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Biology

एक सेल फ्री परख बँटवारा के अंत में Chromatin Decondensation अध्ययन करने के लिए

Published: December 19, 2015 doi: 10.3791/53407
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Introduction

Xenopus laevis अंडे निकालने के एक सेल मुक्त परख की सादगी में जटिल सेलुलर घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से लागू उपकरण है। Lohka और Masui 1 से उनकी पहली वर्णन के बाद से वे बड़े पैमाने पर इस तरह के क्रोमेटिन संक्षेपण 2, धुरी विधानसभा 3, परमाणु लिफाफा टूटने 4, लेकिन यह भी nucleocytoplasmic परिवहन 5 या डीएनए प्रतिकृति के रूप में 6 mitotic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तरह के परमाणु लिफाफा सुधार और परमाणु ताकना जटिल दुबारा जोड़ना रूप interphasic नाभिक के सुधार के लिए आवश्यक बँटवारा के अंत में हो रही घटनाओं, जल्दी mitotic घटनाओं की तुलना में समझ बहुत कम कर रहे हैं, लेकिन इसी तरह Xenopus अंडे निकालने 7 का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। हमने हाल ही में बँटवारा 8 के अंत में क्रोमेटिन decondensation अध्ययन करने के लिए Xenopus अंडे निकालने पर आधारित एक परख की स्थापना की है, एक के तहत जांच की प्रक्रिया मैं इंतजार कर रहा है किविस्तृत लक्षण वर्णन टीएस।

मेटाजोअन में, क्रोमेटिन अत्यधिक आनुवंशिक सामग्री की ईमानदारी से अलगाव प्रदर्शन करने के क्रम में mitotic प्रविष्टि पर सघन है। क्रोमेटिन अंतरावस्था दौरान जीन अभिव्यक्ति और डीएनए प्रतिकृति के लिए सुलभ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, यह बँटवारा के अंत में डी-जमा होने की जरूरत है। रीढ़ में, क्रोमेटिन अप करने के लिए, mitotic संघनन आमतौर पर बहुत कम है जहां खमीर के विपरीत, एस में जैसे, केवल दो गुना अंतरावस्था 9 की तुलना में बँटवारा के दौरान और अधिक ठोस पचास गुना है cerevisiae 10। कशेरुकी क्रोमेटिन decondensation ज्यादातर अंडे के निषेचन के बाद शुक्राणु डीएनए पुनर्गठन के संदर्भ में अध्ययन किया गया है। एक आणविक तंत्र, जो nucleoplasmin, एक प्रचुर मात्रा में डिम्बाणुजनकोशिका प्रोटीन में, अंडे में संग्रहीत histones H2A और H2B के लिए शुक्राणु विशेष protamines बाजारों। इस प्रक्रिया को भी Xenopus अंडे निकालने 11, 12 का उपयोग करते हुए स्पष्ट किया गया था। हालांकि, अभिव्यक्तिnucleoplasmin के इन शुक्राणु विशेष protamines शामिल नहीं है oocytes 13 और mitotic क्रोमेटिन तक सीमित है। इसलिए बँटवारा के अंत में decondensation chromatin 8 स्वतंत्र nucleoplasmin है।

इन विट्रो decondensation प्रतिक्रिया के लिए हम सिंक्रनाइज़ हेला कोशिकाओं से अलग सक्रिय एक्स laevis अंडे और क्रोमेटिन समूहों से उत्पन्न निकालने रोजगार। एक कैल्शियम ionophore के साथ अंडे का उपचार निषेचन के दौरान शुक्राणु प्रवेश द्वारा उत्पन्न डिम्बाणुजनकोशिका में कैल्शियम रिहाई mimics। कैल्शियम लहर पहले अंतरावस्था 14 की प्रगति, अर्धसूत्रीविभाजन के दूसरे metaphase में गिरफ्तार सेल चक्र बहाली और अंडा, हो सके। इसलिए, प्रपत्र सक्रिय अंडे तैयार अंडा अर्क mitotic बाहर निकलें / अंतरावस्था राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्रोमेटिन decondensation, परमाणु लिफाफे की तरह mitotic बाहर निकलने के लिए विशिष्ट घटनाओं के लिए प्रेरित करने में सक्षम हैं और जटिल सुधार ताकना। Mitotic चर्चा के अलगाव के लिएसमूहों romatin हम गुणसूत्र समूहों हेला कोशिकाओं बँटवारा में सिंक्रनाइज़ और ढाल centrifugations द्वारा polyamine युक्त बफ़र्स में अलग से सेल द्वारा जारी किया जाता है, जहां Gasser और Laemmli 15, द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल का एक थोड़ा संशोधित संस्करण का इस्तेमाल किया।

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Protocol

हेला कोशिकाओं से mitotic Chromatin क्लस्टर अलगाव

1. तैयारी

  1. सेल संस्कृति समाधान
    1. DMEM के लिए 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी glutamine जोड़कर पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) तैयार करें। 2.7 मिमी KCl, 137 मिमी NaCl, 10 मिमी ना 2 2H 2 हे 4 HPO और 10 एन NaOH के साथ 7.4 के लिए 2 मिमी 2 के.एच. विआयनीकृत पानी में पीओ 4, और समायोजित पीएच युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) तैयार करें।
      नोट: पीबीएस आरटी पर समय के साथ 10x शेयर समाधान के रूप में रखा जा सकता है। उपयोग करने से पहले 1x करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ पतला। यह सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया जाएगा, तो फिर 1x समाधान फ़िल्टर।
    2. DMEM माध्यम में thymidine समाधान (उपयुक्त सेल संस्कृति) की एक 40 मिमी स्टॉक तैयार करें। DMEM माध्यम के 90 मिलीलीटर में 0.97 जी thymidine भंग। 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। -20 डिग्री पर स्टोर शेयर समाधानसी (! चेतावनी रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं, दस्ताने और मुंह संरक्षण पहनते) भंग DMSO में एक 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान करने के लिए nocodazole।
  2. Mitotic क्लस्टर अलगाव समाधान
    नोट: 1.2 में वर्णित सभी समाधान पूरे प्रयोग के दौरान तैयारी / विगलन के बाद बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    1. 121 डिग्री सेल्सियस पर 105 मिनट के लिए आटोक्लेव विआयनीकृत पानी। 200 मिमी (69.6 मिलीग्राम / एमएल) की एक अंतिम एकाग्रता autoclaved, विआयनीकृत पानी में spermine tetrahydrochloride भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर समाधान। 200 मिमी (50.8 मिलीग्राम / एमएल) की एक अंतिम एकाग्रता autoclaved, विआयनीकृत पानी में spermidine trihydrochloride भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर समाधान।
    2. गर्म, विआयनीकृत पानी में (दस्ताने और मुंह संरक्षण पहनते हैं,! चेतावनी रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं) 5% (w / v) digitonin तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर और दुकान aliquots। Phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) (चेतावनी भंग! Unde कामआर रासायनिक डाकू, 100% इथेनॉल में 200 मिमी (35 मिलीग्राम / एमएल) के अंतिम एकाग्रता के लिए दस्ताने और मुंह संरक्षण) पहनते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर समाधान।
    3. 1 एम (154 मिलीग्राम / एमएल) के अंतिम एकाग्रता के लिए विआयनीकृत पानी के साथ dithiothreitol (डीटीटी) भंग (चेतावनी! दस्ताने पहनते हैं, रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं)। -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर और दुकान शेयर समाधान।
    4. (-) - 4 (2-Aminoethly benzensulfonylfluoride) 10 मिलीग्राम / एमएल AEBSF भंग द्वारा (! दस्ताने पहनते हैं, सावधानी रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं) एक 100 गुना protease अवरोध मिश्रण तैयार करें, 0.2 मिलीग्राम / एमएल leupeptin, 0.1 मिलीग्राम / एमएल pepstatin विआयनीकृत पानी में और 0.2 मिलीग्राम / एमएल aprotinin। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर समाधान।
    5. बफर के एक 10x शेयर समाधान तैयार एक 150 मिमी Tris सीएल (7.4 पीएच), 800 मिमी KCl, 20 मिमी EDTA-कोह (7.4 पीएच), 2 मिमी spermine tetrahydrochloride और 5 मिमी spermidine trihydrochloride युक्त। स्टोर बफर एक जोड़ा जाना चाहिए जो spermine tetrahydrochloride और spermidine trihydrochloride बिना 4 डिग्री सेल्सियस, परहौसले से बस से पहले का उपयोग करें।
      नोट: EDTA ही, एक उच्च केंद्रित EDTA-कोह शेयर समाधान (अनुशंसित 0.5 एम) तैयार इसे भंग करने के लिए सिर्फ 8 ऊपर पीएच को 5 एन कोह को जोड़ने के लिए है, इसलिए, 8 की तुलना में अधिक PHS में घुल। बाद में पीएच 7.4 से नीचे titrate।
    6. 100 मिमी Tris एचसीएल (7.4 पीएच), 400 मिमी KCl, 400 मिमी EDTA-कोह (7.4 पीएच) और 5 मिमी spermidine trihydrochloride युक्त के रूप में बफर के एक 20x शेयर समाधान तैयार है। बफर के रूप में बफर ए के रूप में एक ही परिस्थितियों में संग्रहित किया जा सकता
      नोट: सिर्फ अलगाव से पहले हौसले मैं चतुर्थ करने के लिए (निम्न चरणों में देखें) काम कर समाधान, ग्लिसरॉल ढाल और गैर dialyzable polyvinylpyrrolidone (पीवीपी) के साथ लेपित सिलिका कणों (15 से 30 एनएम व्यास) युक्त कोलाइडयन सिलिका के कण समाधान तैयार प्रक्रिया (PMSF जलीय समाधान में अस्थिर है और digitonin बर्फ पर लंबी अवधि के भंडारण पर वेग के लिए जाता है के रूप में PMSF और digitonin उपयोग करने से पहले सीधे जोड़ा जाना चाहिए)।
    7. 0.5x बफर जोड़कर समाधान मैं की 100 मिलीलीटर की तैयारी,1 मिमी डीटीटी, 1: autoclaved, विआयनीकृत पानी में protease अवरोध मिश्रण और 0.1 मिमी PMSF के 100। 1x बफर जोड़कर (सेल के लिए) समाधान द्वितीय की 50 मिलीलीटर की तैयारी, 1 मिमी डीटीटी, 1: protease अवरोध मिश्रण के 100, 0.1 मिमी PMSF, autoclaved, विआयनीकृत पानी में 0.1% digitonin और 10% ग्लिसरॉल।
    8. Autoclaved, विआयनीकृत पानी में protease अवरोध मिश्रण के 100, 0.1 मिमी PMSF और 0.05% digitonin: 200 समाधान तृतीय युक्त 0.25x बफर के मिलीलीटर, 1 मिमी डीटीटी, 1 की तैयारी। 1x बफर युक्त समाधान चतुर्थ के 40 मिलीलीटर की तैयारी 1 मिमी डीटीटी, 1, के रूप में: protease अवरोध मिश्रण के 100, 0.1 मिमी PMSF और autoclaved, विआयनीकृत पानी में 0.1% digitonin।
    9. समाधान मैं करने के लिए 25% ग्लिसरॉल और 0.1% digitonin जोड़कर ग्लिसरॉल ढाल समाधान की 120 मिलीलीटर की तैयारी
    10. गैर dialyzable polyvinylpyrrolidone (पीवीपी), 15% ग्लिसरॉल, 2 मिमी एस के साथ लेपित एक निलंबन युक्त सिलिका कणों (15 से 30 एनएम व्यास) का 60% वी / वी (मात्रा प्रति मात्रा) युक्त कोलाइडयन सिलिका के कण समाधान के 150 मिलीलीटर की तैयारीpermidine trihydrochloride और समाधान चतुर्थ में 0.8 मिमी spermine tetrahydrochloride।
    11. Protease अवरोध मिश्रण के 100, 0.3% BSA और 30% ग्लिसरॉल: 250 मिमी सुक्रोज, 15 मिमी Hepes (पीएच 7.4), 0.5 मिमी spermidine trihydrochloride, 0.2 मिमी spermine tetrahydrochloride, 1 युक्त क्लस्टर भंडारण बफर तैयार करें। क्लस्टर भंडारण बफर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
    12. 50% ग्लिसरॉल, (दस्ताने पहनते हैं, रासायनिक हुड के तहत काम करते हैं! चेतावनी) 10% formaldehyde युक्त स्क्वैश तय समाधान तैयार मार्क संशोधित Ringers बफर दुगना (एमएमआर 4.5 देखें।) और 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (चेतावनी! दस्ताने पहनते हैं)। प्रकाश संरक्षित प्रतिक्रिया ट्यूबों में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। प्रयोग इस स्क्वैश तय नुस्खा का उपयोग करने के लिए यह महत्वपूर्ण नहीं है, वैकल्पिक बनाने की विधि भी काम करेंगे।

प्रकोष्ठों के 2. तुल्यकालन

  1. पर दिन 1: पाँच 75 सेमी 2 (250 मिलीलीटर) में बीज हेला कोशिकाओं मीडिया के साथ बोतल और 5% सी में 37 डिग्री सेल्सियस पर यह सेतेहे 2।
    नोट: इस क्रोमेटिन क्लस्टर अलगाव के दिन में लगभग 18 x 10 6 कोशिकाओं में निकलेगा।
  2. 2 दिन: कोशिकाओं में कम से कम 50% मिला हुआ है जब (मोटे तौर पर सतह के आधे कोशिकाओं द्वारा कवर किया जाता है और विकसित करने के लिए कोशिकाओं के लिए कमरे में अभी भी है), एक अंतिम 2 मिमी (thymidine ब्लॉक) की एकाग्रता और संस्कृति की कोशिकाओं के लिए करने के लिए thymidine जोड़ने 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा।
    नोट: इस G1 / एस चरण सीमा पर कोशिकाओं गिरफ्तारी होगी।
  3. 3 दिन: महाप्राण मध्यम thymidine युक्त और बाँझ पीबीएस जोड़ने। बाँझ पीबीएस के साथ नाजुक rinsing द्वारा कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण पीबीएस और धीरे सीओ 2 G1 / एस चरण ब्लॉक से उन्हें रिहा करने के लिए 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा 4 के लिए ताजा, गर्म पूरा DMEM मध्यम और संस्कृति कोशिकाओं के 15-20 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. 3 दिन (निरंतरता) पर: G1 / एस चरण ब्लॉक से कोशिकाओं को जारी करने के बाद, 100 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए nocodazole जोड़ें। 98 शेयर समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) के 2 μl जोड़कर nocodazole पतलाताजा DMEM माध्यम के μl, और सेल संस्कृति के प्रत्येक मिलीलीटर प्रति nocodazole पतला के 1 μl जोड़ें। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 12 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं। यह बँटवारा में कोशिकाओं को रोकेंगे।

3. mitotic क्लस्टर अलगाव

  1. 4 दिन: mitotic समूहों को अलग। कोशिकाओं के बहुमत mitotic रहे हैं अगर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, जाँच करें। कोशिकाओं के कम से कम 50% mitotic इंतजार कर रहे हैं और अधिक कोशिकाओं बँटवारा तक पहुंचने तक। कुप्पी (या धीरे विंदुक के साथ छिड़काव द्वारा) के पक्ष में सख्ती दोहन से mitotic कोशिकाओं लीजिए, इस शेष mitotic कोशिकाओं अलग होगा। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण।
    नोट: mitotic कोशिकाओं फ्लैट और मजबूती कुप्पी से जुड़े होते हैं, जो अन्य सेल चक्र के चरणों में कोशिकाओं के विपरीत, गोल हो जाते हैं और आसानी से (सिर्फ trypsinization के बाद कोशिकाओं की तरह) कुप्पी नीचे से अलग किया जा सकता है।
  2. (10 मिनट के लिए 1,500 XG पर नलियों कताई द्वारा 4 mitotic कोशिकाओं फसल76, सी या आर टी) और बाद में सतह पर तैरनेवाला हटाने। , एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल 8 मिलीग्राम पीबीएस में गोली, पूल Resuspend पूरी तरह से पीबीएस के साथ ट्यूब भरने और 1500 x जी पर 10 मिनट के लिए फिर से स्पिन। कुल में इस कपड़े धोने की प्रक्रिया तीन बार दोहराएँ।
  3. अब से ठंड के समाधान के साथ बर्फ पर सभी चरणों का प्रदर्शन करते हैं। सख्ती ठंड समाधान द्वितीय के 37 मिलीलीटर में गोली resuspend। Mitotic समूहों साइटोप्लास्मिक सामग्री के लिए स्वतंत्र हैं, जब तक एक तंग मूसल के साथ douncing से बर्फ पर एक 25 मिलीलीटर पिपेट और ल्य्से कोशिकाओं का उपयोग कर एक ठंडा 40 मिलीलीटर गिलास कांच homogenizer के लिए निलंबन स्थानांतरण। स्ट्रोक की संख्या digitonin शेयर पर अत्यधिक निर्भर है और 3 से 20 गुना से भिन्न हो सकते हैं।
    नोट: Homogenization काफी जोरदार हो सकता है, लेकिन लगभग सभी mitotic कोशिकाओं lysed रहे हैं और समूहों (3.4 देखें) साइटोप्लास्मिक सामग्री से मुक्त होने के लिए देखा जाता है जब पूरा विचार किया जाना चाहिए।
  4. Trypan नीले रंग के साथ 2 और माइकर द्वारा जाँच: स्ट्रोक के एक जोड़े सेल निलंबन 1 की 5-10 μl मिश्रण के बादएक Neubauer कक्ष में oscopy। जब कोशिकाओं lysed रहे हैं क्रोमेटिन नीले और कोशिका झिल्ली के मुफ्त (: संभव साइटोप्लास्मिक अवशेष नीला दाग क्रोमेटिन के आसपास जमा हो जाएगा और अलग करने के लिए आसान हो जाएगा नोट) दाग है।
    नोट: mitotic कोशिकाओं interphasic कोशिकाओं से पहले lyse लेकिन फिर भी interphasic नाभिक और घायल क्रोमेटिन साथ संक्रमण से बचने के क्रम में एकरूपता ज़्यादा नहीं सावधान रहना होगा।
  5. इसके तत्काल बाद 28.8 x 107.0 मिमी, यह करने के लिए सिफारिश की है पाँच पॉली कार्बोनेट centrifugation ट्यूब (में (ग्लिसरॉल ढाल समाधान प्रत्येक की 19.5 मिलीलीटर के साथ मढ़ा तल पर 60% कोलाइडयन सिलिका के कण समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ) ठंड कदम gradients पर पूरे सेल lysate परत एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग) उन्हें शांत करने के लिए पहले बर्फ पर ट्यूबों की जगह। एक लंबे समय के लिए समाधान द्वितीय में कोशिकाओं को न रखें, इस प्रकार यह (वाशिंग चरणों के दौरान, उदाहरण के लिए) पहले से ट्यूब और ढाल तैयार करने के लिए सिफारिश की है।
  6. 30 मील के लिए ढ़ाल अपकेंद्रित्रn एक निश्चित कोण रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर।
    नोट: नाभिक, unlysed कोशिकाओं और समूहों ग्लिसरॉल के इंटरफेस और कोलाइडयन सिलिका के कण परतों में एक साथ बरामद कर रहे हैं।
  7. एक विंदुक का उपयोग अंतरावस्था ऊपर तरल निकालें और ठंड homogenizer के लिए बाकी के हस्तांतरण। तंग मूसल के साथ 3-15 स्ट्रोक (फिर digitonin शेयर पर निर्भर करता है) द्वारा फिर से Homogenize मिश्रण समुच्चय को खत्म करने और समूहों से cytoskeletal फाइबर हटाने के लिए। स्ट्रोक के हर जोड़े के बाद homogenization की दक्षता की जांच। DAPI के साथ पूरक स्क्वैश तय की 1 μl के साथ नमूने के 1 μl मिक्स और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की जांच।
    नोट: स्ट्रोक की संख्या महत्वपूर्ण है, क्लस्टर की उपस्थिति घायल क्रोमेटिन और नाभिक मलबे homogenization भी मजबूत था कि संकेत मिलता है जबकि स्ट्रोक की संख्या अपर्याप्त है, इसका मतलब है कि समुच्चय।
  8. (28.8 x चार नए पॉली कार्बोनेट centrifugation ट्यूबों के बीच समाधान बांटो107.0 मिमी) (लगभग। 10 मिलीलीटर ट्यूब प्रति समाधान) और पूरी तरह से 60% कोलाइडयन सिलिका के कण समाधान के साथ उन्हें भरने (लगभग। 30 मिलीलीटर ट्यूब प्रति कोलाइडयन सिलिका के कण समाधान)।
    नोट: ढाल में बहुत ज्यादा साइटोप्लास्मिक मलबे अगर वहाँ समूहों आसानी से फंस जा सकता है के बाद से कोलाइडयन सिलिका के कण ढाल लदान से बचें।
  9. एक निश्चित कोण रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 45,440 XG पर 30 मिनट के द्वारा पीछा 3,000 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन।
    नोट: जैसा कि पहले, interphasic नाभिक (homogenization साइटोप्लास्मिक मलबे से नाभिक विज्ञप्ति जो भी भारी नहीं किया गया था, तो), लेकिन समूहों अक्सर एक ढीली गेंद के रूप में, ट्यूब के नीचे से लगभग 1.5 सेमी जमा करेंगे ढाल में प्रवेश करने से रखा जाएगा।
  10. एक विंदुक का उपयोग समूहों ऊपर तरल निकालें, resuspend खैर, एक ट्यूब में बाकी पूल और दो पॉली कार्बोनेट centrifugation ट्यूब (28.8 x 107.0 मिमी) को फिर से विभाजित। प्रत्येक ट्यूब में समाधान III के साथ 4 और अच्छी तरह मिला लें: क्लस्टर निलंबन 1 पतला। मार्क वेंई साइट गोली हो सकता है और एक निश्चित कोण रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1,000 XG स्पिन जाएगा थे।
  11. समाधान III में छर्रों Resuspend एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूल और समाधान III के साथ भरें। लगभग 10 मिनट के लिए केवल 300 XG पर अपकेंद्रित्र। उच्च वेग पर अपकेंद्रित्र नहीं है - यह समूहों के अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण का कारण बन सकता है।
  12. 1.5 या 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में समाधान III के साथ फिर से धोना (छर्रों resuspend और पूरी तरह से ट्यूबों को भरने) 300 x जी पर और सेंट्रीफ्यूज। एक विंदुक के साथ ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें। ध्यान से 250 μl क्लस्टर भंडारण बफर में resuspend गोली (आप कई छर्रों एक साथ सभी के लिए 250 μl का उपयोग करें और उन्हें पूल है)। Trypan नीले रंग के साथ 2 और Neubauer कक्ष में गिनती: नमूना 1 की 5-10 μl पतला। लागू पतला अधिक हैं / μl 500 समूहों की एक अनुमानित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए।
  13. बनाने के लिए एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से निलंबन पुश क्लस्टर एकत्रीकरण को दूर करने के लिए सुनिश्चित करेंअनुचित मेजबान से उत्पन्न है। समूहों -80 डिग्री सेल्सियस में महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। कई refreezing उचित aliquots बनाने के लिए और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज तस्वीर से बचने के लिए।

Interphasic Xenopus के लिए बफर 4. तैयारी अंडा निकालें laevis

नोट: Xenopus मेंढ़कों बनाए रखा और (1998 में पुष्टि की ईयू) प्रयोगात्मक और अन्य उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल कशेरुकी जीवों के संरक्षण पर यूरोप की परिषद के सम्मेलन द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार व्यवहार और जर्मन कानून से संबंधित रहे हैं laevis अनुसंधान के क्षेत्र में कशेरुकी जीवों का उपयोग करें।

  1. डीटीटी और 1.2.3 और 1.2.4 के अनुसार एक सौ गुना protease अवरोध मिश्रण तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम (अनुशंसित 10 या 20 μl) 10 मिलीग्राम / DMSO में मिलीलीटर, विभाज्य की एकाग्रता और स्टोर करने के cytochalasin बी भंग।
  2. (इथेनॉल, विभाज्य में 20 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 500 μl cycloheximide भंग-20 डिग्री सेल्सियस पर की सिफारिश की) और दुकान। -20 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल, विभाज्य और दुकान में 2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए कैल्शियम ionophore A23187 भंग।
    नोट: पीआई, डीटीटी, cytochalasin बी, cycloheximide और A23187 बार-बार स्थिर और thawed जा सकता है।
  3. मिमी CaCl 2, 2 मिमी EDTA और 100 मिमी HEPES, 5 एन KOH के साथ 8.0 पीएच को समायोजित 40 2 एम NaCl, 40 मिमी KCl, 20 मिमी 2 MgCl युक्त 20x मार्क संशोधित Ringers बफर (एमएमआर) तैयार करें।
    नोट: 20x एमएमआर आरटी पर लंबे समय के साथ रखा जा सकता है। 1x इंजेक्ट मेंढक प्रति एमएमआर और धोने कदम के लिए एक अतिरिक्त 5-10 लीटर की interphasic अंडा निकालने 1 एल में से एक तैयारी के लिए, अंडे की मात्रा पर निर्भर करता है जरूरी हैं। 5 एन KOH के साथ 8.0 के लिए 1x एमएमआर का पीएच फिर से समायोजित। 1x एमएमआर हे में मेंढकों को रखने के लिए तैयार / एन आर टी पर होना चाहिए 1 एक्स। यह प्रयोग किया जाता है जब तक निकालने की तैयारी के लिए तैयार 1x एमएमआर लेकिन यह 1x एमएमआर वास्तव में ठंडा है कि प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, ठंड रखा जाना चाहिए।
  4. सफलता के 1 एल तैयार250 मिमी सुक्रोज, 50 मिमी KCl, 2.5 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी HEPES पीएच 7.5 से युक्त बफर गुलाब। सुक्रोज बफर बाँझ पानी का उपयोग कर एक दिन पहले तैयार किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
  5. 0.25x एमएमआर में 2% एल cystein भंग द्वारा प्रयोग की सुबह हौसले dejellying समाधान तैयार है। 5 एन KOH के साथ 7.8 पीएच को समायोजित करें। यह प्रयोग किया जाता है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. Protocolfor Interphasic Xenopu एस laevis अंडे निकालें

  1. 3-10 दिनों के प्रयोग (5 मिलीलीटर सीरिंज, 27 जी ¾ '' सुई) से पहले प्रत्येक मेंढक के पृष्ठीय लसीका थैली में 120 आईई गर्भवती घोड़ी का सीरम गोनाडोट्रोपिन (PMSG) इंजेक्षन।
    नोट: इस इंजेक्शन ovulation प्रेरित करेगा। एक मेंढक देता अंडे की मात्रा बहुत भिन्न होता है। एक अच्छी तरह से बिछाने मेंढक ऊपर कच्चे तेल निकालने की मिलीलीटर 3.5 से मेल खाती है, जो डी-jellynated होने के बाद 7 मिलीलीटर की मात्रा को कब्जे में अंडे का उत्पादन हो सकता है। हालांकि, कुछ मेंढ़क ला रखना होगा या नहीं भी हो सकता है कि विचारY बुरा अंडे।
  2. प्रयोग (5 मिलीलीटर सीरिंज, 27G ¾ '' सुई) से पहले मेंढक प्रति 500 ​​आईई मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) शाम इंजेक्षन। इस अंडे की रिहाई के लिए प्रेरित करेगा। 1.2 एल 1x एमएमआर (पीएच 8) युक्त व्यक्ति टैंक में 18 डिग्री सेल्सियस पर 13-17 घंटे के लिए मेंढ़क रखें।
  3. 600-1,000 मिलीलीटर कांच बीकर में उन्हें गिरने से अंडे ले लीजिए।
    नोट: आकार में इसी तरह के और स्पष्ट रूप से एक अंधेरे और एक हल्के रंग का आधा साथ pigmented अलग-अलग रखी हैं कि अंडे का केवल अच्छा बैचों ले लो। तार या कि देखो झोंके और सफेद कि फार्म अंडे मत लो। ये एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग पूरी प्रक्रिया के दौरान बाहर हल किया जाना चाहिए। बुरा बनाम अच्छा अंडे की एक विस्तृत वर्णन के लिए गिलेस्पी एट अल देखते हैं। 6
  4. अंडे नीचे बसे है जब सतह पर तैरनेवाला decanting और बाद में ताजा बफर के साथ बीकर refilling से, अधिकता 1x एमएमआर के साथ लगभग 4 बार, अंडे धो लें।
    ध्यान देंवे dejellynated कर रहे हैं और वाशिंग बफर सीधे अंडे पर लागू किया जा सकता से पहले अंडे स्थिर रहे हैं।
  5. 2% cystein समाधान में ऊष्मायन द्वारा अंडे Dejellynate। बफर decanting और ध्यान से ताजा बफर के साथ बीकर भरने के द्वारा एक बार 2-4 मिनट के बाद बफर बदलें। पूरा Considerdejellying अंडे की मात्रा काफी कम हो जाती है और अंडे अधिक घनी पैक हो जाते हैं।
    नोट: dejellying लगभग 5-7 मिनट की जरूरत है और जब दिखाई लेकिन 10 मिनट के बाद नवीनतम रोका जाना चाहिए।
  6. Decanting और बफर सतह पर तैरनेवाला refilling द्वारा 1x एमएमआर के साथ धो अंडे लगभग 4 गुना।
    नोट: अंडे इसलिए, वाशिंग चरणों अधिक सावधानी से किया जाना चाहिए, dejellynated होने के बाद और अधिक कमजोर हैं और। एमएमआर बल्कि अंडे पर बजाय सीधे बीकर की दीवार पर rinsed होना चाहिए।
  7. कैल्शियम ionophore (इथेनॉल में 2 मिलीग्राम / एमएल) के 8 μl जोड़कर मिलीलीटर 1x एमएमआर 100 में अंडे को सक्रिय करें। पशु टोपी संकुचन होना जब सक्रियण बंद करोदृश्य या 10 मिनट के बाद आता है।
    नोट: पशु टोपी संकुचन अंडे के काले छमाही के संघनन से पहचाना जा सकता है।
  8. Decanting और बफर सतह पर तैरनेवाला refilling द्वारा 1x एमएमआर के साथ सावधानी से 4 बार धोएं।
  9. आरटी पर 1x एमएमआर में 20 मिनट के लिए अंडे सेते हैं।
  10. ऊष्मायन समय के दौरान centrifugation ट्यूबों तैयार: जगह 50 μl सुक्रोज बफर, 50 μl 100 गुना protease अवरोध मिश्रण, 5 μl 1 एम डीटीटी, 12.5 μl cycloheximide और 2.5 μl cytochalasin बी (विशेष रूप से cyclin बी की, अनुवाद को रोकने के लिए) (के लिए 5 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब (13 x 51 मिमी) में actin polymerization) को रोकने के। वैकल्पिक रूप से, अंडे की अधिक से अधिक 30 मिलीलीटर के लिए, 14 मिलीलीटर ट्यूब (14 x 95 मिमी) 2.4 गुना से इस मामले वृद्धि की मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  11. (कांच बीकर में छानना और फिर से भरना बफर) ठंड सुक्रोज बफर के साथ दो बार अंडे धो और विस्तृत खोलने (संकीर्ण अंत काट) के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग centrifugation ट्यूबों में उन्हें स्थानांतरित।
  12. पैक130 x जी पर 1 मिनट के लिए कताई द्वारा अंडे। (क्रमश: 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 14 मिलीलीटर ट्यूबों डाल) इस उद्देश्य के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में ट्यूब डाल दिया। निकालने के कमजोर पड़ने से रोकने के लिए संभव के रूप में लक्ष्य के रूप में ज्यादा बफर दूर करने के लिए है। Centrifugation के बाद, एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग बफर से अधिक दूर है और अंत में शीर्ष पर अधिक अंडे भरें।
  13. एक 6 x 5 मिलीलीटर में स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 XG पर 20 मिनट के लिए रोटर झूले।
  14. तल में शीर्ष पर पीले रंग की जर्दी और अंधेरे टूट अंडा मलबे के बीच, एक 16 जी 1 आधा '' सुई के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कम गति निकालने निकालें। इस प्रयोजन के लिए, बस नीचे में टूट अंडा मलबे की परत के ऊपर अपकेंद्रित्र ट्यूब की दीवार के माध्यम से सिरिंज सुई धक्का। सुई के साथ धक्का जब एक प्रतिरोध के खिलाफ ट्यूब पकड़ो।
    नोट: एक भरा 5 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब निकालने की मिलीलीटर 1.8-2.5 के बीच देता है।
  15. निकालने के 1 मिलीलीटर प्रति 10 μl 100 गुना protease अवरोध मिश्रण, 1 μl जोड़ने1 एम डीटीटी, 2.5 μl cycloheximide (20 मिलीग्राम / एमएल) और 0.5 μl cytochalasin बी (10 मिलीग्राम / एमएल) के। बर्फ पर निकालने रखें।
    नोट: निकालने या तो प्रयोग के लिए सीधे इस्तेमाल किया या aliquoted जा सकता है, जमे हुए हैं और कई महीनों के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत तस्वीर। निकालने बर्फ़ीली अपनी गतिविधि में कमी होगी। Immunodepletion की तरह नाजुक प्रयोगों के लिए यह अत्यधिक तुरंत ताजा निकालने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।

Chromatin Decondensation की इन विट्रो पुनर्गठन के लिए बफ़र 6. तैयारी

  1. 25 मिमी एटीपी, 25 मिमी जीटीपी, 127.5 मिलीग्राम / एमएल creatine फॉस्फेट और 2.5 मिलीग्राम / 250 मिमी सुक्रोज, 1.2 मिमी Hepes, 5.9 मिमी KCl और 0.3 मिमी 2 MgCl युक्त बफर में मिलीलीटर क्रिएटिन काइनेज युक्त ऊर्जा मिश्रण शेयर समाधान तैयार है। -80 डिग्री सेल्सियस पर अशेष और दुकान। फ्रिज में नहीं है, विगलन के बाद हौसले का प्रयोग करें।
  2. विआयनीकृत पानी में 0.2 ग्राम / एमएल ग्लाइकोजन भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। एक अंतिम एकाग्रता के लिए 6-डाइमिथाइल aminopurine (DMAP) भंगDMSO में 0.25 एम के। -20 डिग्री सेल्सियस पर अशेष और दुकान। फ्रिज में नहीं है, विगलन के बाद हौसले का प्रयोग करें।
  3. 30% 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस, फिल्टर और दुकान में (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज तैयार करें। 80 मिमी पाइप पीएच 6.8, 1 मिमी 2 MgCl, 150 मिमी सुक्रोज और 4% paraformaldehyde (पीएफए) (चेतावनी!, रासायनिक हुड के तहत काम दस्ताने और मुंह संरक्षण पहनते) युक्त 4% VikiFix समाधान तैयार है।
    नोट: पीएफए ​​इसलिए भंग करने के लिए मुश्किल है यह निम्नलिखित के रूप में यह करने के लिए सिफारिश की है: 1 एल के लिए 24.2 छ पाइप और अलग बीकर में 40 ग्राम पीएफए ​​भंग viki-फिक्स, गर्म (लगभग उबलते) विआयनीकृत पानी में दोनों। दोनों 10 एन NaOH के अलावा के माध्यम से भंग, लेकिन बहुत ज्यादा नहीं जोड़ के लिए सावधान रहना होगा। 51.4 ग्राम सुक्रोज और पीएफए ​​समाधान के लिए 1 मिलीलीटर 1 एम 2 MgCl जोड़ें। अन्य मिश्रण करने के लिए पाइप समाधान जोड़ें। 1 एल अंतिम मात्रा को भरें और NaOH जोड़कर तटस्थ पीएच को समायोजित करें।
  4. 10 मिलीग्राम पानी में / एमएल 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (चेतावनी! दस्ताने पहनना) भंग। सग्रह करना-20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरा।

Chromatin Decondensation की इन विट्रो पुनर्गठन के लिए 7. प्रोटोकॉल

  1. एक निश्चित कोण में 386,000 XG पर 12 मिनट के लिए 20 एक्स 0.2 मिलीलीटर कम गति interphasic निकालने स्पिन या एक 10 x 2.0 मिलीलीटर रोटर में 355 से 000 XG पर।
  2. धीरे एक वैक्यूम पंप या पिपेट का उपयोग शीर्ष पर लिपिड परत को हटाने और सतह पर तैरनेवाला लेने के नीचे की परत से झिल्ली संदूषण से परहेज (तत्पश्चात उच्च गति निकालने कहा जाता है) और गोली त्यागें।
    नोट: यह दो बार निकालने स्पिन करने के लिए या centrifugation से पहले सुक्रोज बफर के साथ मात्रा का 20% के साथ निकालने को कमजोर करने की सलाह दी जाती है संभव झिल्ली प्रदूषण को कम करने के लिए। हालांकि, कमजोर पड़ने और अतिरिक्त centrifugation कदम निकालने गतिविधि को कम कर सकते हैं।
  3. Pipet एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में उच्च गति निकालने के 18 μl, ग्लाइकोजन μl, (राशि थोड़ा क्रोमेटिन शेयर एकाग्रता के अनुसार अलग किया जा सकता है) 0.5 μl 0.5 mitotic क्लस्टर 0.7 μl जोड़नेऊर्जा मिश्रण और 0.3 μl DMAP। क्रोमेटिन decondensing क्रोमेटिन के बाल काटना रोकने के लिए जोड़ा गया है, जैसे ही प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए व्यापक खोलने के साथ युक्तियों का उपयोग करें।
    नोट: प्रतिक्रिया झिल्ली (चित्रा 3 देखें) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रदर्शन किया जा सकता है। झिल्ली की उपस्थिति में क्रोमेटिन decondense करने के लिए Eisenhardt एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार मंगाई झिल्ली के 2 μl जोड़ें। 16
  4. 20 डिग्री सेल्सियस पर (decondensation की प्रक्रिया के पहले समय बिंदुओं का अध्ययन करने के लिए या कम) के लिए 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  5. बर्फ पर 20-30 मिनट के लिए 0.5% glutaraldehyde और 0.1 मिलीग्राम / एमएल DAPI और ऊष्मायन युक्त 0.5 मिलीलीटर viki-फिक्स ठंड बर्फ जोड़कर नमूना ठीक करें।
    नोट: नमूने आगे immunofluorescence के लिए कार्रवाई की जाएगी तो इस बार एंटीबॉडी धुंधला के साथ हस्तक्षेप के रूप में, निर्धारण glutaraldehyde बिना किया जाना चाहिए। केवल DAPI धुंधला विश्लेषण किया जाएगा, लेकिन अगर भरमार के अलावाaraldehyde एक अच्छे क्रोमेटिन संरचना की रक्षा करेंगे।
  6. क्रोमेटिन को coverslips की आत्मीयता बढ़ाने के लिए पाली एल लाइसिन समाधान के साथ 5 मिनट के लिए दौर coverslips (व्यास 12 मिमी) सेते हैं। बाद में फिल्टर पेपर पर coverslips सूखी।
  7. Centrifugation ट्यूब के तल पर शीर्ष करने के लिए लेपित साइट के साथ coverslips डालने से फ्लैट नीचे centrifugation ट्यूब (6 मिलीग्राम, 16/55 मिमी) इकट्ठे। 30% सुक्रोज तकिया के 800 μl जोड़ें और शीर्ष पर तय नमूना परत।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2500 XG पर 15 मिनट के लिए स्पिन।
    नोट: फ्लैट नीचे centrifugation ट्यूबों के 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों को अपनाने कि रोटार के लिए फिट बैठते हैं।
  9. उसके बाद एक 16 जी 1 आधा '' सिरिंज सुई के साथ सावधानी से centrifugation ट्यूब के नीचे poking द्वारा नलियों से coverslips निकालें, तैरनेवाला छानना। सुई 3 के बारे में चिपक जाती है, ताकि इस उद्देश्य के टेप के लिए सुई का ढक्कन और सुई एक साथ उनके नीचे से कम ही है और ढक्कन के सामने अंत में कटौतीमिमी बाहर। Coverslip एक साइट पर सुई से हटा लिया जाता है, तो coverslip दूर करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  10. , विआयनीकृत पानी में सूई से जल्दी coverslip धो एक फिल्टर पेपर के लिए अपने पक्ष को छूकर यह धीरे सूखी और बढ़ते मीडिया की एक बूंद पर खुर्दबीन स्लाइड पर जगह है। सूखी, नेल पॉलिश के साथ यह सील और अंधेरे में रहते हैं।
    नोट: glutaraldehyde बिना तय नमूने 24 अच्छी तरह से थाली में पीबीएस में संग्रहीत और immunofluorescence धुंधला के लिए आगे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई दिनों के लिए संग्रहीत हैं, तो 0.05% सोडियम azide (चेतावनी! दस्ताने पहनना) जोड़ने के बैक्टीरिया से संक्रमण से बचने के लिए पीबीएस के लिए।
  11. DAPI के संकेत के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूनों का विश्लेषण (जैसे, एक 405 एनएम लेजर के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग)।

इन विट्रो पुनर्गठन Chromatin Decondensation नमूने के immunofluorescence धुंधला के लिए बफर के 8. तैयारी

  1. 1.1.1 के अनुसार पीबीएस तैयार करें। एक पंख के लिए एनएच 4 सीएल भंगपीबीएस में 50 मिमी अल एकाग्रता। 4 डिग्री सेल्सियस पर यह समाधान रखें। पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (हौसले से तैयार) भंग। पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पीबीएस + 0.1% ट्राइटन X-100 में 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) गिराए द्वारा उपयोग करने से पहले हौसले बफर अवरुद्ध तैयार करें।

इन विट्रो पुनर्गठन Chromatin Decondensation नमूने के immunofluorescence धुंधला के लिए 9. प्रोटोकॉल

नोट:। अन्यथा नहीं कहा गया है, तो coverslips के सभी निम्नलिखित incubations, अच्छी तरह से प्रति कम से कम 250 μl समाधान के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में बना रहे हैं इन विट्रो decondensed क्रोमेटिन नमूने जोड़ने या हटाने के समाधान करते हैं, इसलिए सावधान रहना होगा तय कोशिकाओं की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं। यह कोणीय कटौती प्लास्टिक पाश्चर pipettes का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। धोने कदम और माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए 100 आरपीएम से नहीं तेजी से बढ़ रहा है, घोड़ा या मंच घूर्णन पर आरटी पर थाली जगह है।

  1. Coverslip incubating द्वारा नमूने बुझाना5 मिनट के लिए पीबीएस में 1 मिलीलीटर एनएच 4 सीएल के साथ। 1ml कम से कम 30 मिनट के लिए बफर रोकने के साथ उन्हें incubating द्वारा ब्लॉक नमूने हैं।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के लिए एक आर्द्रता चैम्बर इकट्ठा: गीला ऊतक के शीर्ष पर उल्टा एक closable बॉक्स के नीचे और 24 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन पर एक गीला ऊतक रखो। ढक्कन में parafilm रखें और parafilm पर नमूना प्रति एंटीबॉडी समाधान के 70 μl जोड़ें। एंटीबॉडी समाधान के लिए, सीरमरोधी या आत्मीयता शुद्ध एंटीबॉडी 1 पतला: 100 अवरुद्ध बफर में।
  3. उल्टा एंटीबॉडी समाधान के शीर्ष पर coverslips जगह और 1 से 2 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं। वापस नमूना पक्ष सामना करना पड़ रहा है और साथ 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए coverslips जगह पीबीएस में 1 मिलीलीटर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 10 मिनट के लिए नमूने तीन बार धोएं।
  4. निर्माता से सिफारिश की एकाग्रता के लिए अवरुद्ध बफर में पतला 250 μl माध्यमिक फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी में आरटी पर 1 घंटे के लिए coverslips सेते हैं। लाइट से बचाएँ। Thr धोपीबीएस में 1 मिलीलीटर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 10 मिनट के लिए ई टाइम्स।
  5. 5 ग्राम के 1ml / एमएल DAPI पीबीएस में के साथ 10 मिनट के लिए नमूने सेते हैं। पीबीएस में 1 मिलीलीटर 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  6. , विआयनीकृत पानी में सूई से जल्दी coverslip धो एक फिल्टर पेपर के लिए अपने पक्ष को छूकर यह धीरे सूखी और बढ़ते मीडिया की एक बूंद के शीर्ष पर खुर्दबीन स्लाइड पर जगह है। सूखी, नेल पॉलिश के साथ इसे सील और प्रयोग किया जाता है जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

Decondensation प्रतिक्रिया के समय निर्भरता

चित्रा 1 decondensation परख का एक विशिष्ट समय पाठ्यक्रम से पता चलता है। प्रतिक्रिया की शुरुआत में दिखाई दे गुणसूत्रों के क्लस्टर decondenses और एक एकल, गोल और चिकनी नाभिक में विलीन हो जाती है। अंडा निकालने सुक्रोज द्वारा बदल दिया गया है, जब गुणसूत्र क्लस्टर decondensation गतिविधि अंडा निकालने में मौजूद है, जो सुझाव है कि, गाढ़ा रहता बफर।

क्रोमेटिन decondensation एक ऊर्जा निर्भर प्रक्रिया है

इन विट्रो decondensation प्रतिक्रिया सुविधा अवरोधकों के अलावा द्वारा, जैसे चालाकी से किया जा सकता है। चित्रा 2 पर दिखाया प्रयोग में, गैर hydrolyzable एटीपी या जीटीपी एनालॉगों, ATPγS या GTPγS, प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया था। दोनों यह एक एटीपी और जीटीपी निर्भर, सक्रिय प्रक्रिया (चित्रा 2) है कि, decondensation दिखा रोकती हैं।

decondensation परख उपस्थिति या झिल्ली की अनुपस्थिति (चित्रा 3) में प्रदर्शन किया गया था। दोनों स्थितियों में क्रोमेटिन हालांकि, बड़ा नाभिक में झिल्ली परिणाम के अलावा decondensation से होकर गुजरती है कि कृपया ध्यान दें। सबसे शायद, परमाणु लिफाफा के सुधार के परमाणु परिवहन पर निर्भर अभी तक एक तंत्र द्वारा एक माध्यमिक decondensation कदम लाती है।

आकृति 1
वें ई में इन विट्रो decondensation प्रतिक्रिया। Mitotic हेला कोशिकाओं से समूहों chromatin की चित्रा 1. समय पाठ्यक्रम interphasic Xenopus अंडे निकालने के साथ incubated रहे थे। नमूने, 4% पीएफए ​​और 0.5% glutaraldehyde के साथ संकेत समय अंक पर तय DAPI के साथ दाग और सह द्वारा विश्लेषण किया गया nfocal माइक्रोस्कोपी। पुन: मुद्रित Magalska एट अल। 8 से। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Chromatin decondensation एटीपी और जीटीपी हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता है। Chromatin decondensation 10 मिमी ATPγS, 10 मिमी GTPγS या नियंत्रण बफर की उपस्थिति में किया गया था। नमूने संकेत समय बिंदुओं पर 4% पीएफए ​​और 0.5% glutaraldehyde के साथ तय की और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। पुन: मुद्रित Magalska एट अल। 8 से। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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उपस्थिति और झिल्ली के अभाव में चित्रा 3. Chromatin decondensation। Chromatin decondensation अनुपस्थिति (ए) या ​​120 मिनट के लिए प्रवर्तन शुद्ध झिल्ली की उपस्थिति (बी) में प्रदर्शन किया गया था। नमूने 4% पीएफए ​​और 0.5% glutaraldehyde के साथ तय की और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया। क्रोमेटिन DAPI, DiIC 18 के साथ झिल्ली (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3, '3'-tetramethylindocarbocyanine परक्लोरेट) के साथ दाग है। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Xenopus अंडे अर्क ईमानदारी से इन विट्रो में सेलुलर प्रक्रियाओं को पुन: पेश करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हैं laevis, और इस प्रणाली को सफलतापूर्वक सेल चक्र और कोशिका विभाजन घटनाओं 2, 3,5,6,17 के लक्षण वर्णन में इस्तेमाल किया गया था। कारण डिम्बजनन दौरान अंडे में तनहा परमाणु के घटकों की बड़ी दुकानों के लिए, अंडा अर्क सेलुलर घटकों का बहुत अच्छा स्रोत हैं। स्तनधारी ऊतक सेल लाइनों या आनुवंशिक हेरफेर पर आरएनएआई जैसे अन्य तरीकों की तुलना में, यह कई लाभ प्रदान करता है: सेल से मुक्त प्रणाली सेलुलर व्यवहार्यता अन्यथा एक सीमा होगी जिसमें सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा जटिल प्रक्रियाओं के एकल कदम सरल assays में विश्लेषण किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत decondensation परख क्रमश: दूसरे mitotic घटनाओं से कोई हस्तक्षेप के साथ postmitotic decondensation की आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। Xenopus अंडे अर्क विशिष्ट प्रोटीन की कमी से हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैंऔर अवरोधकों या उत्परिवर्तित प्रोटीन 8 के अलावा। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 decondensation परख करने के लिए गैर-hydrolyzable एटीपी या जीटीपी एनालॉगों, ATPγS और GTPγS जोड़ने का परिणाम से पता चलता है। कमजोर पड़ने और झिल्ली और साइटोसॉल 16 अलग किया जा सकता है जैसे Xenopus अंडे घटकों के अंतर centrifugation द्वारा। 3 झिल्ली की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रदर्शन decondensation परख पता चलता है। अंत में, सेल मुक्त परख भी एक विभाजन दृष्टिकोण से, जैसे उपन्यास कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम पहचान की है एक ऐसी रणनीति का उपयोग करना महत्वपूर्ण decondensation के रूप में एएए + -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 8 कारकों।

इन विट्रो प्रणालियों में एक्स पर आधारित अंडे अलग डीएनए टेम्पलेट्स के साथ नियोजित किया गया है laevis:। फोर्ब्स एट अल पता चला है कि unfertilized एक्स में फेज λ डीएनए के इंजेक्शन laevis अंडे NAK पर क्रोमेटिन के विधानसभा प्रेरितएड फेज λ डीएनए। वायरल डीएनए के इंजेक्शन अंडा सक्रिय रूप में, क्रोमेटिन की विधानसभा में एक नाभिक की तरह संरचना 18 और इसी तरह λ-फेज डीएनए के गठन के द्वारा पीछा किया गया था विट्रो 19 में संरचनाओं की तरह नाभिक उत्पन्न करने के लिए अंडा निष्कर्षों के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है। डीएनए के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों एक परमाणु लिफाफा के डीएनए 20 की chromatinization और भर्ती परमाणु झिल्ली 21 वर्ष की है और साथ ही विधानसभा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह खुला रहता है, हालांकि ताकना, 22 परिसरों के लिए यह एक सदाशयी परमाणु फिर से विधानसभा की प्रक्रिया मची किस हद तक । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सक्रिय Xenopus अंडे से उत्पन्न निकालने का उपयोग हेला कोशिकाओं से अलग mitotic क्रोमेटिन समूहों के decondensation अनुमति देता है। यह अच्छी तरह से एक interphasic नाभिक 8 के एक सुधार के लिए प्रमुख घटनाओं reconstructs। परमाणु लिफाफा के गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल व्यापक रूप से लागू परमाणु विधानसभा प्रतिक्रिया की तुलना में औरबजाय शुक्राणु डीएनए के decondensation परख हेला mitotic क्रोमेटिन समूहों में बँटवारा के अंत में परमाणु ताकना परिसरों, इस्तेमाल कर रहे हैं। शुक्राणु डीएनए mitotic क्रोमेटिन या unfertilized और गैर सक्रिय अंडे 3 से तैयार निकालने के साथ ऊष्मायन पर भी अलग-अलग गुणसूत्रों में इकट्ठा किया जा सकता है। हम प्रक्रिया को सरल बनाने और क्रोमेटिन संक्षेपण से हस्तक्षेप से बचने के लिए क्रोमेटिन स्रोत के रूप में mitotic समूहों का उपयोग करने का फैसला किया। इसके अलावा, अंडा निकालने की तैयारी थोड़ा संशोधित किया गया है: तय कोण रोटार में दो उच्च गति centrifugation कदम से मंजूरी दे दी क्रोमेटिन decondensation कम गति निकालने के लिए उपयोग किया जाता है। कम गति निकालने अपनी गतिविधि को खोने के बिना ऊपर तरल नाइट्रोजन में माह से 6 के लिए भंडारित किया जा सकता है। इसके विपरीत, परमाणु विधानसभा प्रतिक्रियाओं में, साइटोसॉल और मंगाई झिल्ली ठंड से पहले संभव कमजोर पड़ने और अंतर उच्च गति centrifugation द्वारा कम गति के अर्क से उत्पन्न कर रहे हैं (देखें Eisenhardt एट अल। 16 एक detai के लिएनेतृत्व में प्रोटोकॉल)। हमारे परख प्रणाली में, झिल्ली के अलावा परमाणु ताकना परिसरों सहित एक बंद परमाणु लिफाफा के गठन की अनुमति देता है। जिसके परिणामस्वरूप नाभिक परमाणु आयात और निर्यात 8 के लिए सक्षम हैं। इस प्रकार, इस प्रणाली क्रोमेटिन decondensation और परमाणु लिफाफा सुधार दोनों का समर्थन करता है। दिलचस्प बात यह है क्रोमेटिन decondensation झिल्ली के अभाव में भी (चित्रा 3) संभव है। थोड़ा बड़ा नाभिक में झिल्ली परिणामों की हालांकि इसके अलावा। सबसे अधिक संभावना है, परमाणु लिफाफा के सुधार के परमाणु आयात पर निर्भर करता है, जो अभी तक अपरिभाषित तंत्र द्वारा एक माध्यमिक decondensation कदम, लाती है।

हेला कोशिकाओं से mitotic क्रोमेटिन समूहों के अलगाव के लिए, Gasser और Laemmli 15 द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण का इस्तेमाल किया गया था। सिंक्रनाइज़ mitotic कोशिकाओं गैर ईओण डिटर्जेंट digitonin युक्त एक बफर में और मैकेनिक बलों द्वारा lysed रहे हैं। क्रोमेटिन होते हैं कि समूहों के रूप में अलग हैएक नाभिक से सभी गुणसूत्रों। एकल गुणसूत्र अलगाव प्रोटोकॉल की तुलना में महत्वपूर्ण अंतर कोशिकाओं hypotonically सूजन नहीं हैं, लेकिन सेल से पहले 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा है कि इस तथ्य है। इस व्यक्ति क्रोमोसोम 15, 23 के वियोग से बचाता है। पूरे क्रोमेटिन समूहों के अलगाव का लाभ जो मान्यता प्राप्त जेआर पॉलसन 23 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में, Gasser और Laemmli kinases, न्युक्लिअसिज़, प्रोटिएजों और फास्फेटेजों की गतिविधि को कम करने के लिए EDTA युक्त बजाय मिलीग्राम की polyamine बफ़र्स 2 + आधारित बफ़र्स का इस्तेमाल किया और इस से अलगाव की प्रक्रिया 15 के दौरान होने वाली प्रोटीन और डीएनए संशोधनों की मात्रा को कम। इसके अतिरिक्त, अंतर centrifugation के दौरान एक कोलाइडयन सिलिका के कण ढाल का उपयोग अत्यधिक साइटोप्लास्मिक संदूषण कम कर देता है। प्रोटोकॉल भी चीनी हैम्स्टर अंडाशय और माउस कोशिकाओं 15 से mitotic क्रोमेटिन समूहों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इन विट्रो क्रोमेटिन decondensation की एटीपी निर्भरता हिस्सा RuvBL1 / 2 की भागीदारी लेकिन द्वारा समझाया कम से कम में हो सकता है यह भी mitotic बाहर निकलें 24 के दौरान क्रोमेटिन से mitotic काइनेज अरोड़ा बी को हटा जो एक और एएए + -ATPase, p97,। प्रक्रिया जीटीपी हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता क्यों हम इस स्थापना का उपयोग जवाब देने का इरादा है कि खुले प्रश्नों में से एक है।

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Acknowledgments

अक्स 1 और 2 विकासात्मक सेल 31 (3), Magalska से reprinted रहे हैं चित्रा के लिए यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन और ईआरसी (वाशिंगटन के लिए AN377 / 3-2 और 309,528 CHROMDECON) और बोहरिंगर Ingelheim फॉंड्स की एक पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया एट अल। बँटवारा, 305-318, 2014 के अंत में क्रोमेटिन decondensation में, RuvB-तरह ATPases समारोह, एल्सेविअर से रज़ामंदी के साथ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
spermine tetrahydrochloride Fluka analytical 85610-25G
spermidine trihydrochloride Sigma  S2501-5G
high-purity digitonin Millipore 300410-1GM toxic
PMSF Applichem A0999,0100 toxic
thymidine Calbiochem 6060
nocodazole Calbiochem 487928 toxic
37% formaldehyde solution Roth 7398-1 toxic
trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 toxic
1,4-dithiothreitol (DTT) Roth 6908.2
AEBSF hydrochloride Applichem A1421,0001
pepstatin Roth 2936.1/2/3
leupeptin Roth CN334
aprotinin Roth A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution) GE Healthcare 17-0891-01
glutamine Gibco 25030-024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
75 cm² tissue culture flasks Greiner Bio-one 658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder) Wheaton 357546
Neubauer chamber Assistent 441/1
 Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) Nalgene 3118-0050
100 µm cell strainer, nylon BD Falcon 352360
cytochalasin B Applichem A7657,0010 toxic
cycloheximide Roth 8682.3 toxic
L-cystein Merck 1,028,381,000
hCG available as Ovogest MSD 1431593
PMSG available as Intergonan MSD 1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) Enzo ALX-450-002-M010 toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") Braun 4665120
ATP Serva 10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20 Roth K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt Calbiochem 2380
creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
DMAP Sigma D2629-1G
DAPI  Roche 10236276001
PFA Sigma P-6148 toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) Beckman Coulter 343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) Biozym 729065
50% glutaraldehyde solution, grade I Sigma alderich G7651-10 ml toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) Greiner Bio-one 145211
Vectashield mounting medium Vector laboratories H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) Beckman Coulter 343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) Biozym 729055
12 mm coverslips Thermo Scientific 0784 #1

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References

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 106 सेल मुक्त परख mitotic बाहर निकलें क्रोमेटिन अलगाव, क्रोमेटिन decondensation परमाणु सुधार क्रोमेटिन संक्षेपण
एक सेल फ्री परख बँटवारा के अंत में Chromatin Decondensation अध्ययन करने के लिए
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Schellhaus, A. K., Magalska, A.,… More

Schellhaus, A. K., Magalska, A., Schooley, A., Antonin, W. A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis. J. Vis. Exp. (106), e53407, doi:10.3791/53407 (2015).

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