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Immunology and Infection

Ratiometric प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फेगोसोम पीएच मापने

Published: December 7, 2015 doi: 10.3791/53402
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

Abstract

Phagocytosis सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मारने या बेअसर किया जाता सामग्री, या एंटीजन के रूप में इसे पेश करने और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आरंभ करने के क्रम में बैक्टीरिया, apoptotic कोशिकाओं या अन्य विदेशी कणों अपनी चपेट में ले जिसके माध्यम से एक मौलिक प्रक्रिया है। phagosomes का पीएच endomembranes और एंजाइमों, phagocytic रिक्तिका एक degradative organelle में परिपक्व करने की अनुमति है कि घटनाओं की सक्रियता के साथ विखंडन या संलयन के विनियमन के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। इसके अलावा, एच + की translocation अन्य मेजबान ऊतकों को कुशल हत्या के लिए आवश्यक है और संकेत दे रहे हैं जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), के उच्च स्तर के उत्पादन के लिए आवश्यक है। कई इंट्रासेल्युलर रोगजनकों, phagosomal अम्लीकरण सीमित फेगोसोम जीव विज्ञान में पीएच के महत्व पर प्रकाश डाला द्वारा phagocytic हत्या नाश। यहाँ हम fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) का उपयोग न्यूट्रोफिल में phagosomal पीएच को मापने के लिए एक ratiometric विधि का वर्णन phagocytic Targ रूप zymosan -labeledटिकट, और रहते सेल इमेजिंग। परख 490 एनएम पर उत्साहित है लेकिन जब एक भी डाई की, बल्कि पूर्ण प्रतिदीप्ति की तुलना में, एक पीएच-निर्भर अनुपात की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, 440 एनएम पर उत्साहित नहीं जब अम्लीय पीएच द्वारा बुझती है जो FITC, के प्रतिदीप्ति गुणों पर आधारित है। सीटू डाई अंशांकन और वास्तविक पीएच मान को अनुपात के रूपांतरण में प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान की जाती है। वे इस तरह के विरंजन के रूप में perturbations के कम संवेदनशील होते हैं के रूप में एकल डाई ratiometric तरीकों आम तौर पर, एकल तरंगदैर्ध्य या दोहरे डाई छद्म ratiometric प्रोटोकॉल के लिए बेहतर माना जाता है, मापा संकेत बिगाड़ना परिवर्तन है, जो लेजर विविधताओं, और असमान लेबलिंग, ध्यान केंद्रित। इस विधि को आसानी से अन्य phagocytic प्रकार की कोशिकाओं में पीएच को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और zymosan अक्रिय मोतियों से रहने वाले सूक्ष्मजीवों के लिए, किसी भी अन्य अमाइन युक्त कण से बदला जा सकता है। अंत में, इस विधि अलग पीएच पर्वतमाला या अन्य phagosom के प्रति संवेदनशील अन्य फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताअल गतिविधियों, यह phagosomes के कार्यात्मक इमेजिंग के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल बना रही है।

Protocol

आचार कथन: सभी पशु जोड़तोड़ जिनेवा के विश्वविद्यालय के पशु अनुसंधान समिति के दिशा निर्देशों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया।

Phagocytic लक्ष्य के 1. तैयारी

  1. 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) को सूखे zymosan की 20 मिलीग्राम जोड़ें। 10 मिनट के लिए एक उबलते पानी में स्नान भंवर और गर्मी। 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर कूल और सेंट्रीफ्यूज।
  2. एक पानी के स्नान sonicator में 10 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला, 1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspend और sonicate निकालें। दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए 500 μl स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए 11,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. 500 μl पीबीएस के साथ धोने दोहराएँ। उबला हुआ zymosan स्थिर और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, aliquoted जा सकता है।
  4. हौसले से 3 सीओ 0.1 एम ना 2 तैयार 500 μl, पीएच 9.3 के रूप में ऊपर (1.2 चरण) में दो बार zymosan धो लें।
  5. अंतिम धोने के बाद 490 μl में Resuspend। 10 मिलीग्राम के 10 μl जोड़ें / FITC डाइमिथाइल sulfoxid में भंग मिलीलीटरई (DMSO), भंवर, पन्नी के साथ कवर, और आरटी पर 4 घंटे के लिए आंदोलन के साथ सेते हैं।
  6. पहले 0.5 मिलीलीटर DMSO + 300 μl पीबीएस, तो 0.5 मिलीलीटर DMSO + 450 μl पीबीएस, तो पीबीएस अकेले फिर + 150 μl पीबीएस 0.5 मिलीलीटर DMSO के साथ, ऊपर के रूप में (1.2 चरण) धोने, अपार डाई निकालने के लिए।
  7. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग zymosan गणना। 500 μl पीबीएस, भंवर zymosan की 1 μl जोड़ें, तो यह केंद्रीय ग्रिड पर रखा coverslip मिलता है, जहां रुधिरकोशिकामापी चैम्बर के किनारे करने के लिए 10 μl जोड़ें। एक 20x उद्देश्य से लैस एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर रुधिरकोशिकामापी माउंट।
  8. 16 चौकों युक्त ऊपरी बाएँ हाथ के कोने पर ध्यान दें और एक हाथ मिलान काउंटर का उपयोग कर इस क्षेत्र में सभी zymosan कणों गिनती। निचले दाहिने हाथ कोने से दोहराएँ। = Zymosan एकाग्रता / 2 एक्स 500 एक्स 10 4 zymosan / एमएल गणना: निम्न समीकरण का उपयोग zymosan एकाग्रता की गणना। लेबल zymosan स्थिर और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, aliquoted जा सकता है।
  9. लेबल zymosan वाई Opsonize100 कमजोर पड़ने: 1 पर एक खरगोश विरोधी zymosan एंटीबॉडी वें। भंवर और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1 घंटे के लिए सेते हैं। (1.2 चरण) के ऊपर के रूप में 500 μl पीबीएस के साथ धोएं।
    नोट: zymosan पर बाद में विश्लेषण और अधिक कठिन बना सकते हैं कि गुच्छों के रूप में करने के लिए जाता है के रूप में Sonication अत्यधिक, विशेष रूप से opsonization के बाद, की सिफारिश की है। 65% v / वी चूहे या मानव सीरम के साथ opsonization एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  10. कदम 1.7-1.8 में वर्णित के रूप में एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग zymosan गिनती, और 100 x 10 6 कणों / मिलीलीटर पतला। इस तरह के पूरक या कोई opsonization के रूप में अन्य phagocytic stimulators, साथ opsonization, वैकल्पिक रूप से किया जा सकता है।

2. लाइव वीडियो माइक्रोस्कोपी

  1. कहीं और 38 विस्तार से वर्णित के रूप में प्राथमिक माउस न्यूट्रोफिल अलग।
    1. वैकल्पिक रूप से, किसी भी phagocytic सेल प्रकार का उपयोग करें। रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (वी / वी), 200 यू पेनिसिलिन / streptomyci के साथ पूरक 1640 मध्यम में बर्फ पर न्यूट्रोफिल रखेंएन, 10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में इस्तेमाल के लिए तैयार है जब तक। अन्य प्रकार की कोशिकाओं को 1-4 दिन पहले वरीयता प्राप्त किया जा सकता है।
  2. एक 35 मिमी गिलास नीचे डिश के केंद्र के जीवाणुओं की 2 एक्स 10 5 (20 μl) जोड़ें माध्यम के 50 μl जोड़कर बूंद फैल गया है और कोशिकाओं पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 1 मिलीलीटर विशिष्ट एमपीओ अवरोध करनेवाला 4-aminobenzoic hydrazide (4-ABH, 10 माइक्रोन) युक्त 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम जोड़ें। जैसे सोडियम azide (5 मिमी), के रूप में गैर विशिष्ट एमपीओ निरोधक, भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हाल ही में पीएच 39 पर अतिरिक्त गैर विशिष्ट प्रभाव डालती करने का सुझाव दिया गया है।
  4. एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग सिस्टम और एक 40x तेल उद्देश्य से लैस एक widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर पकवान माउंट। कोशिकाओं और उपकरण संतुलित करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए इमेजिंग के बिना कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. एक उज्ज्वल क्षेत्र संचरण छवि हासिल करने के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स समायोजित [पीएचएएसई या 440 एनएम या 490 एनएम उत्तेजना और 535 एनएम उत्सर्जन हर 30 सेकंड के साथ उपलब्ध है, तो अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी)]।
  6. बहुत ज्यादा photobleaching और phototoxicity और प्रयोगात्मक सवाल के आधार पर कहा जा रहा से बचने के लिए माइक्रोस्कोप प्रणाली के अनुसार जोखिम समय और अधिग्रहण आवृत्ति को समायोजित करें। छवि अधिग्रहण शुरू करो।
  7. 2 मिनट के बाद, 10 एक्स 10 6 (50 μl) FITC-zymosan डिश के केंद्र के opsonized जोड़ें। इस्तेमाल किया भक्षककोशिकीय और लक्ष्य के प्रकार पर निर्भर करता है सेल अनुपात: लक्ष्य को समायोजित करें।
  8. 30 मिनट के लिए इमेजिंग जारी रखें। 30 मिनट के बाद समय चूक अधिग्रहण रोकने के लिए और एक टाइमर शुरू करते हैं। मंच ले जाएँ और सभी 5 मिनट के भीतर, छवि अन्य phagosomes को देखने के विभिन्न क्षेत्रों में 10 या उससे अधिक फोटो पर कब्जा।

3. कैलिब्रेशन और नियंत्रण प्रयोगों

  1. प्रयोग के दिन को (व्यंजनों तालिका 1 में वर्णित हैं) से पहले पीएच अंशांकन समाधान तैयार है और 10 मिलीलीटर aliquots में फ्रीज।नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस तक अंशांकन समाधान और गर्म गला लें। एक पीएच मीटर के साथ पीएच की जाँच करें और समाधान का वास्तविक पीएच रिकॉर्ड है।
  2. प्रायर छवि अधिग्रहण करने के लिए गिलास नीचे पकवान पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप माउंट और (खंड 2) जैसा कि ऊपर वर्णित लाइव वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं।
  3. 30 मिनट के अधिग्रहण की अवधि के अंत में, पकवान के भीतर समाधान निकालने के लिए पंप पर बारी पहली अंशांकन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने और पंप बंद करो।
  4. संकेत आम तौर पर 5 मिनट के स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें। प्रत्येक अंशांकन समाधान के साथ दोहराएँ।
    1. प्रयोगात्मक प्रति दिन कम से कम एक अंशांकन प्रदर्शन, और उच्चतम पीएच के साथ शुरू करने और कम करने के लिए क्रमिक रूप से काम कर रहा है, साथ ही सबसे कम पीएच से शुरू करने और उच्चतम ओर क्रमिक रूप से काम कर रहा जांचना।
  5. एक नियंत्रण के रूप में, गिलास नीचे डिश में 900 μl HBSS में कोशिकाओं को HBSS में पतला 100 माइक्रोन NADPH oxidase अवरोध करनेवाला diphenyl propionium आयोडाइड के 100 μl (डीपीआई) जोड़ने के लिए, और10 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. अधिग्रहण शुरू और (कदम 2.7) के रूप में ऊपर zymosan जोड़ें। Phagocytosis की 15 मिनट के बाद, HBSS में पतला ए (Conca) concanamycin 10 माइक्रोन वी ATPase अवरोध करनेवाला के 10 μl जोड़ सकते हैं और एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इमेजिंग जारी है।

4. विश्लेषण

  1. समय चूक फिल्मों और फेगोसोम फोटो का विश्लेषण।
    नोट: निम्न निर्देश ImageJ के लिए विशिष्ट हैं। कदम दर कदम निर्देश इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, लेकिन इस खंड में वर्णित कार्यों सबसे अधिक पेशेवर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उपलब्ध हैं।
    1. पेशेवर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को खोलें। कोई कोशिकाओं रहे हैं, जहां एक क्षेत्र में वर्ग बहुभुज चयन उपकरण के साथ एक छोटा सा वर्ग रॉय के ड्राइंग, और रॉय से प्लगइन्स> बीजी घटाव पर क्लिक करके 490 चैनल में पृष्ठभूमि घटाना। तब> क्लिक संपादित> सेलेक्शन 440 चैनल पर एक ही लागत पर लाभ को अपलोड चयन और दोहराने पुनर्स्थापित।
    2. तो ऑपरेशन ड्रॉप-डाउन मेनू में 'फूट डालो' का चयन, ... प्रक्रिया> छवि कैलक्यूलेटर पर क्लिक Image1 और Image2 ड्रॉप-डाउन मेनू में उचित छवियों का चयन करके 440 चैनल द्वारा विभाजित 490 चैनल के एक 32-बिट अनुपात छवि बनाओ , और 32-बिट (नाव) परिणाम चेक-बॉक्स की जाँच।
    3. > इंद्रधनुष आरजीबी छवि> देखने सारणी क्लिक करके एक अनुपात संगत रंग-कोडिंग करने के लिए रंग-कोडिंग नज़र सारणी बदलें। थ्रेसहोल्ड अनुपात छवि> दहलीज> छवि पर क्लिक करके 0 और अनंत पिक्सल खत्म करने को समायोजित करने के लिए ...। नेन चेक बॉक्स के लिए सेट पृष्ठभूमि पिक्सल चयन किया जाता है, यकीन है कि zymosan लाल रंग में दिखाई देता है इसलिए पुस्तक सलाखों के समायोजित करें और लागू करें क्लिक करें।
    4. छवि पर क्लिक करके एक मल्टी चैनल समग्र में उज्ज्वल क्षेत्र चैनल के साथ इस अनुपात ढेर गठबंधन> रंग> चैनल मर्ज, और ग्रे चैनल लटकती मेनू में उज्ज्वल क्षेत्र छवि और ग्रीन चैनल लटकती मेनू में अनुपात छवि का चयन, और का चयनचेक-बॉक्स स्रोत चित्रों रखें। समय चूक फिल्मों या phagosomes विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, जो निर्धारित करने के लिए स्नैपशॉट स्कैन करें। उज्ज्वल क्षेत्र चैनल इस के लिए उपयोगी है।
    5. जोड़ें> phagosomes चारों ओर अंडाकार बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों ड्रा, और विश्लेषण> उपकरण> आरओआई प्रबंधक पर क्लिक करके रॉय के प्रबंधक के लिए उन्हें जोड़ने। अधिक> मल्टी उपाय और टुकड़ा चेक-बॉक्स प्रति एक पंक्ति डे के चयन पर क्लिक करके उनकी zymosan तीव्रता के अनुपात को मापने।
    6. समय चूक फिल्मों के लिए, ट्रैक हर समय बिंदु को मापने के लिए Ctrl + M टाइपिंग, एक रॉय ड्राइंग, और समय के साथ तीव्रता मूल्यों को ट्रैक करने के लिए जब आवश्यक लागत पर लाभ ले जाकर एक समय में एक phagosomes। एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में परिणाम विंडो से माप कॉपी करें।
      नोट: स्वतंत्र प्रयोगों 15 (प्रयोग एक्स 3 के अनुसार 5 समय पाठ्यक्रम) का विश्लेषण आदर्श है, लेकिन और अधिक या कम मनाया परिवर्तनशीलता के आधार पर की आवश्यकता हो सकती है। ROIs सहेजा जा रहा है हमेशा की सिफारिश की है। कुछ सॉफ्टवेयर संकुल की अनुमति देने की छवि registration और ROIs के गतिशील अद्यतन, विश्लेषण के इस हिस्से की सुविधा।
  2. प्रतिदीप्ति से पीएच मान के लिए रूपांतरण
    1. धारा 4.1 में वर्णित के रूप में अंशांकन समय चूक फिल्मों में phagosomes के लिए 490/440 अनुपात को मापने।
    2. एक स्प्रेडशीट में, समय के साथ अनुपात मूल्यों की साजिश है, और प्रत्येक पीएच अंशांकन के लिए इसी समय अवधि के बीच के भीतर 5 समय अंक से (5-20 के बीच, आमतौर पर) देखने के क्षेत्र के भीतर सभी phagosomes से औसत अनुपात मूल्यों की गणना समाधान। (यह भी चित्रा 5 ए में लाल बक्से देखें।)
    3. वास्तविक मापा पीएच के खिलाफ इन औसत 490/440 अनुपात मूल्यों प्लॉट। एक ही ग्राफ में कम से कम 3 स्वतंत्र calibrations जुडा है। आमतौर पर एक sigmoidal समीकरण के लिए, एक nonlinear प्रतिगमन (सबसे अच्छा फिट वक्र) प्रदर्शन करने के लिए एक सांख्यिकीय या संख्यात्मक सॉफ्टवेयर पैकेज का प्रयोग करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, चित्रा 5 ब में इस्तेमाल किया समीकरण एक बोल्ट्जमान sigmoidal था [वाई = नीचे + ((ऊपर से नीचे)/ (1 + एक्सप्रेस ((V50-एक्स) / ढलान)) वाई मूल्यों 490/440 अनुपात हैं जहां], एक्स पीएच मान और ऊपर, नीचे, V50 और ढलान मापदंडों के सॉफ्टवेयर से गणना कर रहे हैं।
    4. पीएच के अनुपात मूल्यों को बदलने के लिए प्राप्त समीकरण का प्रयोग करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, चित्रा 5 ब में सोडियम azide की उपस्थिति में अंशांकन वक्र के लिए प्राप्त समीकरण है 490/440 अनुपात = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ एक्सप्रेस ((6.993-पीएच) /0.9291)] । पीएच के लिए हल निम्न समीकरण देता है: पीएच = 6.993-.9291 * [एलएन ((1.178 / (अनुपात 1.103)) - 1))]।

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Representative Results

निम्नलिखित एक प्रयोग के लिए प्रतिनिधि परिणाम हैं जहां जंगली प्रकार या बोन मैरो से अलग प्राथमिक माउस न्यूट्रोफिल की phagosomal पीएच Hvcn1 - / - चूहों की तुलना में थे। एक सफल प्रयोग के लिए, यह बाद में छवि विश्लेषण के दौरान क्षेत्र के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा, जो भी कई phagosomes, से परहेज करते हुए, समय चूक फिल्म की पूरी अवधि के दौरान देखने के क्षेत्र के भीतर पर्याप्त phagosomes प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक से पता चलता है अच्छे और बुरे confluencies के उदाहरण हैं। समय पर निर्भर और स्नैपशॉट विश्लेषण के लिए, बाहरी zymosan कणों phagosomes से प्रतिष्ठित और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। 2 उज्ज्वल क्षेत्र छवि phagosomes से बाहरी zymosan कणों भेद करने में मदद करने के लिए उपयोगी हो सकता है दिखाता है कि कैसे चित्रा। चित्रा 3 ठेठ फेगोसोम के उदाहरण से पता चलता है Hvcn1 की तुलना में जंगली प्रकार में पीएच समय-पाठ्यक्रम - / - चित्रा 4 अम्लीकरण पराजयों जो वी ATPase अवरोध करनेवाला Conca, के अलावा द्वारा पीछा एक तेजी से अम्लीकरण में जो परिणाम NADPH oxidase अवरोध करनेवाला डीपीआई, जोड़ने के प्रभाव दिखाता है। इस तरह के प्रयोगों पीएच के प्रति संवेदनशील जांच रूप में वे चाहिए phagosomes के भीतर काम कर रहे हैं साबित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। एक ठेठ अंशांकन समय पाठ्यक्रम अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल अनुपात मूल्यों की सीमा का संकेत आयतों के साथ, चित्रा 5 में प्रतिनिधित्व किया है। इसके साथ ही इस तथ्य पर प्रकाश डाला, FITC की intraphagosomal पीएच-प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं MPO गतिविधि के माध्यम से क्लोरीनीकरण डाई दिखाता है कि कैसे 5 चित्रा जांच phagoso भीतर होने की उम्मीद की तुलना में अलग तरह से प्रतिक्रिया हो सकती है कि Mal पर्यावरण और सीटू अंशांकन में करने का महत्व।

आकृति 1
चित्रा 1. उपयुक्त confluency और लक्ष्य: सेल अनुपात बाएं पैनल सेल confluency भी विरल और लक्ष्य है, जहां एक उदाहरण दिखाता है:। सेल अनुपात एक phagocytic घटना को देखने के क्षेत्र में हो जाएगा संभावना है कि ह्रासमान, बहुत कम है। मध्यम पैनल सेल confluency बहुत अधिक है और कोशिकाओं भीड़ कर रहे हैं, जहां एक उदाहरण दिखाता है। इन शर्तों के तहत, कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और अपने लक्ष्यों को मिल जाए, या और अधिक कठिन है पर बाद में एक दूसरे को बनाने विश्लेषण पर क्रॉल कर सकते हैं करने के लिए पर्याप्त जगह नहीं हो सकती है। कई कोशिकाओं और लक्ष्यों को देखा गया सकते हैं और अभी तक अभी भी स्पष्ट रूप से एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जहां सेल अनुपात: सही पैनल एक आदर्श सेल confluency और प्रारंभिक लक्ष्य से पता चलता है। FITC-zymosan हरे रंग में दिखाया गया है और बड़े पैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सही पैनल अकेले उज्ज्वल क्षेत्र छवि को दर्शाता है, जबकि चित्रा 2. भेद phagosomes और uningested zymosan। बाएं पैनल, एक विलय उज्ज्वल क्षेत्र छवि और एक 490/440 FITC-zymosan अनुपात से पता चलता है। Phagosomes (छोटे हरे तीर) या तो विशेषता जिसका प्रतिदीप्ति एक अंधेरे केंद्र (लंबी लाल तीर) के साथ मैच नहीं करता है एक उज्जवल अंगूठी से घिरे कोशिकाओं (छोटे लाल तीर) या, के साथ-स्थानीय बनाना सह नहीं है कि, बाहरी कणों से प्रतिष्ठित किया जा सकता उज्ज्वल क्षेत्र छवि (हरी तीर) में phagosomes की। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "ईएनटी चित्र तीन
चित्रा 3. समय पाठ्यक्रम, जंगली प्रकार और Hvcn1 की औसत पीएच और अनुपात histograms - / -। न्यूट्रोफिल phagosomes (ए) phagosomal पीएच की विशिष्ट समय पाठ्यक्रम से पता चलता है कि जंगली प्रकार न्यूट्रोफिल (नीला) में पीएच तटस्थ (बिंदीदार रेखा है, जबकि ) या, Hvcn1 की phagosomes घूस के बाद जल्दी समय अंक दौरान (ठोस लाइन) थोड़ा क्षारीय - / - न्यूट्रोफिल (लाल) या तो alkalinize (ठोस लाइन) या) (बिंदीदार रेखा खट्टा कर सकते हैं। (बी) स्नैपशॉट संकलन लक्ष्यों के अलावा औसत जनसंख्या phagosomal पीएच phagosomes (जंगली प्रकार की एक बड़ी संख्या से गणना करने के लिए अनुमति देता है के बाद 30-35 मिनट लिया: N = 5/1898/383 और Hvcn1 - / -: N = 6 / 1433/451 प्रयोगों / phagosomes / कोशिकाओं, सलाखों ± SEM के साधन), महत्वपूर्ण नहीं एनएस हैं। FITC-zymosa (सी) Histograms/ - - न्यूट्रोफिल एन अनुपात प्रकार के जंगली और Hvcn1 के बीच phagosomal पीएच में मतभेद प्रकट करते हैं। (यह आंकड़ा अनुमति के साथ, [19] से संशोधित किया गया है।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा phagosomal पीएच पर NADPH oxidase अवरोध करनेवाला डीपीआई और वी ATPase अवरोध करनेवाला Conca 4. प्रभाव। 10 माइक्रोन डीपीआई में पूर्व ऊष्मायन 100 एनएम Conca (तीर) के अलावा द्वारा उलट गया था जो शीघ्र ही घूस के बाद phagosomes की एक तेजी से अम्लीकरण, में हुई। (यह आंकड़ा अनुमति के साथ, [19] से संशोधित किया गया है।) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5. पीएच अंशांकन समय पाठ्यक्रम और FITC-zymosan की अंशांकन पर एमपीओ निषेध का प्रभाव। (ए) intraphagosomal FITC-zymosan का एक विशिष्ट पीएच अंशांकन वक्र। लाल बक्से अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल अनुपात मूल्यों की सीमा से संकेत मिलता है। इस्तेमाल किया समाधान और समाधान बदल रहे हैं, जिस पर समय की वास्तविक पीएच मान तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। वक्र देखने के एक ही क्षेत्र के भीतर 10 phagosomes का मतलब प्रतिनिधित्व करता है। गैर विशिष्ट अवरोध करनेवाला सोडियम azide (5 मिमी, एमपीओ Inh) के साथ एमपीओ (बी) निषेध intraphagosomal FITC-zymosan पीएच-निर्भर प्रतिक्रियाओं के गतिशील रेंज बढ़ जाती है। अंक ± SEM के साधन (यह आंकड़ा अनुमति के साथ, [19] से संशोधित किया गया है।) कर रहे हैं एक ला देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की rger संस्करण।

1.1 (2x) बेस
बफ़र स्टॉक अंतिम (1x) 500 मिलीलीटर (2x) के लिए
KCl 1 एम 140 मिमी 140 मिलीलीटर
2 MgCl 1 एम 1 मिमी 1 मिलीलीटर
EGTA 1 एम 0.2 मिमी 0.2 मिलीलीटर
सोडियम क्लोराइड 1 एम 20 मिमी 20 मिलीलीटर
1.2 बफ़र स्टॉक अंतिम(1x) उद्देश्य
एमईएस 1 एम 20 मिमी पीएच 5.5-6.5 के लिए
HEPES 1 एम 20 मिमी पीएच 7.0-7.5 के लिए
Tris 1 एम 20 मिमी पीएच 5.5-6.7 के लिए
Nmdg 1 एम 20 मिमी पीएच 5.5-6.8 के लिए
1.3 Ionophores शेयर (100% EtOH) अंतिम (1x)
Nigericin 5 मिलीग्राम / एमएल 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
Monensin 50 मिमी 5 माइक्रोन
1.4 50 मिलीलीटर के लिए
पीएच 2x बेस बफर प्रकार बफर वॉल्यूम। Nigericin Monensin
5.0 25 मिलीलीटर एमईएस 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
5.5 25 मिलीलीटर एमईएस 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
6.0 25 मिलीलीटर एमईएस 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
6.5 एमईएस 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
7.0 25 मिलीलीटर HEPES 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
7.5 25 मिलीलीटर HEPES 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
8.0 25 मिलीलीटर Tris 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
8.5 25 मिलीलीटर Tris 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
9.0 25 मिलीलीटर Tris 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
9.5 25 मिलीलीटर Nmdg 1 मिलीलीटर 50 μl 5 μl
साथ पीएच को समायोजित करेंकोह या एचसीएल

अंशांकन समाधान तैयार करने के लिए तालिका 1. पकाने की विधि। अंशांकन समाधान में इस्तेमाल किया ionophores तैयार करने के लिए एक 2x आधार समाधान की 500 मिलीलीटर की तैयारी के लिए 1.1) पकाने की विधि। 1.2) अंशांकन समाधान के पीएच के अनुसार इस्तेमाल अलग बफ़र्स की तैयारी के लिए पकाने की विधि। 1.3) पकाने की विधि। 1.4) 50 तैयार करने के लिए पकाने की विधि 1.1-1.3 में वर्णित आधार, buffers और ionophores का उपयोग कर प्रत्येक अंशांकन समाधान के मिलीलीटर।

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Discussion

अधिक समय लक्ष्य के लिए मिलकर एक पीएच संवेदनशील डाई का उपयोग करने का एक समान रणनीति को रोजगार लेकिन phagosomes की आबादी की औसत पीएच उपाय जो इस तरह के स्पेक्ट्रोस्कोपी और FACS के रूप में वैकल्पिक तरीकों, की तुलना में काफ़ी हालांकि, माइक्रोस्कोपी कई लाभ प्रदान करता है। पहला आंतरिक और बाहरी भाँति बाध्य नहीं, बल्कि वह यह है कि कणों को आसानी से क्रमश: बुझाने या बाहरी कणों लेबल करने के लिए, इस तरह के trypan नीले या एंटीबॉडी के रूप में अन्य रसायन, जोड़ने के लिए बिना प्रतिष्ठित किया जा सकता है। दूसरा वास्तविक समय में कोशिकाओं के बाद शोधकर्ताओं ने एक साथ और यह जनसंख्या आधारित विधियों के साथ अनदेखी की जा सकती है, जबकि इतने प्रवास, संवेदन और बाध्यकारी कणों पर प्रभाव को आसानी से, यहां रीति से किया जा सकता है phagocytic प्रक्रिया के कई पहलुओं का निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, phagocytosis की दीक्षा के तुल्यकालन, अक्सर, कोई है कारण ठंड के झटके 40,41 करने के लिए अन्य की तस्करी की घटनाओं उपद्रव हो सकता है, जो 4 डिग्री सेल्सियस, पर रखकर कोशिकाओं द्वारा निष्पादितसमय शून्य के रूप में आवश्यक टी सीधे रीति से किया जा सकता है। लाइव माइक्रोस्कोपी जब प्रदर्शन दरअसल, यह 4 डिग्री सेल्सियस तुल्यकालन तकनीक और उद्देश्य विसर्जन के तेल के साथ मिश्रण कर सकते हैं तापमान पारी के दौरान डिश के तल पर है कि रूपों संक्षेपण के रूप में phagocytosis की दीक्षा के करीब समय की अवधि पर कब्जा यदि अनुशंसित नहीं है वार्मिंग पकवान और माइक्रोस्कोप के घटकों के बीच तापमान मतभेद ध्यान बदलाव का कारण बन सकता है। एक तीसरा लाभ phagosomes के रूप में, सहित कई मापदंडों पर आंतरिक रूप से विषम हैं, लेकिन पीएच 42 तक ही सीमित नहीं है, और फेगोसोम पीएच पर कुछ प्रभाव phagosomal पीएच के बजाय औसत जनसंख्या का वितरण बदल रहा है, और अधिक सूक्ष्म हो सकता है कि इस तथ्य से उपजा 3 चित्र में दिखाया गया था। इस तरह की टिप्पणियों phagosomal पीएच के नियमन में गहरी यंत्रवत अंतर्दृष्टि दे सकता है।

यह इसलिए है क्योंकि वर्तमान अध्ययन में, FITC पसंद का पीएच संवेदनशील डाई के रूप में चुना गया थासस्ती, व्यापक रूप से उपलब्ध है, और महत्वपूर्ण बात यह एक गतिशील रेंज पिछले अध्ययनों 29,30 के अनुसार, थोड़ा alkaline को तटस्थ की मूल रूप से प्रत्याशित पीएच रेंज का मिलान नहीं हुआ है, जो अपने नि: शुल्क फार्म 37 में से 9 पीएच 3 को शामिल के साथ 6.5 के एक pKa है। अभी हाल ही में एक 7.5 की अधिक बुनियादी pKa, दोनों प्रकार के जंगली और Hvcn1 के लिए 1-2 पीएच इकाइयों अधिक क्षारीय लेकर अप्रत्याशित रूप से अनुमान लगाया पीएच मान है जो Snarf नामक एक अलग पीएच जांच, रोजगार एक अध्ययन - / - न्यूट्रोफिल phagosomes 39। इस प्रकार, पीएच सेंसर के चुनाव को आवेदन के आधार पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। सिद्धांत रूप में, यहाँ प्रस्तुत विधि आसानी से ऐसे-bis- 7'Snarf और 2 'के रूप में अन्य पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों, रोजगार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (2 carboxyethyl) -5- (और -6) -carboxyfluorescein (BCECF), जिसका succinimidyl एस्टर डेरिवेटिव आसानी से ऐसे zymosan कणों के रूप में, युक्त अमाइन करने के लिए मिलकर कर रहे हैं। दरअसल, सेंसर ratiomet के रूप में, फ्लोरोसेंट रंगों को सीमित नहीं होना चाहिएरिक पीएच संवेदनशील प्रोटीन, इस तरह के एक SypHer 43, transduced और सूक्ष्मजीवों द्वारा व्यक्त किया जा सकता है। कई गैर-ratiometric विकल्प भी, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जो डाई pHrodo, का विशेष रूप से लाल संस्करण मौजूद प्रोटीन या पीएच के प्रति संवेदनशील प्रोटीन pHluorin -tagged। हालांकि, क्योंकि कठोर intraphagosomal परिवेश उसमें लक्षित रंगों और प्रोटीन पर हो सकता है कि संभावित बड़े प्रभाव के कारण, इन जांच एक छद्म अनुपात पाने में कार्यरत होने की पीएच असंवेदनशील जांच के साथ संयुक्त कम से कम होना चाहिए। चित्रा 5 में उदाहरण के रूप में, calibrations प्रयोगों के लिए एक कम या विकृत गतिशील रेंज के रूप में डाई क्षति के प्रभाव को बेनकाब कर सकते हैं। एक व्यावहारिक पर ध्यान दें, अंशांकन प्रयोगों को हमेशा सही नहीं हैं और हर प्रयोग के बाद प्रदर्शन करने के लिए अव्यावहारिक हो सकता है। नतीजतन, अनुपात मूल्यों कभी कभी अंशांकन की सीमा से बाहर आते हैं और पीएच के लिए रूपांतरण पर असंभव मूल्यों उपज हो सकती है। यह appropr किया जा सकता हैतो देर हो गई अधिकतम और न्यूनतम अंशांकन पीएच मान, या अनुपात और अनुमान पीएच के रूप में सभी मूल्यों को व्यक्त करने के लिए पर्वतमाला "करने के लिए या बराबर अधिक से अधिक / की तुलना में कम-" औसत अनुपात का प्रतिनिधित्व करने वाले के रूप में इन बंद पैमाने मूल्यों व्यक्त करते हैं।

डीपीआई से प्रकाश डाला और Conca नियंत्रण के रूप में, आरओएस उत्पादन और वी ATPase गतिविधि phagosomal पीएच तय है कि प्रमुख कारक हैं। दरअसल, कई स्थितियों में, आरओएस उत्पादन के स्तर में परिवर्तन विशेष रूप से न्यूट्रोफिल में, phagosomal पीएच में मतभेद कायम कर सकते हैं, और phagosomal आरओएस उत्पादन की माप और पीएच अक्सर हाथ में हाथ जाओ। सतर्कता का एक शब्द दोनों दवाओं वे नहीं बल्कि सेल के भीतर अपने स्थान को रोकना एंजाइम की गतिविधि में अंतर्दृष्टि उधार दे रहा है। दोनों एंजाइमों जिसका व्यक्तिगत घटकों phagosomes 4, और phagosomes पर गतिविधि की कमी के कारण यातायात की तस्करी या विधानसभा दोष के बजाय सीधा प्रभाव से हो सकता है चाहिए बहु-सबयूनिट परिसरों हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zymosan A powder Sigma-Aldrich Z4250 Various providers exist
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Various providers exist
Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) Life Technologies Z2850 Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) Santa Cruz sc-204107 Toxic, use gloves, various providers exist
Diphenyleneiodonium chloride (DPI) Sigma-Aldrich D2926 Toxic, use gloves, various providers exist
Concanamycin A (ConcA) Sigma-Aldrich 27689 Toxic, use gloves, various providers exist
Nigericin Sigma-Aldrich N7143 Toxic, use gloves, various providers exist
Monensin Enzo ALX-380-026-G001 Toxic, use gloves, various providers exist
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14200-075 Toxic, use gloves, various providers exist
Hank's balance salt solution Life Technologies 14025092 Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795 Various providers exist
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671  Various providers exist
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375 Various providers exist
N-Methyl-D-glucamine (NMDG) Sigma-Aldrich M2004  Various providers exist
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich 3777 Various providers exist
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503  Various providers exist
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333 Various providers exist
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Various providers exist
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266 Various providers exist
Absolute Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 2860 Various providers exist
Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) World Precision Instruments FD35-100 Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted
Sonicating water bath O. Kleiner AG A sonicator may be used instead, various instrument providers exist
Heamocytometer Marienfeld GmbH Various instrument providers exist
Widefield live imaging microscope Carl Zeiss AG Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.  
Peristaltic pump (Dynamax RP-1) Rainin Various instrument providers exist
pH meter Schott Gerate GmbH Various instrument providers exist
Manual Counter Milian SA Various instrument providers exist

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इम्यूनोलॉजी अंक 106 Phagocytosis अम्लीकरण अम्लता पीएच ratiometric इमेजिंग कार्यात्मक इमेजिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी न्यूट्रोफिल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों
Ratiometric प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फेगोसोम पीएच मापने
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Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (106), e53402, doi:10.3791/53402 (2015).

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