En Cell Gratis analysen å studere Chromatin Decondensation på slutten av Mitosen

Introduction

Xenopus laevis egg ekstrakt er en kraftig og mye brukt verktøy for å studere kompliserte cellulære hendelser i enkelhet i en celle-fri analysen. Siden sin første beskrivelsen av Lohka & Masui ^en de har vært mye brukt til å studere mitotiske prosesser som kromatin kondens ^2, spindelenheten ^3, kjernekraft konvolutt sammenbrudd ^4, men også nucleocytoplasmic transport ⁵ eller DNA replikasjon ^6. De hendelser som finner sted i slutten av mitose, nødvendige for reformasjon av den interphasic kjernen som kjernekraft konvolutt reformasjon og kjernefysisk pore kompleks sammensetting er mye mindre forstått i forhold til de tidlige mitotiske hendelser, men kan være like studert ved hjelp Xenopus egg ekstrakt ^7. Vi har nylig etablert et assay basert på Xenopus egg ekstrakt for å studere kromatin decondensation ved slutten av mitose ^8, en under-prosess undersøkt som venter its detaljert karakterisering.

I metazoans er kromatin høyt kondensert ved mitotisk oppføring for å utføre trofast segregering av det genetiske materialet. For å sikre at kromatin er tilgjengelig for genekspresjon og DNA-replikasjon under interfase, må det være de-komprimeres i enden av mitose. I virveldyr, er kromatin opptil femti ganger mer komprimert i løpet av mitose i forhold til inter ^9, i motsetning til gjær hvor den mitotiske komprimeringen er vanligvis langt lavere, for eksempel bare to ganger i S. cerevisiae ^10. Virveldyr kromatin decondensation har vært mest studert i sammenheng med sperm DNA omorganisering etter egg befruktning. En molekylære mekanismen, der nucleoplasmin, en rikelig eggcelle protein, utveksler sperm spesifikke protaminer til histoner H2A og H2B lagret i egget. Denne prosessen ble også belyst ved hjelp Xenopus egg ekstrakt ^{11, 12.} Med uttrykketav nucleoplasmin er begrenset til oocytter ^{13 og} mitotisk kromatin ikke inneholder disse sperm spesifikke protaminer. Derfor kromatin decondensation på slutten av mitose er nucleoplasmin uavhengig ^8.

For in vitro decondensation reaksjon ansetter vi ekstrakt generert fra aktiverte X. laevis egg og kromatin klynger isolert fra synkroniserte HeLa celler. Behandling av egg med en kalsiumionofor ligner kalsium slipper inn i eggcelle generert av sperm oppføring under befruktning. Kalsium bølge utløser cellesyklusen gjenopptakelse og egget, arrestert i den andre metafase av meiose, utvikler seg til den første inter ^14. Derfor egg ekstrakter fremstilt skjema aktivert egg representerer mitotisk exit / inter staten og er kompetente til å fremkalle hendelser spesifikke for mitotisk exit som kromatin decondensation, kjernekraft konvolutt og pore kompleks reformasjon. For isolering av mitotisk chromatin klynger vi brukte en litt modifisert versjon av protokollen publisert av Gasser og Laemmli ^15, hvor kromosom klynger blir frigjort ved lysis fra HeLa-celler synkronisert i mitose, og isoleres i polyamin inneholdende buffere graderte sentrifugeringer.

Protocol

Mitotisk Chromatin Cluster Isolasjon fra HeLa celler

1. Forberedelser

1. Cell Kultur Solutions
   1. Forbered fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med tilsetning av 10% kalvefosterserum, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2 mM glutamin i DMEM. Forbered fosfatbuffer saltvann (PBS) inneholdende 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na HPO _{2 4} 2 H _{2 O} og 2 mM KH _{2PO 4} i avionisert vann, og justere pH til 7,4 med 10 N NaOH.
      MERK: PBS kan holdes så 10 x stamløsning over tid ved romtemperatur. Fortynne det med avionisert vann til 1x før bruk. Filtrer den 1x oppløsningen på nytt hvis den skal brukes i cellekultur.
   2. Forbered en 40 mM lager av tymidin løsning (cellekultur passer) i DMEM medium. Løs opp 0,97 g tymidin i 90 ml DMEM medium. Justere sluttvolumet til 100 ml. Lagres stamløsning ved -20 °C. oppløsning (OBS! Arbeide under kjemisk hette, hansker og munnbeskyttelse) nocodazol til en 5 mg / ml stamløsning i DMSO.
2. Mitotiske Klynger Isolation Solutions
   MERK: Alle løsningene som er beskrevet i 1.2 må holdes på is etter tilberedning / tining gjennom hele forsøket.
   1. Autoklav avionisert vann i 105 minutter ved 121 ° C. Oppløs spermin tetrahydroklorid i autoklavert deionisert vann til en sluttkonsentrasjon på 200 mM (69,6 mg / ml). Lagres stamløsning ved -20 ° C. Oppløs spermidin trihydroklorid i autoklavert deionisert vann til en sluttkonsentrasjon på 200 mM (50,8 mg / ml). Lagres stamløsning ved -20 ° C.
   2. Forbered 5% (w / v) digitonin (OBS! Arbeide under kjemisk hette, hansker og munnbeskyttelse) i varmt, deionisert vann. Filter og lagre alikvoter ved -20 ° C. Oppløse fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (OBS! Jobbe under kjemisk hette, hansker og munn-beskyttelse) til en endelig konsentrasjon på 200 mM (35 mg / ml) i 100% etanol. Lagres stamløsning ved -20 ° C.
   3. Oppløse dithiothreitol (DTT) med avionisert vann til en endelig konsentrasjon på 1 M (154 mg / ml) (OBS! Arbeide under kjemisk hette, hansker). Filter og store stamløsning ved -20 ° C.
   4. Forbered en 100-fold proteasehemmer mix (OBS jobbe under kjemisk hette, hansker!) Ved oppløsning 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml leupeptin, 0,1 mg / ml pepstatin og 0,2 mg / ml aprotinin i avionisert vann. Lagres stamløsning ved -20 ° C.
   5. Tilbered en 10 x stamløsning av buffer A inneholdende 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM spermin tetrahydroklorid og 5 mM spermidin trihydroklorid. Lagres buffer A ved 4 ° C uten spermin og spermidin tetrahydroklorid trihydroklorid, som skal tilsettesferskt like før bruk.
      MERK: EDTA bare oppløses ved pH-verdier høyere enn 8, og derfor å fremstille en høykonsentrert EDTA-KOH-stamløsning (0,5 M anbefales), tilsett 5 N KOH til pH like over 8 for å oppløse den. Etterpå titrering ned til pH 7,4.
   6. Tilbered en 20 x stamløsning av buffer som inneholdt 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCl, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) og 5 mM spermidin trihydroklorid. Som buffer kan bli lagret under samme betingelser som i buffer A.
      MERK: Forbered arbeidsløsninger I-IV (se i følgende trinn), glyserol gradient og kolloidale silikapartiklene løsninger som inneholder silika partikler (15 til 30 nm diameter) belagt med non-dialyseres polyvinylpyrrolidon (PVP) fersk like før isolering fremgangsmåte (PMSF og digitonin bør legges direkte før bruk som PMSF er labil i vandige oppløsninger og digitonin en tendens til å felle ut ved langtidslagring på is).
   7. Forbered 100 ml oppløsning I ved tilsetning av 0,5x buffer A,1 mM DTT, 1: 100 av proteaseinhibitoren blandingen og 0,1 mM PMSF i autoklavert deionisert vann. Forbered 50 ml av oppløsning II (for cellelysering) ved tilsetning av buffer A 1 x, 1 mM DTT, 1: 100 av proteaseinhibitoren blandingen, 0,1 mM PMSF, 0,1% digitonin og 10% glycerol i autoklavert deionisert vann.
   8. Forbered 200 ml av oppløsning III inneholdende 0,25x buffer A, 1 mM DTT, 1: 100 av proteaseinhibitoren blandingen, 0,1 mM PMSF og 0,05% digitonin i autoklavert deionisert vann. Forbered 40 ml oppløsning inneholdende 1 x buffer IV As, 1 mM DTT, 1: 100 av proteaseinhibitoren blandingen, 0,1 mM PMSF og 0,1% digitonin i autoklavert deionisert vann.
   9. Forbered 120 ml glycerol gradient løsning ved tilsetning av 25% glycerol og 0,1% digitonin-løsning til I.
   10. Forbered 150 ml kolloidale silikapartiklene oppløsning inneholdende 60% volum / volum (volum pr volum) av en suspensjon inneholdende silikapartikler (15 til 30 nm diameter) belagt med ikke-dialyserbart polyvinylpyrrolidon (PVP), 15% glyserol, 2 mM spermidine trihydrochloride og 0,8 mm spermin tetrahydroklorid i løsning IV.
   11. Forbered klynge lagringsbuffer inneholdende 250 mM sukrose, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM spermidin trihydroklorid, 0,2 mM spermin-tetrahydroklorid, 1: 100 av proteaseinhibitoren blanding, 0,3% BSA og 30% glycerol. Klyngelagringsbuffer kan oppbevares ved -20 ° C.
   12. Forbered squash fix løsning som inneholder 10% formaldehyd (OBS! Arbeide under kjemisk hette, hansker), 50% glycerol, dobbelte Mark modifiserte Ringers buffer (MMR se 4.5.) Og 0,2 mikrogram / ​​ml DAPI (OBS! Bruk hansker). Oppbevar ved 4 ° C i lyse beskyttet reaksjonsrørene. Det er ikke avgjørende for forsøket å bruke denne squash fix oppskrift, vil alternative oppskrifter også fungere.

2. Synkronisering av celler

1. På dag 1: Seed HeLa-celler i fem 75 cm ² (250 ml) kolber med mediet og inkuberes det ved 37 ° C i 5% C_O 2.
   MERK: Dette vil gi i ca 18 x 10 ⁶ celler på dagen for kromatin cluster isolasjon.
2. På dag 2: Når cellene er i det minste 50% sammenflytende (omtrent halvparten av overflaten er dekket av cellene, og det er fremdeles plass for cellene til å vokse), legge til tymidin til en sluttkonsentrasjon på 2 mM (tymidin blokk) og dyrke celler for 24 timer ved 37 ° C i _5% CO2.
   MERK: Dette vil arrestere cellene ved G1 / S fasen grensen.
3. På dag 3: Sug medium som inneholder tymidin og legge steril PBS. Vask celler ved delikat skylling med steril PBS. Aspirer PBS og tilsett 15-20 ml av friske, varme komplette DMEM medium og kultur celler for 3 til 4 timer ved 37 ° C i 5% CO ₂ for å frigjøre dem fra G1 / S-fase blokk.
4. På dag 3 (fortsettelse): Etter å ha sluppet cellene fra G1 / S-fasen blokk, nocodazol legge til en sluttkonsentrasjon på 100 ng / ml. Fortynn nocodazol ved å tilsette 2 ul av stamløsning (5 mg / ml) for å 98ul frisk DMEM medium, og tilsett 1 mL fortynnet nocodazol per hver ml av cellekultur. Kultur celler til omtrent 12 timer ved 37 ° C i _5% CO2. Dette vil blokkere cellene i mitose.

3. Mitotiske Clusters Isolation

1. På dag 4: Isoler mitotiske klynger. Ved hjelp av en lyse felt mikroskopi, sjekk om de fleste av cellene er mitotisk. Dersom mindre enn 50% av cellene er mitotisk vente til flere celler når mitose. Samle mitotiske celler ved å tappe kraftig ved siden av kolben (eller ved forsiktig å sprøyte med pipette), vil dette løsne gjenværende mitotiske celler. Overfør cellesuspensjonen til 50 ml koniske sentrifugerør.
   MERK: Mitotiske celler blir runde og kan lett løsnes fra kolben bunnen (akkurat som celler etter trypsinering), i motsetning til andre celler i cellesyklustrinn, som er flate og fast festet til kolben.
2. Høste mitotiske celler ved å spinne rørene ved 1500 xg i 10 min (4-76 C eller RT), og supernatanten ble fjernet etterpå. Cellepelleten suspenderes i 8 ml PBS, basseng inn i en 50 ml konisk sentrifugerør, fylle røret fullstendig med PBS og spinne på nytt i 10 minutter ved 1500 x g. Gjenta denne vaskeprosedyre tre ganger totalt.
3. Fra nå utføre alle trinnene på isen med kalde løsninger. Kraft resuspender pelleten i 37 ml kald oppløsning II. Overfør blandingen til en kald 40 ml glass-glass-homogenisator ved hjelp av en 25 ml pipette og lyse cellene på is ved douncing med et tett støter inntil mitotiske klyngene er fri for cytoplasmatisk materiale. Antall slag er svært avhengig av digitonin lager, og kan variere fra 3 til 20 ganger.
   MERK: Homogenisering kan være ganske sprek, men bør betraktes som komplett når nesten alle mitotiske celler lyseres og klynger er sett til å være fri for cytoplasmic materiale (se 3.4).
4. Etter et par slag mix 5-10 mL av cellesuspensjonen 1: 2 med Trypan blå og sjekk av microscopy i en Neubauer kammer. Når cellene lyseres kromatin er farget blått, og fri for cellemembraner (NB: mulige cytoplasmatiske rester vil være å akkumulere rundt den blå farget kromatin og vil være lett å skille).
   MERK: Mitotiske cellene vil lysere før interphasic celler, men likevel være forsiktig med å overdrive homogenisering for å unngå forurensing med interphasic kjerner og lemlestede kromatin.
5. Umiddelbart lag i hele cellelysatet løpet kalde trinngradienter (med 5 ml 60% kolloidal silikapartiklene løsning på bunnen, belagt med 19,5 ml av glycerol gradient løsning hver) i fem polykarbonat sentrifugeringsrør (28,8 x 107,0 mm, er det anbefalt å plasser rørene på is før for å kjøle dem ned) ved hjelp av en 10 ml pipette. Ikke holde cellene i oppløsning II i lang tid, og dermed er det anbefalt å fremstille rør og gradienten på forhånd (f.eks, i løpet av vasketrinnene).
6. Sentrifuger gradienter for 30 min ved 1000 xg ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
   MERK: Kjerner er ulyserte celler og klynger gjenvinnes sammen ved grenseflaten av glycerol og de kolloidale silikapartiklene lag.
7. Fjern væsken over mellomfase ved hjelp av en pipette og overføre resten til den kalde homogenisator. Re-homogeniseres blandingen ved 3-15 slag (igjen avhengig av digitonin lager) med tett støter for å fjerne aggregater og til å fjerne fibre fra cytoskeletal klyngene. Etter hvert par slag sjekke effektiviteten av homogenisering. Bland 1 mL av prøven med 1 mL av squash fix supplert med DAPI og undersøke under fluorescerende mikroskop.
   MERK: antall slag er avgjørende, tilstedeværelse av klyngen aggregater betyr, at antall slag er utilstrekkelig, mens lemlestede kromatin og kjerner rusk indikere at homogenisering ble for sterk.
8. Distribuere løsningen blant fire nye polykarbonat sentrifugeringsrør (28,8 x107,0 mm) (ca. 10 ml oppløsning per rør) og fylle dem helt opp til 60%, kolloidale silicapartikler løsning (ca. 30 ml, kolloidale silicapartikler oppløsning pr tube).
   MERK: Unngå overbelastning av kolloidalt silikapartiklene gradient siden klynger kan lett bli fanget hvis det er for mye cytoplasma rusk i gradient.
9. Spin i 5 min ved 3000 x g, fulgt av 30 minutter ved 45.440 xg ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
   MERK: Som tidligere vil interphasic kjerner holdes fra å komme inn gradienten (hvis homogenisering ikke ble gjort for tungt som frigjør kjerner fra cytoplasma rusk), men de klynger vil samle seg rundt 1,5 cm fra bunnen av røret, ofte som en løs ball.
10. Fjern væsken over klynger ved hjelp av en pipette, basseng resten i en tube, resuspender godt og omfordele til to polykarbonat sentrifugeringsrør (28,8 x 107,0 mm). Fortynne klyngen suspensjon 1: 4 med løsningen III i hvert rør og bland godt. Mark the-området ble pelleten vil bli og spinne 1000 x g i 15 min ved 4 ° C i en rotor med fast vinkel.
11. Resuspender pellets i Solution III, basseng i en 50 ml konisk sentrifugerør og fylle opp med Solution III. Sentrifuger på bare 300 xg i ca 10 min. Ikke sentrifuger ved høyere hastighet - det kan føre til irreversible aggregering av klynger.
12. Vask en gang med Løsning III i 1,5 eller 2 ml reaksjonsrørene (resuspendere pellets og fyll rørene helt opp) og sentrifuger ved 300 x g. Fjern supernatanten forsiktig med en pipette. Resuspender pellet nøye i 250 mL klynge lagring buffer (hvis du har flere pellets bruke 250 fil for alle sammen og pool dem). Fortynn 5-10 ul av prøven 1: 2 med Trypan blått og teller i Neubauer kammeret. Eventuelt fortynnet mer for å oppnå en omtrentlig konsentrasjon på 500 klynger / ul.
13. Skyv suspensjon gjennom en 100 mikrometer celle sil for å sørge for å fjerne klynge aggregerings som skyldes feil resuspensjon. Klyngene kan lagres i månedsvis i -80 ° C. For å unngå flere gjenfrysing gjøre riktige porsjoner og smekk fryse i flytende nitrogen.

4. Preparater av Buffer for Interphasic Xenopus laevis Egg Extract

MERK: Xenopus laevis frosker vedlikeholdes og behandles i samsvar med de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av konvensjonen av Europarådet om beskyttelse av virveldyr som brukes til eksperimenter og andre formål (EU ratifisert i 1998) og den tyske loven som gjelder bruk av virveldyr i forskning.

1. Forbered DTT og en 100-fold proteasehemmer mix henhold til 1.2.3 og 1.2.4. Oppløs cytokalasin B til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml i DMSO, aliquot (10 eller 20 ul anbefales) og oppbevares ved -20 ° C.
2. Oppløs cykloheksimid til en endelig konsentrasjon på 20 mg / ml i etanol, alikvoter (500 mLanbefales) og oppbevares ved -20 ° C. Oppløs kalsiumionofor A23187 til en sluttkonsentrasjon på 2 mg / ml i etanol, alikvoter og oppbevar ved -20 ° C.
   MERK: PI, kan DTT, cytokalasin B, cykloheksimid og A23187 gjentatte ganger frosset og tint.
3. Forbered 20x Mark modifiserte Ringers buffer (MMR) som inneholder 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM _MgCl2, 40 mM CaCl _{2, 2} mM EDTA og 100 mm Hepes, justere pH til 8,0 med 5 N KOH.
   MERK: 20x MMR kan holdes i løpet av lang tid på RT. Avhengig av mengder av egg, for en utarbeidelse av interphasic egg ekstrakt 1 liter 1x MMR per injisert frosk og ytterligere 5-10 liter for vaske tiltak er nødvendig. Re-juster pH på 1x MMR til 8,0 med 5 N KOH. 1x MMR forberedt på å holde frosker i O / N x 1 bør være på RT. 1x MMR forberedt for traktpreparatet bør holdes kaldt før den brukes, men det er ikke avgjørende for forsøket at 1x MMR er veldig kald.
4. Forbered en L av sucrose buffer inneholdende 250 mM sukrose, 50 mM KCl, 2,5 mM _MgCl2 og 10 mM Hepes pH 7,5. Sukrose buffer bør være fremstilt dagen før bruk sterilt vann og bør holdes ved 4 ° C.
5. Klargjør dejellying løsning nystekte på morgenen av forsøket ved å løse opp 2% L-cystein i 0,25x MMR. Juster pH til 7,8 med 5 N KOH. Hold ved 4 ° C før den brukes.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu s laevis Egg Extract

1. Injisere 120 IE gravid hoppe serum gonadotropin (PMSG) inn i rygg lymfe sac av hver frosk 3-10 dager før forsøket (5 ml sprøyter, 27 G ¾ '' nåler).
   MERK: Dette injeksjon vil indusere eggløsning. Mengden av egg en frosk legger varierer mye. En godt legging frosk kan produsere egg som opptar et volum på opp til 7 ml etter blir de-jellynated som tilsvarer opp til 3,5 ml av råekstraktet. Men tenker på at noen frosker ikke kan legge eller vil lay dårlige egg.
2. Injisere 500 IE humant choriongonadotropin (hCG) per frosk kvelden før forsøket (5 ml sprøyter, 27G ¾ '' nåler). Dette vil indusere frigjøring av eggene. Hold froskene for 13-17 timer ved 18 ° C i enkelte tanker som inneholder 1,2 l 1x MMR (pH 8).
3. Samle eggene ved å helle dem inn 600-1,000 ml glassbegre.
   MERK: Ta bare de gode grupper av egg som er individuelt fastsatt, lik i størrelse og tydelig pigmentert med en mørk og en lys farget halvparten. Ikke ta egg som danner strenger eller som ser puffy og hvitt. Disse bør bli sortert ut gjennom hele fremgangsmåten ved hjelp av en plast Pasteur pipette. For en detaljert beskrivelse av gode versus dårlige egg se Gillespie et al. ⁶
4. Vask egg intensivt, ca 4 ganger, med 1x MMR ved dekantering supernatanten når eggene har slått seg ned og fylle begeret med frisk buffer etterpå.
   MERK:egg er stabile før de dejellynated og vaskebufferen kan direkte brukes på eggene.
5. Dejellynate eggene ved inkubering i 2% cystein oppløsning. Endre buffer gang etter 2-4 min ved dekantering av buffer og grundig fylle begeret med frisk buffer. Considerdejellying komplett når volumet av eggene drastisk reduserer og eggene blir mer tettpakket.
   MERK: dejellying trenger ca 5-7 min og bør stoppes når synlig, men senest etter 10 min.
6. Vask egg ca 4 ganger med 1x MMR ved dekantering og påfylling bufferoverstående.
   MERK: Eggene er mer skjør etter å ha blitt dejellynated og dermed vaske skritt må gjøres mer nøye. MMR bør heller skylles på veggen av begeret i stedet for direkte på eggene.
7. Aktiver egg i 100 ml 1x MMR ved tilsetning av 8 pl av kalsiumionofor (2 mg / ml i etanol). Stopp aktivering når dyret cap sammentrekning værekommer synlig eller etter 10 min.
   MERK: Dyret cap sammentrekning kan identifiseres ved komprimering av den svarte halvparten av egget.
8. Vask nøye fire ganger med 1x MMR ved dekantering og påfylling bufferoverstående.
9. Ruge eggene i 20 minutter i 1x MMR ved RT.
10. Klargjør sentrifugeringsrør under inkubasjonstiden: Place 50 III sukrose buffer, 50 ul 100 gangers protease inhibitor blanding, 5 pl 1 M DTT, 12,5 ul cykloheksimid (for å forhindre translasjon, særlig av cyclin B), og 2,5 ul cytokalasin B (i forhindre aktin polymerisasjon) i 5 ml sentrifugeringsrør (13 x 51 mm). Alternativt, for mer enn 30 ml av egg og 14 ml rør (14 x 95 mm) kan anvendes, i dette tilfellet øke volumene med 2,4 ganger.
11. Vask eggene to ganger med kaldt sukrose buffer (decant og refill buffer i begerglass) og overføre dem til sentrifugeringsrør bruker en plast Pasteur pipette med bred åpning (avskåret den smale enden).
12. Pakkeegg ved å spinne i 1 min ved 130 x g. Sette rørene i 15 ml koniske sentrifugerør for dette formål (sette 14 ml rør i 50 ml konisk sentrifugerør, henholdsvis). Målet er å fjerne så mye buffer som mulig for å hindre fortynning av ekstraktet. Etter sentrifugering, fjerne overflødig buffer med en plast Pasteur pipette og etter hvert fylle flere egg på toppen.
13. Spin i en 6 x 5 ml svinge rotor i 20 minutter ved 21.000 xg ved 4 ° C.
14. Fjern lav hastighet ekstrakt ved hjelp av en 5 ml sprøyte med en 16 G 1? '' P, mellom gul eggeplomme på toppen og mørke brutt egg rusk i bunnen. For dette formål, skyver sprøytespissen gjennom veggen av sentrifugerøret like over laget av knuste egg rusk i bunnen. Hold røret mot motstand når du skyver med nålen.
    MERK: En fylt 5 ml sentrifugering rør gir mellom 1.8 til 2.5 ml ekstrakt.
15. Per 1 ml ekstrakt legge til 10 mikroliter 100 ganger proteasehemmer mix, 1 plav 1 M DTT, 2,5 pl cykloheksimid (20 mg / ml) og 0,5 ul cytokalasin B (10 mg / ml). Hold ekstrakt på is.
    MERK: ekstrakt kan enten brukes direkte for forsøket eller delt i porsjoner, hurtigfrosset og lagret i flytende nitrogen i flere måneder. Frysing ekstrakten vil redusere sin aktivitet. For ømfintlige eksperimenter som immunodepletion er det sterkt anbefalt å bruke fersk ekstrakt umiddelbart.

6. Utarbeidelse av buffere for In Vitro Tilberedning av Chromatin Decondensation

1. Klargjør energiblanding lagerløsning inneholdende 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml kreatinfosfat og 2,5 mg / ml kreatinkinase i buffer som inneholder 250 mM sakkarose, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCl og 0,3 _mM MgCl2. Delmengde og oppbevares ved -80 ° C. Bruk ferskt etter tining, ikke fryses på nytt.
2. Oppløs 0,2 g / ml glykogen i avionisert vann. Oppbevar ved -20 ° C. Oppløs 6-dimetyl-aminopurin (DMAP) til en endelig konsentrasjon0,25 M i DMSO. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. Bruk ferskt etter tining, ikke fryses på nytt.
3. Forbered 30% (w / v) sukrose i PBS, filter og oppbevares ved 4 ° C. Forbered 4% VikiFix løsning som inneholder 80 mm rør pH 6,8, 1 mM _MgCl2, 150 mM sukrose og 4% paraformaldehyde (PFA) (OBS! Arbeide under kjemisk hette, hansker og munnbeskyttelse).
   MERK: PFA er vanskelig å oppløse derfor anbefales det å gjøre det som følgende: For 1 l Viki-Fix oppløse 24,2 g rør og 40 g PFA i separate begre, både i varmt (nesten kokende) avionisert vann. Begge vil oppløse gjennom tilsetning av 10 N NaOH men vær forsiktig med å ikke legge for mye. Legg 51,4 ​​g sukrose og 1 ml 1 M _MgCl2 til PFA løsning. Tilsett PIPES oppløsningen til den andre blandingen. Fyll opp til 1 l sluttvolum og justere pH til nøytral ved å tilsette NaOH.
4. Oppløs 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) i vann (OBS! Bruk hansker). Lagre imørket ved -20 ° C.

7. Protokoll for In Vitro Tilberedning av Chromatin Decondensation

1. Spin lav hastighet interphasic ekstrakt i 12 minutter ved 386 000 xg i en fast vinkel på 20 x 0.2 ml, eller ved 355 000 xg i en 10 x 2,0 ml rotor.
2. Fjern forsiktig lipid lag på toppen ved hjelp av en vakuumpumpe eller pipette og ta supernatanten (senere kalt høy hastighet ekstrakt) å unngå forurensning membranen fra det nederste lag og kast pellet.
   NB: For å unngå mulig forurensning membranen er det tilrådelig å spinne ekstrakt to ganger, eller for å fortynne ekstrakten med 20% av volumet med sukrose-buffer før sentrifugering. Imidlertid kan fortynning og ytterligere sentrifugeringstrinn redusere ekstraktet aktivitet.
3. Pipette 18 mL av høy hastighet ekstrakt i en 1,5 ml reaksjonsrøret, tilsett 0,7 mL mitotisk klynge (beløpet kan bli litt variert i henhold til kromatin lager konsentrasjon), 0,5 ul glykogen, 0,5 ulenergimiks og 0,3 mL DMAP. Bruk tips med bred åpning for å blande reaksjonsblandingen så snart kromatin tilsettes for å hindre avskjæring av decondensing kromatin.
   MERK: Reaksjonen kan utføres i nærvær eller fravær av membraner (se figur 3). For å decondense kromatin i nærvær av membranene, tilsett 2 mL av fløt membraner fremstilt i henhold til den protokoll som er beskrevet av Eisenhardt et al. ¹⁶
4. Inkuber reaksjonsblandingen i opp til 2 timer (eller mindre for å studere tidligere tidspunkt i prosessen decondensation) ved 20 ° C.
5. Fix prøven ved tilsetning av 0,5 ml iskald Viki-Fix inneholdende 0,5% glutaraldehyd og 0,1 mg / ml DAPI og inkubering i 20-30 minutter på is.
   MERK: Hvis prøvene vil bli videre bearbeidet for immunfluorescens, bør fiksering gjøres uten glutaraldehyd da dette ofte forstyrrer antistoffarging. Men hvis bare DAPI flekker vil bli analysert, tillegg av glutaraldehyde vil bevare en bedre kromatinstruktur.
6. Inkuber runde dekkglass (diameter 12 mm) i 5 min med poly-L-lysin-løsning for å øke affiniteten av glassene til kromatin. Tørk Dekk på filterpapir etterpå.
7. Montere flatbunnede sentrifugeringsrør (6 ml, 16/55 mm) ved å sette glassene med den belagte området til toppen på bunnen av sentrifugerøret. Legg 800 mL av 30% sukrose pute og lag den faste prøven på toppen.
8. Spinn i 15 minutter ved 2500 xg ved 4 ° C.
   MERK: flatbunnede sentrifugeringsrør passe til rotorer som tar i bruk 15 ml koniske sentrifugerør.
9. Dekanter supernatanten, og deretter fjerne Dekkglass fra rørene ved å stikke forsiktig i bunnen av sentrifugerøret med en 16 G 1? '' Sprøytenål. For dette formål er båndet lokket av nålen og nålen seg sammen ved deres bunner, og skjære den fremre enden av lokket, slik at nålen stikker omtrent 3mm ut. Når dekk løftes av nålen på ett sted, kan du bruke pinsett for å fjerne dekkglass.
10. Vask dekk raskt ved å dyppe den i avionisert vann, tørk den forsiktig ved å berøre sin side til et filter papir og plassere den på objektglass på en dråpe monterings media. Forsegle den med neglelakk, tørr og holde i mørket.
    MERK: Prøver faste uten glutaraldehyd kan lagres i PBS i en 24-brønns plate og brukes videre for immunfluorescens farging. Hvis lagres i flere dager, tilsett 0,05% natriumazid (OBS! Bruke hansker) til PBS for å unngå forurensning med bakterier.
11. Analysere prøvene av fluorescens mikroskopi av DAPI signal (ved hjelp av for eksempel en konfokal mikroskop med en 405 nm laser).

8. Utarbeidelse av Buffer for Immunfluorescens Farging av In Vitro Rekonstituerte Chromatin Decondensation Samples

1. Forbered PBS i henhold til 1.1.1. Oppløse _NH4CI til en final konsentrasjon på 50 mM i PBS. Hold denne løsningen ved 4 ° C. Oppløs 5 ug / ml i PBS DAPI (forberede ferskt). Tilsett 0,1% Triton X-100 i PBS. Hold ved 4 ° C. Forbered blokkeringsbuffer ferskt før bruk ved å fortynne 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS + 0,1% Triton X-100.

9. Protokoll for Immunfluorescens Farging av In Vitro Rekonstituerte Chromatin Decondensation Samples

MERK:. Alle disse inkuberinger av Dekkglass er laget i en 24-brønners plate med minst 250 mL løsning per brønn, hvis ikke annet er oppgitt In vitro decondensed kromatin prøvene er mer følsomme enn faste celler derfor være forsiktig når du legger til eller fjerner løsninger. Det anbefales å bruke plast Pasteur pipetter kutte kantete. For vasketrinn og sekundært antistoff inkubasjon plassere platen ved RT på gynge eller roterende plattform, flytting ikke fortere enn 100 rpm.

1. Slukke prøver ved inkubasjon dekks med 1 ml _NH4CI i PBS i 5 min. Blokkprøver ved å inkubere dem med 1 ml blokkeringsbuffer i minst 30 min.
2. Sette sammen et fuktighetskammer etter inkubasjonen med det primære antistoff: sette et vått vev på bunnen av en lukkbar boks og lokk av 24-brønners platen opp-ned på toppen av den våte vev. Plasser parafilm i lokket og tilsett 70 pl av antistoffløsningen per prøve på parafilm. For antistoffløsning, fortynnet antiserum eller affinitets-rensede antistoffer 1: 100 i blokkeringsbuffer.
3. Plassere objektglassene opp-ned på toppen av antistoffløsning og inkuber dem i 1 til 2 timer. Plasser glassene tilbake til den 24-brønns plate med prøvesiden vendt opp og vaske prøver tre ganger i 10 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
4. Inkuber Dekk i 1 time ved RT i 250 pl sekundært fluorescerende merket antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer til en konsentrasjon som er anbefalt av produsenten. Beskytt mot lys. Vask three ganger i 10 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
5. Prøvene inkuberes i 10 minutter med 1 ml av 5 ug / ml i PBS DAPI. Vask tre ganger i 5 minutter med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
6. Vask dekk raskt ved å dyppe den i avionisert vann, tørk den forsiktig ved å berøre sin side til et filter papir og plassere den på objektglass på toppen av en dråpe monterings media. Forsegle den med neglelakk, tørr og holde ved 4 ° C i mørket inntil bruk. Analysere prøvene ved fluorescens mikroskopi.

Representative Results

Tidsavhengigheten av decondensation reaksjonen

Figur 1 viser et typisk tidsforløp for decondensation analysen. Klyngen av kromosomer synlige på begynnelsen av reaksjonen decondenses og går over i et enkelt, rund og glatt kjerne. Når egget ekstrakt er erstattet med sukrose-buffer kromosomet klyngen forblir kondensert, noe som tyder på at decondensation-aktivitet er tilstede i egget ekstrakt.

Kromatin decondensation er en energiavhengig prosess

Den in vitro decondensation Reaksjonen kan hensiktsmessig manipulert for eksempel ved tilsetning av inhibitorer. I forsøket vist i figur 2, den ikke-hydrolyserbare GTP-ATP eller analoger, eller ATPγS GTPyS, ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Både hemme decondensation viser, at det er en ATP og GTP avhengig, aktiv prosess (figur 2).

Den decondensation Analysen ble utført i nærvær eller fravær av membraner (figur 3). Vær oppmerksom på at i begge forholdene kromatin gjennomgår decondensation, men tillegg av membraner resultatene i større kjerner. Mest sannsynlig, induserer reformasjon av den kjernefysiske konvolutten en sekundær decondensation steg enda en mekanisme avhengig av kjernekraft transport.

Figur 1. Tidsforløp av th e in vitro decondensation reaksjon. Mitotisk kromatin klynger fra HeLa-celler ble inkubert med interphasic Xenopus egg ekstrakt. Prøvene ble fiksert ved angitte tidspunkter med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd, farvet med DAPI og analysert ved ko nfocal mikroskopi. Re-skrives ut fra Magalska et al. ^8. Scale bar er 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Chromatin decondensation krever ATP og GTP hydrolyse. Chromatin decondensation ble utført i nærvær av 10 mM ATPγS, 10 mM GTPyS eller kontrollbuffer. Prøvene ble fiksert med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd ved angitte tidspunkter og analysert ved konfokal mikroskopi. Re-skrives ut fra Magalska et al. ^8. Scale bar er 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 "src =" / filer / ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg "/>
Figur 3. Chromatin decondensation i nærvær og fravær av membraner. Chromatin decondensation ble utført i fravær (A) eller nærvær (B) av flyte renset membraner for 120 min. Prøvene ble fiksert med 4% PFA og 0,5% glutaraldehyd og analysert ved konfokal mikroskopi. Kromatin er farget med DAPI, membraner med DiIC _{18 (1,1'-dioktadekyl-3,3,3} ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat). Scale bar er 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Xenopus laevis egg ekstrakter er et svært nyttig verktøy for å gjengi cellulære prosesser in vitro, og dette systemet ble brukt i karakterisering av cellesyklus og celledeling hendelser ^{2, 3,5,6,17.} På grunn av store lagre av kjernekomponentene deponeres i egget under oogenesen, egg ekstrakter er en utmerket kilde til cellulære komponenter. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som RNAi i mammalske vev cellelinjer eller genetisk manipulasjon, det gir flere fordeler: Det cellefrie system gjør det mulig å studere cellulære prosesser hvor cellulær levedyktighet ellers ville være en begrensning. Videre enkelttrinn av komplekse prosesser kan analyseres i enkle assays. Den her presenteres decondensation analysen kan studere molekylære mekanismer for postmitotic decondensation uten forstyrrelser fra andre mitotiske hendelser, henholdsvis. Xenopus egg ekstrakter er lett å manipulere ved uttømming av spesifikke proteinerog tillegg av hemmere eller muterte proteiner ^8. For eksempel viser figur 2 viser resultatet av å tilsette den ikke-hydrolyserbare GTP-analoger eller ATP, ATPγS og GTPyS til decondensation analysen. Ved fortynning og differensialsentrifugering av Xenopus-egg komponenter som membraner og cytosol kan separeres ^16. Figur 3 viser decondensation assay utføres i nærvær eller fravær av membraner. Endelig kan det cellefrie analysen også anvendes for å identifisere nye faktorer som for eksempel ved en fraksjonerings tilnærming. Ved hjelp av en slik strategi vi har identifisert AAA ⁺ -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 som avgjørende decondensation faktorer ^8.

In vitro-systemer basert på X. laevis egg har vært ansatt i ulike DNA-maler. Forbes et al viste at injeksjon av fag λ DNA i ubefruktet X. laevis egg indusert montering av kromatin på NAKed fag λ DNA. Injeksjon av viral DNA aktivert egget, ble sammensetningen av kromatin, etterfulgt av dannelse av en kjerne lignende struktur ¹⁸ og tilsvarende λ-fag-DNA kan anvendes i kombinasjon med egg ekstrakter for å generere kjernen lignende strukturer in vitro ^19. Magnetiske kuler belagt med DNA har blitt brukt til å studere chromatinization av DNA ^{20 og} rekruttering av kjernefysiske membraner ²¹ samt montering av en kjernefysisk konvolutt og pore komplekser ^22, selv om det fortsatt er åpent i hvilken grad dette lignet en bona fide atom re-oppsettingen . Protokollen presenteres her gir decondensation av isolerte mitotiske kromatin klynger fra HeLa celler ved hjelp av ekstrakt generert fra aktiverte Xenopus egg. Det grundig rekonstruerer hendelsene som førte til en reformasjon av en interphasic kjernen ^8. Sammenlignet med mye brukt kjernesammenstilling reaksjon benyttet for å studere dannelsen av konvolutten og atomatom pore kompleksene ved slutten av mitose i HeLa decondensation analyse mitotisk kromatin klynger i stedet for sperm-DNA blir brukt. Sperm DNA kan settes sammen til mitotisk kromatin eller individuelle kromosomer ved inkubasjon med ekstrakt fremstilt av ubefruktede og ikke-aktivert egg ^3. Vi valgte å bruke mitotiske klynger som kromatin kilde til forenkle saksbehandlingen og unngå innblanding fra kromatin kondens. I tillegg er fremstillingen av egget ekstraktet litt modifisert: For kromatin decondensation lav hastighet ekstrakt fjernet ved to høyhastighetssentrifugeringstrinnene i fast vinkel rotorer anvendes. Lav hastighet ekstrakt kan lagres i opptil seks måneder i flytende nitrogen uten å miste sin aktivitet. I motsetning til dette, i atommonterings reaksjoner er cytosol og fløt membraner som genereres fra lav hastighet ekstrakter etter fortynning og differensialsentrifugering med høy hastighet før mulig frysing (se Eisenhardt et al. ^{16 for} en detaiført protokoll). I vårt assay system, tillater tilsetning av membraner dannelse av en lukket konvolutt atom inkludert nukleære porer komplekser. De resulterende kjerner er kompetente for kjernekraft import og eksport ^8. Dermed støtter dette systemet både kromatin decondensation og kjernekraft konvolutt reformasjon. Interessant er kromatin decondensation også mulig i fravær av membraner (figur 3). Men tillegg av membraner resultater i litt større kjerner. Mest sannsynlig, induserer reformasjon av den kjernefysiske konvolutten en sekundær decondensation steg ennå udefinerte mekanismer, som avhenger av kjernekraft import.

For isolering av mitotiske kromatin klynger fra HeLa-celler, var en modifisert versjon av protokollen etablert av Gasser og Laemmli ¹⁵ brukt. Synkroniserte mitotiske celler blir lysert i en buffer inneholdende den ikke-ioniske detergent digitonin og ved mekanisk krefter. Kromatinet er isolert som klynger som inneholderalle kromosomene fra én kjerne. Den avgjørende forskjell i forhold til enkelt kromosom isolasjonsmetoder er det faktum at cellene ikke er hypotonisk svellet, men kjøles ned til 4 ° C før lysis. Dette forhindrer frakobling av de enkelte kromosomer ^{15, 23.} Sammenlignet med den protokoll som er publisert av JR Paulson ²³ som erkjente den fordel isolering av hele kromatin klynger, Gasser og Laemmli brukt EDTA-holdig polyamin buffere i stedet for Mg ²⁺ basert buffere for å redusere aktiviteten av kinaser, proteaser og nukleaser, og fosfataser ved dette redusere mengden av protein og DNA-modifiseringer som forekommer i løpet av ¹⁵ isolasjonsprosess. I tillegg, ved anvendelse av en gradient, kolloidale silicapartikler under differensialsentrifugering sterkt reduserer cytoplasmisk forurensning. Protokollen kan også brukes til å isolere mitotiske kromatin klynger fra kinesisk hamster eggstokk og museceller ^15.

av in vitro kromatin decondensation kan være i det minste delvis forklares ved involvering av RuvBL1 / 2, men også en annen AAA ⁺ -ATPase, p97, som fjerner den mitotiske Aurora-kinase B fra kromatin under mitotiske utgang ^24. Hvorfor krever prosessen GTP hydrolyse er en av de åpne spørsmålene som vi har tenkt å svare med dette oppsettet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1