
倫理の声明：すべての動物の操作は、ジュネーブ大学の動物実験委員会のガイドラインに厳密に従って行きました。
貪食ターゲットの作製
- 10 mlの滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で乾燥したザイモサン20mgを加えます。 10分間沸騰水浴中で渦と熱。クールで5分間2,000×gで遠心します。
- 水浴ソニケーターで、上清を除去し1mlのPBS中に再懸濁し、10分間超音波処理。 2 1.5ミリリットルチューブに500μlのを転送します。 5分間11,000×gで遠心分離します。
- 500μlのPBSで洗浄を繰り返します。煮沸ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。
- たて、0.1M の Na 2 CO 3、（ステップ1.2）上記のようにpHが9.3を用意し500μlの二回ザイモサンを洗ってください。
- 最終洗浄後490μlの再懸濁。ジメチルsulfoxidに溶解し10 mg / mlのFITCの10μLを追加E（DMSO）、ボルテックス、ホイルで覆い、そして室温で4時間撹拌しながらインキュベートします。
- 最初の0.5ミリリットルのDMSO +300μlのPBS、その後、0.5ミリリットルのDMSO +450μlのPBS、その後、PBSのみで、その後+150μlのPBS 0.5ミリリットルのDMSOで、上記のように（ステップ1.2）洗浄し、結合していない色素を除去するために。
- 血球計数器を使用してザイモサンを数えます。それは中央のグリッド上に配置されたカバースリップを満たしている血球計数器室の端に10μlを添加、ボルテックス、500μlのPBSにザイモサンの1μlを添加します。 20Xの対物レンズを搭載した明視野顕微鏡で血球計数器を取り付けます。
- 16正方形を含む左上隅に焦点を当て、手の数取器を使用して、このエリア内のすべてのザイモサン粒子をカウントします。右下の隅に繰り返します。 =ザイモサン濃度/ 2×500×10 4ザイモサン/ mlのカウント：以下の式を使用してザイモサン濃度を計算します。標識ザイモサンは、等分凍結し、-20℃で保存することができます。
- ラベルされたザイモサンのwiをオプソニン化1：100希釈でウサギ抗ザイモサン抗体番目。ボルテックスおよび37℃の水浴中で1時間インキュベートします。 （ステップ1.2）上記のように500μlのPBSで洗浄します。
注意：ザイモサン後で解析をより困難にすることができ塊を形成する傾向があるとして、超音波処理は非常に、特にオプソニン化した後に、推奨されます。 65％（v / v）のラットまたはヒト血清でオプソニン化は、代替として使用することができます。 - ステップ1.7から1.8に記載されているように血球計数器を使用してザイモサンをカウントし、100×10 6粒子/ mlに希釈します。補体、または全くオプソニンのような他の食細胞刺激剤とのオプソニン化は、代わりに実行することができます。
2.ライブビデオ顕微鏡
- 他の場所38で詳細に説明するように、一次マウスの好中球を分離します。
- また、任意の食細胞タイプを使用します。 （RPMI）ロズウェルパーク記念研究所で氷の上での好中球を保ち、5％ウシ胎児血清を補充した1640（V / V）、200 Uペニシリン/ streptomycinは、10×10 6細胞/ mlの濃度で使用直前まで。他の細胞型は、1〜4日前に播種することができます。
- 50μlの培地を追加することで、ドロップを広げ、細胞を接着させるために37℃で5分間インキュベートし、35mmのガラスボトムディッシュの中心に好中球の2×10 5（20μl）を追加します。
- ハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlを特定のMPO阻害剤、4-アミノ安息香酸ヒドラジド（4- ABH、10μM）を含む37℃に温め加えます。このようなアジ化ナトリウムのような非特異的なMPO阻害剤、（5 mM）を、使用してもよいが、近年pHを39に追加の非特異的効果を発揮することが示唆されています。
- 37℃の加熱システムと40X油目的を搭載した広視野蛍光顕微鏡の料理をマウントします。細胞や機器を平衡化することを可能にするために10分間イメージングせずに細胞をインキュベートします。
- 明視野透過画像を取得する顕微鏡の設定を調整する[PHASEまたは440 nm以下490nmの励起および535nm放射ごとに30秒で使用可能な場合は微分干渉コントラスト（DIC）]。
- あまりにも多くの光退色や光毒性を回避するために、顕微鏡システムに応じてと頼まれて、実験の質問に応じて露光時間と取得頻度を調整します。画像取得を開始します。
- 2分後、10×10 6（50μl）を追加皿の中央にFITC-ザイモサンをオプソニン化。使用食細胞とターゲットの種類に応じて細胞比：ターゲットを調整します。
- 30分間撮影を続けます。 30分後、タイムラプス取得を停止し、タイマーを開始します。ステージを移動し、すべての5分以内に、画像その他のファゴソームに異なる視野で10以上のスナップショットをキャプチャします。
3.キャリブレーションとコントロール実験
- 実験の日に（レシピは表1に記載されている）は、従来のpH校正ソリューションを準備し、10mlのアリコートで凍結します。37℃の水浴中に較正溶液と暖かいを解凍します。 pHメーターでpHをチェックして、ソリューションの実際のpHを記録します。
- 前の画像取得にガラスボトムディッシュの蠕動ポンプをマウントして、上記のようにライブビデオ顕微鏡を行う（セクション2）。
- 30分の取得期間の終わりに、ディッシュ内の溶液を除去第1の較正溶液1mlを加え、ポンプを停止する上でポンプの電源を入れます。
- 信号は、通常は5分を安定するまで待ちます。各校正液で繰り返します。
- 実験日ごとに少なくとも1つのキャリブレーションを実行して、最高のpHで始まり、最低に順次作業だけでなく、最低のpHから出発して、最高に向けて順次作業を調整します。
- 対照として、ガラスボトムディッシュで900μlのHBSS中の細胞にHBSS中で希釈し、100μMNADPHオキシダーゼ阻害剤ジフェニルpropioniumヨウ化（DPI）の100μlを添加し、10分間インキュベートします。
- 取得を開始して（ステップ2.7）上記のようにザイモサンを追加します。食作用の15分後、HBSS中で希釈した（コンカ）コンカナマイシン、10μMのV-ATPaseの阻害剤の10μlを添加し、さらに15分間撮影を続けます。
4.分析
- タイムラプス映画やファゴソームスナップショットの分析。
注意：以下の手順は、ImageJのに特異的です。ステップバイステップの手順は、使用するソフトウェアの依存して広く変化し得るが、この節で説明する関数は、ほとんどのプロの画像解析ソフトで利用できます。- プロの画像解析ソフトウェアで画像を開きます。何の細胞が存在しない領域に四角ポリゴン選択ツールを使用して、小さな正方形のROIを描画し、ROIからプラグイン> BGの減算をクリックすることで、490チャンネルのバックグラウンドを減算します。次に>選択>選択と繰り返しを復元し、[編集]をクリックすることで、440チャンネルで同じROIをアップロードします。
- その後、[操作]ドロップダウンメニューで「分割」を選択、...プロセス>画像電卓をクリック画像1と画像2のドロップダウンメニューで、適切な画像を選択することにより、440チャンネルで割った490チャンネルの32ビットの比画像を作ります、および32ビット（フロート）結果チェック・ボックスをチェック。
- >レインボーRGBの画像>ルックアップテーブルをクリックすることで、比と互換性の色分けにカラーコーディングルックアップテーブルを変更します。画像をクリックして、0と無限大のピクセルを排除するための閾値比画像は、>>しきい値を...調整します。 NaNのチェックボックスに設定した背景ピクセルが選択されていることを確認すること、そのザイモサンは赤で表示されるようにスクロールバーを調整し、[適用]をクリックします。
- 画像をクリックすることで、マルチチャンネルコンポジットに明視野チャンネルとこの比スタックを組み合わせ>カラー>チャンネルをマージし、灰色のチャネルのドロップダウンメニューで、明視野像と緑のチャネルのドロップダウンメニューで、比画像を選択し、選択しますチェックボックスをソース画像を保管してください。タイムラプスムービーやファゴソームが分析されるかを決定するためにスナップショットをスキャンします。明視野チャンネルは、この場合に便利です。
- 追加>ファゴソームの周りに楕円形、多角形選択ツールを使用して、関心領域（ROI）を描画し、分析]> [ツール]> [ROIマネージャ]をクリックして、ROIマネージャーに追加します。詳細>マルチ測定デスライス選択]チェックボックスごとに1つの行をクリックすることで、彼らのザイモサン強度比を測定します。
- タイムラプスムービーでは、トラックは、各時点を測定するには、Ctrl + Mを入力し、ROIを描画し、時間をかけて強度値を追跡するために必要な場合に、ROIを移動させることにより、一度に一つのファゴソーム。表計算ソフトに結果ウィンドウからの測定値をコピーします。
注：15（実験X 3当たり5時間のコース）の独立した実験の分析は理想的ですが、多かれ少なかれ観察変動に応じて必要となる場合があります。 ROIを保存すると、常に推奨されます。一部のソフトウェアパッケージでは、画像レジを許可ストレーションおよびROIの動的更新、分析のこの部分を容易にします。
- 蛍光のpH値への変換
- 4.1節で説明したように、キャリブレーションタイムラプスムービーでファゴソームのための440分の490の比率を測定します。
- スプレッドシートでは、時間をかけて比の値をプロットし、各pH校正に対応する期間の中央内5の時点から（5-20の間、通常は）視野内の全てのファゴソームから平均の比の値を計算します溶液。 （ 図5Aにも赤いボックスを参照してください。）
- 実際に測定されたpH値に対してこれらの平均440分の490比の値をプロットします。一つのグラフに、少なくとも3つの独立したキャリブレーションを結合します。通常シグモイド方程式に、非線形回帰（ベストフィット曲線）を実行するために、統計や数値ソフトウェアパッケージを使用してください。
注：例えば、 図5（b）で使用される式は、ボルツマンシグモイド[Y =ボトム+（（上下）でした/（1 + EXP（（V50-X）/スロープ））Yの値が440分の490比である]、Xは、pHの値であり、上、下、V50及び傾斜パラメータは、ソフトウェアによって計算されます。 - pHに比の値を変換するために取得した式を使用します。
注：例えば、 図5（b）にアジ化ナトリウムの存在下での検量線について得られた方程式は440分の490率で= 1.103 + [（2.89から1.103）/（1 + EXP（（6.993-PH）/0.9291）] 。pHを解くことは、以下の式が得られます。pH値= 6.993から0.9291 * [LN（（1.178 /（比-1.103）） - 1））]。
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Representative Results
/ - -以下は、初代マウス好中球のファゴソームpHは野生型またはHvcn1の骨髄から分離された実験の代表的な結果であります マウスを比較しました。成功した実験では、それは後の画像解析の際にセグメントに、より困難になりますあまりにも多くのファゴソームを回避しながら、タイムラプスムービーの全期間中に視野内に十分なファゴソームを得ることが重要である。1に示す図良い面と悪い集密度の例。時間依存とスナップショットは、分析のために、外部のザイモサン粒子はファゴソームと区別し、分析から除外されなければならない。2は、明視野像は、ファゴソームから外部ザイモサン粒子を区別しやすくするためにどのように活用できるかを示しています。 図3は、典型的なファゴソームの例を示していますHvcn1と比較して、野生型のpHタイムコース- / - 図4は、酸性化を逆転V-ATPaseの阻害剤コンカを加え急速な酸性化をもたらす、NADPHオキシダーゼ阻害剤DPIを、追加の効果を示します。このような実験は、pH感受性プローブは、彼らが必要としてファゴソーム内で作業していることを証明するために重要であることができます。典型的なキャリブレーション時間経過が較正曲線を構築するために使用される比の値の範囲を示す四角形で、 図5に示されている。図5は、さらに、MPO活性を介して塩素を染色する方法を示し事実を強調し、FITCのintraphagosomal性pH応答に影響を与えることができますプローブはphagoso以内に期待とは異なる応答することができること MAL環境とその場でのキャリブレーションでの重要性。
図1.適切な密集度と目標：細胞比左側のパネルは、細胞集密度があまりにもまばらで、ターゲットである例を示しています。細胞比が貪食イベントが視野に発生する確率を減少させる、低すぎます。中央のパネルは、細胞集密度が高すぎると、細胞が混雑している例を示しています。これらの条件下では、細胞が移動し、その目標を見つけるか、より困難後に互いに意思分析上でクロールもするのに十分なスペースがない可能性があります。多くの細胞と標的が見られてすることができますし、まだ、まだ明確に区別する細胞比、：右側のパネルには、理想的な細胞集密度と当初の目標を示しています。 FITC-ザイモサンは緑色で示されており、スケールバーは10μmで表しています。 /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
右側のパネルだけでは明視野像を示しているのに対し、 図2の区別ファゴソームとuningestedザイモサンは左側のパネルには、マージされた明視野像と440分の490 FITC-ザイモサン比を示しています。ファゴソーム（小さな緑色の矢印）の特性、細胞（短い赤矢印）と共局在またはその蛍光明るいリングに囲まれた暗いセンター（長い赤矢印）と一致していませんしないのいずれかのことを、外部粒子と区別することができます明視野像（緑の矢印）におけるファゴソームの。スケールバーは10μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.時間のコース、野生型およびHvcn1の平均pH及び比ヒストグラム- / -好中球食細胞ファゴソームのpHの（A）の典型的な時間のコース野生型好中球（青）でpHが中性であるのに対し、ことを示している（点線）または弱アルカリ性（実線）の摂取、Hvcn1のファゴソーム後の初期の時点の間に- / -好中球（赤）のいずれかのアルカリ化する（実線）または酸性（点線）ことができます。 N = 6： - / - N = 5/1898年/ 383とHvcn1：（B）のコンパイルのスナップショットは、ターゲットの添加後30〜35分に採取して、大きなファゴソームの数（野生型から計算される平均集団ファゴソームpHが可能/ 1433/451の実験/ファゴソーム/細胞、バーは平均±SEM）は、重要ではありませんNSです。 FITC-zymosaの（C）ヒストグラムN比は、野生型との間にHvcn1ファゴソームpHの違いを明らかにする- / -好中球。 （この図は、許可を得て、[19]から変更されている。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図ファゴソームpHにNADPHオキシダーゼ阻害剤DPIとV-ATPaseの阻害剤コンカ4.影響。10μMのDPIでのプレインキュベーションは、100 nMのコンカ（矢印）の添加により逆転された、すぐに摂取後ファゴソームの急速な酸性化をもたらしました。 （この図は、許可を得て、[19]から変更されている。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5のpH校正時間経過およびFITCザイモサンのキャリブレーションのMPO阻害の影響。（A）intraphagosomal FITC-ザイモサンの典型的なpH値の校正曲線。赤いボックスは、較正曲線を構築するために使用される比の値の範囲を示しています。溶液の実際のpH値が使用され、溶液が変更される時間は矢印で示されています。曲線は、1つの視野内の10ファゴソームの平均を表します。非特異的阻害剤であるアジ化ナトリウム（5ミリモル、MPO INH）とMPOの（B）阻害はintraphagosomal FITC-ザイモサンpH依存性応答のダイナミックレンジを増大させます。ポイントは、平均±SEM（この図は、許可を得て、[19]から変更されている。）されているラを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のrgerバージョン。
| 1.1 | （2回）ベース | |||||
| バッファ | 株式 | ファイナル（1×） | 500 mlの（2×）用 | |||
| 塩化カリウム | 1 M | 140mMの | 140ミリリットル | |||
| MgCl 2 | 1 M | 1 mMの | 1ミリリットル | |||
| EGTA | 1 M | 0.2 mMの | 0.2ミリリットル | |||
| 塩化ナトリウム | 1 M | 20 mMの | 20ミリリットル | |||
| 1.2 | バッファ | 株式 | ファイナル（1×） | 目的 | ||
| MES | 1 M | 20 mMの | pHは5.5から6.5のための | |||
| HEPES | 1 M | 20 mMの | pHが7.0〜7.5のための | |||
| トリス | 1 M | 20 mMの | pHは5.5から6.7のための | |||
| NMDG | 1 M | 20 mMの | pHは5.5から6.8のための | |||
| 1.3 | イオノフォア | 株式（100％エタノール） | ファイナル（1×） | |||
| ナイジェリシン | 5 mg / mlの | 5μg/ mlの | ||||
| モネンシン | 50 mMの | 5μM | ||||
| 1.4 | 50ミリリットルのために | |||||
| pH値 | 2Xベース | バッファタイプ | バッファ巻。 | ナイジェリシン | モネンシン | |
| 5.0 | 25ミリリットル | MES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 5.5 | 25ミリリットル | MES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 6.0 | 25ミリリットル | MES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 6.5 | MES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | ||
| 7.0 | 25ミリリットル | HEPES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 7.5 | 25ミリリットル | HEPES | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 8.0 | 25ミリリットル | トリス | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 8.5 | 25ミリリットル | トリス | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 9.0 | 25ミリリットル | トリス | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| 9.5 | 25ミリリットル | NMDG | 1ミリリットル | 50μlの | 5μL | |
| でpHを調整しますKOH又はHCl | ||||||
較正溶液を調製するための表1のレシピ。較正溶液中で使用イオノフォアを調製するための2倍のベース溶液500mlを調製するための1.1）レシピ1.2）キャリブレーション溶液のpHに応じて使用される種々の緩衝液を調製するためのレシピ。1.3）レシピ1.4）50を製造するためのレシピ1.1〜1.3に記載の塩基、緩衝剤およびイオノフォアを用いて、各較正溶液のmlです。
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Discussion
ターゲットに接続されたpH感受性色素を用いた同様の戦略を採用するが、ファゴソームの集団の平均pH値を測定し、このような分光法およびFACSなどの代替の方法、より多くの時間がかかりますが、顕微鏡検査は、いくつかの利点を提供しています。最初に、内部および外部で結合したことであるが、内在化しない、粒子は容易にそれぞれ、外部粒子を急冷または標識するために、トリパンブルーまたは抗体など、他の化学物質を追加することなく、区別することができます。それは人口ベースの方法で見落とされてしまう可能性があるのに対し、第二に、リアルタイムで細胞を以下は、研究者が食作用のプロセスの複数の側面移行での同時ので、効果を観察することを可能にすることである粒子を検出し、結合が簡単に、ここで識別されることがあります。さらに、食作用の開始の同期は、多くの場合、コールドショック40,41に他の人身売買のイベントを乱す可能性がある4℃、で細胞を配置することによって行われ、何もありません時間ゼロ、必要に応じてTを直接識別することができます。ライブ顕微鏡を実行するとき確かに、この4℃の同期技術は、客観イマージョンオイルと混合することができる温度シフト中に皿の底に形成結露などの食作用の開始に近い期間をキャプチャする場合に推奨されていません温暖化皿と顕微鏡の構成要素間の温度差が焦点シフトを引き起こす可能性があります。第3の利点はファゴソームを含むいくつかのパラメータに本質的に不均質であるという事実から生じ、それだけには限らないが、pHが42、およびファゴソームのpHに一定の効果ファゴソームpH値の分布ではなく、平均集団を変え、より微妙であるかもしれない、など図3に示された。このような観察 は、ファゴソームのpHの調整に深く機構的洞察を与えることができます。
それがあるので、本研究では、FITCを選択のpH感受性色素として選ばれました安価で、広く利用可能であり、重要なダイナミックレンジは、以前の研究29,30によれば、中性からわずかにアルカリ性の当初の予想pH範囲に一致したその遊離形態37で9のpH 3を網羅して6.5のpKaを有します。野生型およびHvcn1両方のためのより最近の7.5以上の塩基性pKaを有するSNARFと呼ばれる異なるpHプローブを用いた研究では、1~2のpH単位の範囲の予想外に推定pH値よりアルカリ性- / -好中球ファゴソーム39。このように、pHセンサの選択は、用途に応じて考慮すべき重要なパラメータです。原理的には、ここに提示された方法は容易に、例えば、SNARFのような他のpH感受性色素を使用し、2 '、7'-ビス（2-カルボキシエチル）-5-（および-6） - カルボキシフルオレセイン（BCECF）に適合させることができますそのスクシンイミジルエステル誘導体は、容易にこのようなザイモサンなどの粒子を含有するアミンに結合されています。実際、センサがratiometとして、蛍光色素に限定される必要はありませんRIC pH感受性タンパク質は、そのようなサイファー43は 、形質導入し、微生物によって発現させることができました。いくつかの非レシオメトリックの選択肢はまた、緑色蛍光タンパク質（GFP）と組み合わせて使用することができる染料pHrodo、特に赤色のバージョンが存在するタンパク質またはpH感受性タンパク質pHluorinをタグ付き。しかし、厳しいintraphagosomal環境がそこにターゲット染料およびタンパク質に持つことができる潜在的に大きな影響のため、これらのプローブは、疑似比を導出する際に採用されるようにpHが影響を受けないプローブと組み合わせて最小にする必要があります。 図5に例示されるように、較正実験を低減または歪んダイナミックレンジ等の染料の損傷の影響を露光することができます。実用的なノートでは、キャリブレーション実験は必ずしも完全ではなく、すべての実験の後に実行する実行不可能かもしれません。従って、比の値は、時々較正の範囲から外れると、pHに転換により不可能な値を得ることができます。それはapproprすることができますいずれかのiateは「大きい/未満か等しい」の最大値と最小値のキャリブレーションpH値としてこれらのオフ・スケール値を表す、または比率および見積もりのpHとしてすべての値を表現するために、平均比率が表す範囲です。
DPIとコンカコントロールで強調したように、ROS産生とV-ATPase活性は、ファゴソームのpHを決定する主要な要因です。実際、多くの状況では、ROS産生のレベルの変化は、特に好中球、ファゴソームpHの相違の根底にあり、ファゴソームROS産生の測定pHは、しばしば手をつないで行きます。注意の1ワードが両方の薬剤は、彼らがではなく、細胞内でのそれらの場所に阻害酵素の活性への洞察を貸すことです。両方の酵素は、その個々のコンポーネントファゴソーム4、およびファゴソームの活動の欠如へのトラフィックが人身売買やアセンブリの欠陥ではなく、直接的な影響から生じることがなければならないマルチサブユニット複合体です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
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