Introduction
Extracto de huevo Xenopus laevis es una herramienta poderosa y ampliamente aplicada para estudiar eventos celulares complicados en la simplicidad de un ensayo libre de células. Desde su primera descripción por Lohka y Masui 1 se han utilizado ampliamente para estudiar procesos mitóticos tales como la condensación de la cromatina 2, conjunto de husillo 3, la envoltura nuclear desglose 4, sino también el transporte nucleocytoplasmic 5 o 6 replicación del ADN. Los eventos que tienen lugar al final de la mitosis, necesarios para la reforma del núcleo interfásico tales como reforma envoltura nuclear y de poro nuclear reensamblaje complejo son mucho menos comprendido en comparación con los primeros eventos mitóticas, pero pueden ser estudiadas de manera similar utilizando extracto de huevo de Xenopus 7. Hemos establecido recientemente un ensayo basado en extracto de huevo de Xenopus para estudiar descondensación de la cromatina en el final de la mitosis 8, un proceso de bajo-investigado que i esperats caracterización detallada.
En metazoos, la cromatina se condensa altamente en la entrada mitótica el fin de realizar fielmente la segregación del material genético. Para asegurar que la cromatina es accesible para la expresión génica y la replicación del ADN durante la interfase, necesita ser compactado DE AT el final de la mitosis. En los vertebrados, la cromatina es hasta cincuenta veces más compactado durante la mitosis en comparación con la interfase 9, en contraste con las levaduras, donde la compactación mitótico es generalmente mucho más baja, por ejemplo, sólo dos veces en S. cerevisiae 10. Descondensación de la cromatina vertebrado se ha estudiado principalmente en el contexto de la reorganización de ADN de esperma después de la fertilización del huevo. Un mecanismo molecular, en el que nucleoplasmin, una proteína abundante ovocito, intercambia protaminas-esperma específica a las histonas H2A y H2B almacenados en el huevo. Este proceso también fue dilucidada mediante Xenopus extracto de huevo 11, 12. Sin embargo, la expresiónde nucleoplasmin se limita a los oocitos 13 y la cromatina mitótica no contiene estos protaminas-esperma específico. Por lo tanto la cromatina descondensación al final de la mitosis es independiente nucleoplasmin 8.
Para la reacción descondensación in vitro empleamos extracto generado a partir activados huevos X. laevis y clusters cromatina aislados de células HeLa sincronizados. El tratamiento de los huevos con un ionóforo de calcio imita la liberación de calcio en el ovocito generada por la entrada de espermatozoides durante la fertilización. La ola de calcio desencadena el reinicio del ciclo celular y el huevo, detenido en la segunda metafase de la meiosis, avanza a la primera interfase 14. Por lo tanto, los extractos de huevos preparados de forma activa los huevos representan el estado de salida / interfase mitótica y son competentes para inducir eventos específicos para la salida de mitosis como descondensación cromatina, envoltura nuclear y poros reforma compleja. Para el aislamiento de ch mitóticoromatin grupos se utilizó una versión ligeramente modificada del protocolo publicado por Gasser y Laemmli 15, donde grupos de cromosomas son liberadas por la lisis de las células HeLa sincronizados en la mitosis y aislados en poliaminas que contiene tampones por centrifugaciones gradiente.
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Protocol
Mitótico cromatina Aislamiento Cluster de células HeLa
1. Preparativos
- Soluciones de cultivo celular
- Preparar medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) mediante la adición de 10% de suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM a la DMEM. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O y 2 mM KH 2 PO 4 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7,4 con 10 N de NaOH.
NOTA: PBS se puede mantener como solución madre 10x con el tiempo a temperatura ambiente. Diluir con agua desionizada a 1x antes de su uso. Filtrar la solución 1x de nuevo si se va a utilizar en el cultivo celular. - Preparar un stock de 40 mM de solución de timidina (cultivo celular adecuado) en medio DMEM. Disolver 0,97 g de timidina en 90 ml de medio DMEM. Ajustar el volumen final de 100 ml. Solución de tienda de stock a -20 °C. Disolver (PRECAUCIÓN! Funciona bajo el capó químicos, use guantes y protección de la boca) nocodazol a una solución de 5 mg / ml en DMSO.
- Preparar medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) mediante la adición de 10% de suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM a la DMEM. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O y 2 mM KH 2 PO 4 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7,4 con 10 N de NaOH.
- Mitótico Clusters de aislamiento Soluciones
NOTA: Todas las soluciones descritas en 1.2 deben mantenerse en hielo después de la preparación / descongelación durante todo el experimento.- Agua desionizada Autoclave en 105 min a 121 ° C. Disolver tetrahidrocloruro de espermina en autoclave, agua desionizada hasta una concentración final de 200 mM (69,6 mg / ml). Tienda solución madre a -20 ° C. Disolver trihidrocloruro de espermidina en autoclave, agua desionizada hasta una concentración final de 200 mM (50,8 mg / ml). Tienda solución madre a -20 ° C.
- Preparar 5% (w / v) digitonina (PRECAUCIÓN trabajar bajo el capó química, usar guantes y protección de la boca) en agua desionizada caliente. Filtrar y almacenar alícuotas a -20 ° C. Disolver el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (PRECAUCIÓN trabajar undecampana química r, usar guantes y protección para la boca) a una concentración final de 200 mM (35 mg / ml) en etanol al 100%. Tienda solución madre a -20 ° C.
- Disolver ditiotreitol (DTT) con agua desionizada a una concentración final de 1 M (154 mg / ml) (PRECAUCIÓN! Funciona bajo el capó química, usar guantes). Solución Filtrar y almacenar valores a -20 ° C.
- Preparar una mezcla de 100 veces inhibidor de la proteasa (PRECAUCIÓN trabajar bajo campana química, usar guantes!) Por disolución de 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml de leupeptina, 0,1 mg / ml de pepstatina y 0,2 mg / ml de aprotinina en agua desionizada. Tienda solución madre a -20 ° C.
- Preparar una solución de stock de 10x de tampón A que contiene 150 mM de Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM tetrahidrocloruro de espermina y espermidina 5 mM trihidrocloruro. Un tampón tienda a 4 ° C sin tetrahidrocloruro de espermina y espermidina trihidrocloruro, que debe añadirserecién justo antes de usar.
NOTA: EDTA solamente se disuelve a pHs superiores a 8, por lo tanto, para preparar una solución de EDTA-KOH madre concentradas alta (0,5 M recomendado), añadir 5 N de KOH a pH 8 justo por encima para que se disuelva. Posteriormente se valora hasta pH 7,4. - Preparar una solución de tampón 20x de stock Como que contiene 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), KCl 400 mM, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) y 5 mM espermidina trihidrocloruro. Buffer Como se puede almacenar bajo mismas condiciones que el tampón A.
NOTA: Prepare las soluciones de trabajo I a IV (ver en los siguientes pasos), el gradiente de glicerol y las soluciones de las partículas de sílice coloidal que contienen partículas de sílice (15 a 30 nm de diámetro) recubiertas con polivinilpirrolidona no dializable (PVP) recién justo antes del aislamiento procedimiento (PMSF y digitonina deben añadirse directamente antes de su uso como PMSF es lábil en soluciones acuosas y digitonina tiende a precipitar durante el almacenamiento a largo plazo en hielo). - Preparar 100 ml de solución I mediante la adición de tampón 0.5x A,1 mM de DTT, 1: 100 de la mezcla de inhibidor de proteasa y 0,1 mM PMSF en autoclave, agua desionizada. Preparar 50 ml de solución II (para la lisis celular) mediante la adición de tampón 1x A, 1 mM de DTT, 1: 100 de la mezcla de inhibidor de proteasa, PMSF 0,1 mM, 0,1% de digitonina y 10% de glicerol en autoclave, agua desionizada.
- Preparar 200 ml de solución III que contiene tampón 0.25x A, 1 mM DTT, 1: 100 de la mezcla de inhibidor de proteasa, PMSF 0,1 mM y 0,05% de digitonina en autoclave, agua desionizada. Preparar 40 ml de solución IV que contenían tampón 1x As, 1 mM de DTT, 1: 100 de la mezcla de inhibidor de proteasa, PMSF 0,1 mM y 0,1% de digitonina en autoclave, agua desionizada.
- Preparar 120 ml de solución de gradiente de glicerol mediante la adición de 25% de glicerol y 0,1% de digitonina a la solución I.
- Preparar 150 ml de solución coloidal de sílice que contienen partículas de 60% v / v (volumen por volumen) de una suspensión que contiene partículas de sílice (diámetro de 15 a 30 nm) recubierta con polivinilpirrolidona no dializable (PVP), 15% de glicerol, 2 mM spermidine triclorhidrato y 0,8 mM tetrahidrocloruro espermina en solución IV.
- Preparar tampón de almacenamiento de clúster que contiene sacarosa 250 mM, Hepes 15 mM (pH 7,4), 0,5 mM de espermidina trihidrocloruro, 0,2 mM espermina tetrahidrocloruro, 1: 100 de la mezcla de inhibidor de la proteasa, 0,3% de BSA y 30% de glicerol. El buffer de almacenamiento del clúster puede mantenerse a -20 ° C.
- Preparar solución de arreglo calabaza contiene 10% de formaldehído (PRECAUCIÓN trabajar bajo el capó química, usar guantes), 50% de glicerol, doble búfer Timbres Modificado de Mark (MMR ver 4.5.) Y 0,2 g / ml DAPI (PRECAUCIÓN! Usar guantes). Almacenar a 4 ° C en tubos de reacción de luz protegido. No es crucial para el experimento de usar esta receta fix squash, recetas alternativas también funcionan.
2. La sincronización de las células
- En el Día 1: Semilla células HeLa de cada cinco 75 cm 2 (250 ml) frascos con medios e incubar a 37 ° C en el 5% de CO 2.
NOTA: Esto producirá en aproximadamente 18 x 10 6 células en el día de aislamiento clúster cromatina. - En el Día 2: Cuando las células son al menos 50% de confluencia (aproximadamente la mitad de la superficie está cubierta por las células y todavía hay espacio para las células para crecer), añadir timidina a una concentración final de 2 mM (bloque de timidina) y células de cultivo para 24 horas a 37 ° C en 5% de CO 2.
NOTA: Esto arrestar a las células en la fase G1 / S frontera. - En el Día 3: Aspirar medio que contiene timidina y añadir PBS estéril. Lavar las células por delicado de lavado con PBS estéril. Aspirar PBS y añadir suavemente 15-20 ml de, medianas y cultura células DMEM completo calientes frescas durante 3 a 4 horas a 37 ° C en 5% de CO 2 a los dejen en libertad desde el bloque G1 / S-fase.
- El día 3 (continuación): Después de la liberación de las células desde el bloque de G1 / S-fase, añadir nocodazol a una concentración final de 100 ng / ml. Diluir nocodazol mediante la adición de 2 l de solución madre (5 mg / ml) a 98l de medio DMEM fresco, y añadir 1 l de diluirse nocodazol por cada ml de cultivo celular. Células de cultivo para aproximadamente 12 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. Esto bloqueará las células en mitosis.
3. Mitótico Clusters Aislamiento
- El día 4: Aislar racimos mitótico. El uso de un microscopio de campo claro, compruebe si la mayoría de las células son mitótico. Si es menos de 50% de las células son mitótico espera hasta que más células alcanzan la mitosis. Recoger las células mitóticas tocando vigorosamente en el lado del matraz (o por pulverización suavemente con la pipeta), esto separar las células mitóticas restantes. Transferir la suspensión celular a tubos de centrífuga cónicos de 50 ml.
NOTA: las células mitóticas se vuelven redondas y pueden ser fácilmente separados del matraz de fondo (al igual que las células después de tripsinización), a diferencia de las células en otras fases del ciclo celular, que son planas y firmemente unido al matraz. - Cosecha de células mitóticas haciendo girar los tubos a 1.500 xg durante 10 min (476; C o RT) y eliminar el sobrenadante después. Resuspender el sedimento celular en 8 ml de PBS, piscina en uno 50 ml tubo de centrífuga cónico, llenar el tubo completamente con PBS y girar de nuevo durante 10 min a 1500 x g. Repita este procedimiento de lavado tres veces en total.
- A partir de ahora realizar todos los pasos en el hielo con soluciones frías. Vigorosamente resuspender el precipitado en 37 ml de solución fría II. Transferir la suspensión a un 40 ml frío homogeneizador de vidrio-vidrio usando una pipeta de 25 ml y lisar células en hielo por douncing con una mano de mortero ajustado hasta racimos mitóticas son libres de material citoplasmático. El número de carreras es altamente dependiente en la Bolsa de digitonina y puede variar de 3 a 20 veces.
NOTA: La homogeneización puede ser bastante fuerte, pero se debe considerar completa cuando casi todas las células mitóticas se lisan y los grupos se observa que son libres de material citoplásmico (véase 3.4). - Después de un par de golpes mezclar 10.5 l de la suspensión celular 1: 2 con tripán azul y compruebe por microscopy en una cámara de Neubauer. Cromatina Cuando se lisan las células se tiñe de azul y libre de las membranas celulares (NOTA: posibles restos citoplasmáticos serán acumulan alrededor de la cromatina de colores azul y será fácil de distinguir).
NOTA: las células mitóticas se lisan las células antes interfásicos pero sin embargo ten cuidado de no exagerar homogeneización con el fin de evitar la contaminación con núcleos interfásicos y cromatina destrozado. - Capa inmediatamente todo el lisado celular sobre gradientes escalonados fríos (con 5 ml de coloidal solución de partículas de sílice 60% en la parte inferior, superpuesta con 19,5 ml de una solución de gradiente de glicerol cada uno) en cinco tubos de centrifugación de policarbonato (28,8 x 107,0 mm, se recomienda colocar los tubos en hielo antes de enfriar hacia abajo) utilizando una pipeta de 10 ml. No mantener las células en solución II por un largo tiempo, lo que se recomienda para preparar los tubos y el gradiente de antemano (por ejemplo, durante las etapas de lavado).
- Centrifugar los gradientes de 30 min en 1000 xga 4 ° C en un rotor de ángulo fijo.
NOTA: Los núcleos, las células no lisadas y los racimos se recuperan juntos en la interfaz del glicerol y las partículas de sílice coloidal capas. - Retirar el líquido por encima de la interfase con una pipeta y transferir el resto a la homogeneizador frío. Mezcla de Re-homogeneizar por 3-15 golpes (de nuevo dependiendo de la acción digitonina) con la mano del mortero ajustado para eliminar los agregados y para eliminar las fibras del citoesqueleto de las agrupaciones. Después de cada par de golpes de comprobar la eficacia de la homogeneización. Mezclar 1 l de la muestra con 1 l de solución de squash suplementadas con DAPI y examinar bajo el microscopio fluorescente.
NOTA: El número de carreras es crucial, la presencia de agregados de clúster de medios, que el número de golpes es insuficiente, mientras que la cromatina destrozado y escombros núcleos indican que la homogeneización era demasiado fuerte. - Distribuir la solución entre los cuatro nuevos tubos de centrifugación de policarbonato (28,8 x107.0 mm) (solución aprox. 10 ml por tubo) y llenar por completo con solución de partículas de sílice coloidal 60% (aprox. 30 ml de solución coloidal partículas de sílice por tubo).
NOTA: Evite sobrecargar el coloidal partículas de sílice gradiente desde grupos pueden ser fácilmente atrapados si hay demasiado escombros citoplasmática en el degradado. - Centrifugado durante 5 min a 3.000 xg, seguido por 30 min a 45.440 xg a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo.
NOTA: Como antes, los núcleos interfásicos se mantendrán de entrar en el gradiente (si homogeneización no se ha hecho demasiado que libera núcleos de los escombros citoplasmática), pero los grupos se acumulará alrededor de 1,5 cm desde la parte inferior del tubo, a menudo como una bola suelta. - Retire el líquido por encima de los grupos utilizando una pipeta, agrupar el resto en un tubo, resuspender bien y redistribuir a los dos tubos de centrifugación de policarbonato (28,8 x 107,0 mm). Diluir la suspensión grupo 1: 4 con solución III en cada tubo y mezclar bien. Marcos ªe sitio fueron el sedimento será girar y 1.000 xg durante 15 min a 4 ° C en un rotor de ángulo fijo.
- Resuspender los pellets en Solución III, piscina en el tubo de centrífuga cónico uno 50 ml y llenar con la solución III. Centrifugar a tan solo 300 g durante aproximadamente 10 min. No centrifugar a mayor velocidad - que podría causar la agregación irreversible de clusters.
- Lavar a continuación con la solución de III en 1,5 o 2 ml tubos de reacción (resuspender las bolitas y rellenar los tubos completamente en adelante) y centrifugar a 300 x g. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Resuspender pellet cuidadosamente en 250 buffer de almacenamiento del clúster l (si tiene varias bolitas utilizan 250 l para todos juntos y piscina para ellos). Diluir 5 a 10 l de la muestra 1: 2 con azul de tripano y contar en la cámara de Neubauer. Si procede más diluida para obtener una concentración aproximada de 500 racimos / l.
- Empuje la suspensión a través de un filtro de células 100 micras para asegurarse de eliminar la agregación de clústers resultante de resuspensión inadecuada. Los racimos se pueden almacenar durante meses en -80 ° C. Para evitar múltiples recongelamiento hacen alícuotas apropiadas y complemento de congelación en nitrógeno líquido.
4. Preparación de Tampón de interfásico Xenopus laevis Extracto de huevo
NOTA: Xenopus laevis ranas son mantenidos y tratados de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Convención del Consejo de Europa sobre la protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros (UE ratificado en 1998) y la ley alemana relativa a el uso de animales vertebrados en la investigación.
- Preparar la TDT y un 100 veces la mezcla de inhibidor de proteasa de acuerdo con 1.2.3 y 1.2.4. Disolver citocalasina B a una concentración final de 10 mg / ml en DMSO, alícuota (10 o 20 l recomendado) y almacenar a -20 ° C.
- Disolver la cicloheximida a una concentración final de 20 mg / ml en etanol, alícuota (500 lrecomendada) y almacenar a -20 ° C. Disolver el ionóforo de calcio A23187 a una concentración final de 2 mg / ml en etanol, alícuota y almacenar a -20 ° C.
NOTA: PI, TDT, citocalasina B, la cicloheximida y A23187 se pueden congelar y descongelar repetidamente. - Preparar 20x tampón de Mark Modificado Ringers (MMR) que contenía NaCl 2 M, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl 2, EDTA 2 mM y Hepes 100, ajustar el pH a 8,0 con 5 N de KOH.
NOTA: El 20x MMR se puede mantener durante mucho tiempo a temperatura ambiente. En función de las cantidades de huevos, para una preparación de extracto de huevo interfásico 1 l de 1x MMR por rana inyectado y un adicional de 5-10 litros para los pasos de lavado son necesarios. Vuelva a ajustar el pH de 1x MMR a 8,0 con 5 N de KOH. 1x MMR preparado para mantener las ranas en O / N x 1 debe estar a temperatura ambiente. 1x MMR preparado para la preparación del extracto debe mantenerse fría hasta que se utiliza, sin embargo, no es crucial para el experimento que el 1x MMR es realmente frío. - Preparar 1 L de suctampón que contenía sacarosa 250 mM, KCl 50 mM, 2,5 mM de MgCl 2 mM Hepes y 10 pH 7,5 rosa. Tampón de sacarosa se debe preparar el día antes de usar agua estéril y debe mantenerse a 4 ° C.
- Preparar la solución dejellying recién en la mañana del experimento disolviendo 2% de L-cisteína en MMR 0.25x. Ajustar el pH a 7,8 con KOH 5 N. Mantener a 4 ° C hasta que se utiliza.
5. Protocolfor interfásico Xenopu s Extracto de huevo laevis
- Inyectar 120 IE gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) en el saco linfático dorsal de cada rana 3-10 días antes del experimento (5 ml jeringas, 27 G ¾ '' agujas).
NOTA: Esta inyección induce la ovulación. La cantidad de huevos uno rana establece varía mucho. Una rana bien por el que se podría producir huevos que ocupan un volumen de hasta 7 ml después de ser-jellynated des lo que corresponde a un máximo de 3,5 ml de extracto crudo. Sin embargo, consideran que algunas ranas podrían no laicos o lo hará lahuevos malos y. - Inyectar 500 IE gonadotropina coriónica humana (hCG) por la rana la noche antes del experimento (5 ml jeringas, 27G ¾ '' agujas). Esto induce la liberación de los huevos. Mantenga las ranas de 13 a 17 horas a 18 ° C en tanques individuales que contienen 1,2 l 1x MMR (pH 8).
- Recoge los huevos mediante el vertido de ellos en 600-1.000 ml vasos de vidrio.
NOTA: Tome sólo los buenos lotes de huevos que se establecen de forma individual, similar en tamaño y claridad pigmentadas con un oscuro y una media de color claro. No tome los huevos que forman cadenas o que hinchada mirada y blanco. Estos deben ser ordenados a lo largo de todo el procedimiento utilizando un plástico pipeta Pasteur. Para una descripción detallada del bien contra el mal huevos ver Gillespie et al. 6 - Lavar los huevos intensamente, aproximadamente 4 veces, con 1x MMR por decantación el sobrenadante cuando los huevos se han establecido y volver a llenar el vaso con tampón fresco después.
Nota lalos huevos son estables antes de que se dejellynated y el tampón de lavado se pueden aplicar directamente sobre los huevos. - Dejellynate los huevos por incubación en la solución de cisteína 2%. Cambie tampón una vez después de 2-4 min por decantación el tampón y llenando cuidadosamente el vaso de precipitados con tampón fresco. Considerdejellying completa cuando el volumen de los huevos disminuye drásticamente y los huevos llegar a ser más densamente lleno.
NOTA: El dejellying necesita aproximadamente 5-7 minutos y debe ser detenido cuando visible pero más tardar después de 10 min. - Huevos Lave aproximadamente 4 veces con 1x MMR por decantación y rellenar el sobrenadante búfer.
NOTA: Los huevos son más frágiles después de haber sido dejellynated y, por lo tanto, las etapas de lavado deben llevarse a cabo con más cuidado. La MMR se debe más bien se enjuaga en la pared del vaso de precipitados en lugar de directamente sobre los huevos. - Activar huevos en 100 ml 1x MMR mediante la adición de 8 l de la ionóforo de calcio (2 mg / ml en etanol). Deje de activación cuando la contracción casquillo animal seaviene visible o después de 10 min.
NOTA: La contracción casquillo animal puede ser identificado por la compactación de la media negro del huevo. - Lave cuidadosamente 4 veces con 1x MMR por decantación y rellenar el sobrenadante búfer.
- Incubar los huevos durante 20 min en 1x MMR a TA.
- Preparar los tubos de centrifugación durante el tiempo de incubación: Lugar 50 l de tampón sacarosa, 50 l de 100 veces la mezcla de inhibidor de la proteasa, 5 l 1 M TDT, 12,5 l cicloheximida (para evitar la traducción, especialmente de la ciclina B) y 2,5 l citocalasina B (para prevenir la polimerización de actina) en 5 ml tubos de centrifugación (13 x 51 mm). Alternativamente, para más de 30 ml de huevos, 14 ml tubos (14 x 95 mm) se pueden utilizar, en este caso incrementar los volúmenes en 2,4 veces.
- Lavar los huevos dos veces con tampón frío sacarosa (decantación y tampón de recarga en el vaso de precipitados de vidrio) y transferirlos a tubos de centrifugación utilizando una pipeta Pasteur de plástico con abertura amplia (cortar el extremo estrecho).
- Paquetehuevos por girar durante 1 min a 130 x g. Poner los tubos en tubos de 15 ml centrífuga cónicos para este propósito (por poner los tubos de 14 ml en tubos de 50 ml centrífuga cónicos, respectivamente). El objetivo es eliminar la mayor cantidad de tampón como sea posible para evitar la dilución del extracto. Después de la centrifugación, eliminar el exceso de tampón utilizando un plástico pipeta Pasteur y eventualmente llenar más huevos en la parte superior.
- Girar en un 6 x 5 ml oscilación del rotor durante 20 min a 21.000 xg a 4 ° C.
- Retire extracto de baja velocidad usando una jeringa de 5 ml con un 16 G 1 ½ '' de la aguja, entre yema amarilla en la parte superior y los restos de huevo roto oscura en la parte inferior. Para este propósito, empuje la aguja de la jeringa a través de la pared del tubo de centrífuga justo por encima de la capa de escombros de huevo roto en la parte inferior. Mantenga el tubo contra una resistencia al empujar con la aguja.
NOTA: Un tubo de centrifugación 5 ml llena da entre 1.8 a 2.5 ml de extracto. - Por 1 ml de extracto de añadir 10 l de 100 veces la mezcla inhibidor de la proteasa, 1 lde 1 M DTT, 2,5 l de cicloheximida (20 mg / ml) y 0,5 l citocalasina B (10 mg / ml). Mantenga el extracto en el hielo.
NOTA: El extracto se puede utilizar ya sea directamente o para el experimento se dividió en alícuotas, se congelaron rápidamente y se almacenaron en nitrógeno líquido durante varios meses. Congelar el extracto disminuirá su actividad. Para delicados experimentos como immunodepletion es muy recomendable utilizar el extracto fresco inmediatamente.
6. Preparación de tampones para In Vitro La reconstitución de la cromatina descondensación
- Preparar la solución energética mezcla madre que contiene 25 mM de ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / fosfato de creatina ml y 2,5 mg / ml de creatina quinasa en tampón que contenía sacarosa 250 mM, 1,2 mM Hepes, 5.9 mM KCl y 0,3 mM de MgCl 2. Alícuota y almacenar a -80 ° C. Utilice recién después de la descongelación, no volver a congelar.
- Disolver 0,2 g / ml de glucógeno en agua desionizada. Almacenar a -20 ° C. Disolver aminopurina 6-dimetil (DMAP) a una concentración finalde 0,25 M en DMSO. Alícuota y almacenar a -20 ° C. Utilice recién después de la descongelación, no volver a congelar.
- Preparar 30% (w / v) de sacarosa en PBS, filtrar y almacenar a 4 ° C. Prepare la solución VikiFix 4% que contiene 80 mM TUBOS pH 6,8, 1 mM MgCl 2, 150 mM de sacarosa y el 4% de paraformaldehído (PFA) (PRECAUCIÓN! Funcionan bajo el capó química, usar guantes y protección de la boca).
NOTA: El PFA es difícil de disolver, por lo tanto se recomienda hacerlo de la siguiente manera: Para 1 l Viki-Fix disolver 24,2 g TUBOS y 40 g de PFA en vasos separados, tanto en caliente (casi hirviendo) agua desionizada. Ambos se disuelven mediante la adición de NaOH 10 N, pero tenga cuidado de no poner demasiado. Añadir 51,4 g de sacarosa y 1 ml 1 M de MgCl 2 a la solución de PFA. Añadir la solución de tuberías a la otra mezcla. Llenar hasta 1 l de volumen final y ajustar el pH a neutro mediante la adición de NaOH. - Disolver 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en agua (¡CUIDADO! Usar guantes). Almacenar enla oscuridad a -20 ° C.
7. Protocolo para In Vitro La reconstitución de la cromatina descondensación
- Girar extracto de interfásico baja velocidad durante 12 min a 386.000 xg en un ángulo fijo de 20 x 0,2 ml o al 355 000 xg en un rotor 10 x 2,0 ml.
- Eliminar suavemente la capa lipídica en la parte superior usando una bomba de vacío o una pipeta y tomar el sobrenadante (extracto de llamada a partir de entonces de alta velocidad) evitando la contaminación de la membrana de la capa inferior y desechar el sedimento.
Nota: Para reducir la posible contaminación de la membrana, es aconsejable hacer girar el extracto dos veces o para diluir el extracto con 20% del volumen con tampón de sacarosa antes de la centrifugación. Sin embargo, la dilución y etapas de centrifugación adicionales pueden reducir la actividad de extracto. - Pipetear 18 l de extracto de alta velocidad en un tubo de 1,5 ml de reacción, añadir 0,7 l clúster mitótico (cantidad puede variar ligeramente según la acción concentración de cromatina), 0,5 l de glucógeno, 0,5 lmix energético y 0,3 l de DMAP. Utilice consejos con amplia abertura para mezclar la reacción tan pronto como se añade la cromatina para evitar el cizallamiento del cromatina decondensing.
NOTA: La reacción se puede realizar en presencia o ausencia de membranas (véase la Figura 3). Para decondense cromatina en presencia de membranas, añadir 2 l de membranas flotaban preparados de acuerdo con el protocolo descrito por Eisenhardt et al. 16 - Incubar la mezcla de reacción durante 2 hr hasta (o menos para estudiar los puntos de tiempo anteriores del proceso de descondensación) a 20 ° C.
- Fijar la muestra mediante la adición de hielo frío 0.5 ml Viki-Fix que contiene 0,5% de glutaraldehído y 0,1 mg / ml DAPI y la incubación durante 20-30 min en hielo.
NOTA: Si las muestras se procesarán más de inmunofluorescencia, la fijación debe hacerse sin glutaraldehído ya que a menudo interfiere con la tinción de anticuerpos. Sin embargo, si se analiza únicamente la tinción DAPI, la adición de excesoaraldehyde preservará la estructura de la cromatina más agradable. - Incubar cubreobjetos redondos (diámetro 12 mm) durante 5 min con una solución de lisina poli-L-para aumentar la afinidad de los cubreobjetos a la cromatina. Seque el cubreobjetos sobre papel de filtro después.
- Montar los tubos de fondo plano de centrifugación (6 ml, 16/55 mm) poniendo los cubreobjetos con el sitio recubierto a la parte superior en la parte inferior del tubo de centrifugación. Añadir 800 l de la almohadilla de sacarosa al 30% y la capa de la muestra fijada en la parte superior.
- Centrifugado durante 15 minutos a 2500 xga 4 ° C.
NOTA: Los tubos de centrifugación de fondo plano se ajustan a los rotores que adoptan 15 ml tubos de centrífuga cónicos. - Decantar el sobrenadante, a continuación, retire los cubreobjetos de los tubos por meter cuidadosamente la parte inferior del tubo de centrifugación con 16 G 1 ½ '' aguja de la jeringa. Para este propósito la cinta de la tapa de la aguja y la propia entre sí en sus partes inferiores de agujas y de cortar el extremo delantero de la tapa de manera que la aguja se pega sobre 3mm cabo. Cuando el cubreobjetos se levanta por la aguja en un sitio, utilice pinzas para quitar el cubreobjetos.
- Lave el cubreobjetos rápidamente sumergiéndolo en agua desionizada, secar suavemente tocando su lado a un papel de filtro y colocarlo en el portaobjetos de un microscopio en una gota de medio de montaje. Selle con esmalte de uñas, seco y mantener en la oscuridad.
NOTA: Las muestras fijas sin glutaraldehído se pueden almacenar en PBS en una placa de 24 pocillos y se utilizan más para la tinción de inmunofluorescencia. Si se almacena durante varios días, añada azida de sodio 0,05% (¡CUIDADO! Usar guantes) a la PBS para evitar la contaminación con bacterias. - Analizar las muestras mediante microscopía de fluorescencia de la señal DAPI (usando, por ejemplo, un microscopio confocal con un láser de 405 nm).
8. Preparación de Tampón de inmunofluorescencia tinción de in vitro reconstituido cromatina descondensación Muestras
- Preparar PBS de acuerdo con 1.1.1. Disolver NH 4 Cl a una aletaal concentración de 50 mM en PBS. Mantener esta solución a 4 ° C. Disolver 5 g / ml DAPI en PBS (preparar recién). Añadir 0,1% de Triton X-100 a PBS. Mantenga a 4 ° C. Preparar tampón de bloqueo recién antes de su uso mediante la dilución de 3% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS + 0,1% Triton X-100.
9. Protocolo para Inmunofluorescencia La tinción de in vitro reconstituido cromatina descondensación Muestras
NOTA:. Todos los siguientes incubaciones de los cubreobjetos se hacen en una placa de 24 pocillos con al menos 250 solución de l por pocillo, si no se indica lo contrario In vitro decondensed muestras de cromatina son más sensibles que las células fijadas, por tanto, tenga cuidado al conectar o desconectar soluciones. Se recomienda el uso de pipetas Pasteur de plástico cortado angular. Para las etapas de lavado y la incubación anticuerpo secundario colocar la placa a temperatura ambiente a tu ritmo o plataforma giratoria, moviéndose no más rápido que 100 rpm.
- Quench muestras mediante la incubación de cubreobjetoss con 1 ml de NH 4 Cl en PBS durante 5 min. Muestras de bloques de incubación con 1 ml tampón de bloqueo por lo menos durante 30 minutos.
- Montar una cámara de humedad para la incubación con el anticuerpo primario: Pon un tejido húmedo en la parte inferior de una caja que puede cerrarse y la tapa de la placa de 24 pocillos boca abajo en la parte superior de la toallita húmeda. Coloque Parafilm en la tapa y añadir 70 l de la solución de anticuerpo por muestra en el Parafilm. Para la solución de anticuerpo, se diluye antisuero o anticuerpos purificados por afinidad 1: 100 en tampón de bloqueo.
- Coloque los cubreobjetos boca abajo en la parte superior de la solución de anticuerpo y se incuba durante 1 a ellos 2 hr. Coloque los cubreobjetos de nuevo a la placa de 24 pocillos con la cara de muestra y lavar las muestras tres veces durante 10 minutos con 1 ml 0,1% Triton X-100 en PBS.
- Incubar cubreobjetos durante 1 hora a RT en 250 anticuerpo secundario etiquetado fluorescente l diluido en tampón de bloqueo a una concentración recomendada por el fabricante. Proteger de la luz. Lave three veces durante 10 minutos con 1 ml 0,1% Triton X-100 en PBS.
- Se incuban las muestras durante 10 min con 1 ml de 5 mg / ml DAPI en PBS. Lavar tres veces durante 5 minutos con 1 ml 0,1% Triton X-100 en PBS.
- Lave el cubreobjetos rápidamente sumergiéndolo en agua desionizada, secar suavemente tocando su lado a un papel de filtro y colocarlo en el portaobjetos en la parte superior de una gota de medio de montaje. Selle con esmalte de uñas, seco y mantener a 4 ° C en la oscuridad hasta su uso. Analizar las muestras mediante microscopía de fluorescencia.
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Representative Results
Dependencia del tiempo de la reacción descondensación
La figura 1 muestra un curso de tiempo típico de ensayo de la descondensación. El grupo de cromosomas visibles al comienzo de la reacción decondenses y se funde en una sola, redondo y el núcleo suave. Cuando el extracto de huevo se sustituye por sacarosa amortiguar el clúster cromosoma sigue siendo condensada, lo que sugiere que la actividad descondensación está presente en el extracto de huevo.
Descondensación cromatina es un proceso dependiente de energía
La reacción descondensación in vitro puede ser convenientemente manipulada por ejemplo, mediante la adición de inhibidores. En el experimento mostrado en la Figura 2, el ATP no hidrolizable o análogos de GTP, ATPγS o GTP? S, se añadieron a la reacción. Ambos inhiben la proyección descondensación, que es un ATP y dependiente de GTP, proceso activo (Figura 2).
El ensayo se realizó en descondensación la presencia o ausencia de las membranas (Figura 3). Tenga en cuenta que en ambas condiciones cromatina sufre descondensación, sin embargo, además de las membranas de los resultados en los núcleos más grandes. Lo más probable, la reforma de la envoltura nuclear induce un paso descondensación secundaria por otro mecanismo dependiente de transporte nuclear.
Figura 1. Evolución temporal de d e in vitro descondensación reacción. Mitótico cromatina racimos de células HeLa se incubaron con extracto interfásico huevo Xenopus. Las muestras se fijaron en los puntos de tiempo indicados con 4% PFA y 0,5% de glutaraldehído, se tiñeron con DAPI y se analizaron mediante co microscopía nfocal. Re-impreso desde Magalska et al. 8. La barra de escala es de 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La cromatina descondensación requiere ATP y GTP hidrólisis. Descondensación de la cromatina se realizó en presencia de ATPγS 10 mM, GTP? S 10 mM o tampón de control. Las muestras se fijaron con PFA al 4% y 0,5% de glutaraldehído en los puntos de tiempo indicados y se analizaron por microscopía confocal. Re-impreso desde Magalska et al. 8. La barra de escala es de 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 "src =" / files / ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg "/>
Figura 3. La cromatina descondensación en presencia y ausencia de membranas. Descondensación de la cromatina se realizó en ausencia (A) o presencia (B) de las membranas de flotación purificada para 120 min. Las muestras se fijaron con PFA al 4% y 0,5% de glutaraldehído y se analizaron por microscopía confocal. La cromatina está manchado con DAPI, membranas con DIIC 18 (1,1-dioctadecil-3,3,3 ', perclorato 3'-tetrametilindocarbocianina). La barra de escala es de 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Xenopus laevis extractos de huevo son una herramienta muy útil para reproducir fielmente los procesos celulares in vitro, y este sistema fue utilizado con éxito en la caracterización de ciclo celular y la división celular eventos 2, 3,5,6,17. Debido a las grandes tiendas de componentes nucleares secuestradas en el huevo durante la ovogénesis, extractos de huevo son una excelente fuente de los componentes celulares. En comparación con otros enfoques como RNAi en líneas celulares de tejidos de mamíferos o manipulación genética, que ofrece varias ventajas: El sistema libre de células permite estudiar los procesos celulares en los que la viabilidad celular sería de otra manera una limitación. Además pasos individuales de procesos complejos pueden ser analizados en ensayos simples. El ensayo que aquí se presenta permite descondensación estudio de los mecanismos moleculares de descondensación postmitotic sin interferencia de otros eventos de la mitosis, respectivamente. Extractos de Xenopus huevo son fáciles de manipular por el agotamiento de proteínas específicasy la adición de inhibidores o proteínas mutadas 8. Por ejemplo, la Figura 2 muestra el resultado de la adición de los análogos de ATP o GTP no hidrolizables, ATPγS y GTP? S para el ensayo de descondensación. Por dilución y centrifugación diferencial de Xenopus componentes huevos como membranas y citosol se pueden separar 16. Figura 3 muestra el ensayo de descondensación realiza en presencia o ausencia de membranas. Finalmente, el ensayo libre de células también se puede utilizar para identificar nuevos factores por ejemplo, mediante un enfoque de fraccionamiento. Utilizando esta estrategia hemos identificado la AAA + -ATPasas RuvBL1 / ruvbl2 como descondensación cruciales factores 8.
En sistemas in vitro basado en X. laevis huevos han sido empleados con diferentes plantillas de ADN:. Forbes et al demostraron que la inyección de ADN λ fago en X. sin fertilizar huevos laevis indujeron el ensamblaje de la cromatina en nakADN ed fago λ. Como la inyección de ADN viral activa el huevo, el montaje de la cromatina fue seguido por la formación de una estructura de núcleo 18 y de manera similar como DNA λ-fago se puede utilizar en combinación con extractos de huevo para generar núcleo como las estructuras in vitro 19. Perlas magnéticas recubiertas con ADN se han utilizado para estudiar chromatinization de ADN 20 y el reclutamiento de las membranas nucleares 21 así como el montaje de una envoltura nuclear y poros complejos de 22, aunque se mantiene abierta hasta que punto esta se asemejaba a un proceso de re-ensamblaje nuclear bona fide . El protocolo que aquí se presenta permite descondensación de aislados grupos cromatina mitótico de las células HeLa utilizando extracto generado a partir de huevos de Xenopus activados. Se reconstruye minuciosamente acontecimientos que condujeron a una reforma de un núcleo interfásico 8. En comparación con la reacción de ensamblaje nuclear aplicado ampliamente utilizado para estudiar la formación de la envoltura nuclear yse utilizan los complejos de poro nuclear en la final de la mitosis, en el ensayo de descondensación de la cromatina mitótica grupos HeLa en lugar de ADN de esperma. ADN de esperma se puede montar en la cromatina mitótico o incluso cromosomas individuales sobre la incubación con extracto preparado a partir de huevos no fertilizados y no activadas 3. Decidimos utilizar grupos mitóticas como fuente de la cromatina para simplificar el procedimiento y evitar la interferencia de condensación de la cromatina. Además, la preparación del extracto de huevo se modifica ligeramente: Para la descondensación de la cromatina extracto de baja velocidad despejado por dos etapas de centrifugación de alta velocidad en rotores de ángulo fijo se utilizan. Extracto de baja velocidad se puede almacenar durante un máximo de 6 meses en nitrógeno líquido sin perder su actividad. En contraste, en las reacciones nucleares de montaje, citosol y membranas flotaban se generan a partir de extractos de baja velocidad por dilución y centrifugación diferencial de alta velocidad antes posible congelación (ver Eisenhardt et al. 16 para una detaiprotocolo led). En nuestro sistema de ensayo, la adición de membranas permite la formación de una envoltura nuclear cerrado que incluye complejos de poro nucleares. Los núcleos resultantes son competentes para la importación y exportación nuclear 8. Por lo tanto, este sistema es compatible con descondensación de la cromatina y la reforma envoltura nuclear. Curiosamente, descondensación de la cromatina también es posible en la ausencia de membranas (Figura 3). Sin embargo, además de las membranas resultados en los núcleos ligeramente más grandes. Lo más probable, la reforma de la envoltura nuclear induce un paso descondensación secundaria por mecanismos aún no definidos, que depende de la importación nuclear.
Para el aislamiento de grupos de cromatina mitótico de las células HeLa, se utilizó una versión modificada del protocolo establecido por Gasser y Laemmli 15. Células mitóticas sincronizada se lisaron en un tampón que contiene la digitonina detergente no iónico y por fuerzas mecánicas. La cromatina se aisló en forma de racimos que contienentodos los cromosomas de un núcleo. La diferencia crucial en comparación con los protocolos de aislamiento individuales cromosoma es el hecho de que las células no son hipotónicamente hinchada pero se enfriaron a 4 ° C antes de la lisis. Esto evita la desconexión de los cromosomas individuales 15, 23. En comparación con el protocolo publicado por JR Paulson 23 que reconoció la ventaja del aislamiento de grupos enteros de la cromatina, Gasser y Laemmli utilizan tampones tampones de poliamina en lugar de Mg basado contienen EDTA 2+ para reducir la actividad de las quinasas, nucleasas, proteasas y fosfatasas y por esta disminuir la cantidad de proteínas y de ADN modificaciones que se producen durante el proceso de aislamiento 15. Además, usando un gradiente de sílice coloidal durante partículas centrifugación diferencial altamente reduce la contaminación citoplasmática. El protocolo también se puede utilizar para aislar agrupaciones de cromatina mitótico de ovario de hámster chino y células de ratón 15.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana para la Investigación y el ERC (AN377 / 3-2 y 309528 CHROMDECON a WA) y un doctorado Comunidad del Boehringer Ingelheim Fonds de AKS Figura 1 y 2 están reimpresos de Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., función ATPasas RuvB-como en descondensación de la cromatina en el final de la mitosis, 305-318, 2014, con el permiso de Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37% formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 ml tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) | Biozym | 729065 | |
| 50% glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 ml | toxic |
| 0.1% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 ml | |
| flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
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