En cell gratis analys för att studera Chromatin Decondensation vid slutet av Mitos

Introduction

Xenopus laevis ägg extrakt är en effektiv och allmänt tillämpad verktyg för att studera komplicerade cellulära händelser i enkelheten hos en cellfri analys. Sedan sin första beskrivning av Lohka & Masui ^ett de har i stor utsträckning använts för att studera mitotiska processer såsom kromatinkondensation ^2, spindelaggregatet ^3, kärnhöljet uppdelning ^4, men också nucleocytoplasmic transporter ⁵ eller DNA-replikation ^6. De händelser som äger rum i slutet av mitos, som är nödvändiga för reformeringen av interphasic kärnan såsom kärnhöljet reformation och nukleär por komplex montering är mycket mindre förstod jämfört med de tidiga mitotiska händelser, men kan på liknande sätt studeras med hjälp av Xenopus äggextrakt ^7. Vi har nyligen etablerat en analys baserad på Xenopus äggextrakt att studera kromatin decondensation vid slutet av mitos ^8, ett undersökte processen som väntar its detaljundersökningarna.

I metazoans är kromatin starkt kondenseras vid mitotisk inträde för att utföra troget segregering av det genetiska materialet. För att säkerställa att kromatinet är åtkomlig för genexpression och DNA-replikation under interfas, måste det vara de-komprimeras i slutet av mitos. I ryggradsdjur är kromatin upp till femtio-faldigt mer kompakterad under mitos jämfört med interfas ^9, till skillnad från jäst där mitotiska kompakte är vanligtvis mycket lägre, t ex endast två gånger i S. cerevisiae ^10. Ryggradsdjur kromatin decondensation har främst studerats i samband med sperma DNA omorganisation efter ägg befruktning. En molekylär mekanism, där nucleoplasmin, en riklig äggcell protein, utbyter spermier specifika protaminer till histoner H2A och H2B lagrade i ägget. Denna process också belysas med hjälp av Xenopus äggextrakt ^{11, 12.} Uttrycketav nucleoplasmin är begränsad till ägg ¹³ och mitotisk kromatin inte innehåller dessa spermier specifika protaminer. Därför kromatin decondensation i slutet av mitos är nucleoplasmin oberoende ^8.

För in vitro decondensation reaktion sysselsätter vi utdrag genereras från aktiverade X. laevis ägg och kromatin kluster isolerade från synkroniserade HeLa-celler. Behandling av ägg med en kalciumjonofor härmar kalcium utsläpp i äggcellen som genereras av spermier inträde under befruktningen. Kalcium vågen utlöser cellcykeln återupptas och ägget, greps i andra meta av meios, går vidare till den första interfas ^14. Därför ägg extrakt framställda bildar aktiverade ägg representerar den mitotiska exit / interfas tillstånd och är kompetenta att inducera händelser som är specifika för mitotiskt exit som kromatin decondensation, kärnhöljet och pore komplexa reformation. För isolering av mitotisk chromatin kluster vi använde en något modifierad version av protokollet publiceras av Gasser & Laemmli ^15, där kromosomkluster frigörs genom lys från HeLa-celler synkroniserade i mitos och isolerad i polyamin innehållande buffertar med lutning centrifuge.

Protocol

Mitotisk Chromatin Cluster Isolering från HeLa-celler

1. Förberedelser

1. Cellodlingslösningar
   1. Förbered komplett Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med tillsats av 10% fetalt kalvserum, 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM glutamin till DMEM. Bered Fosfatbuffert salin (PBS) innehållande 2,7 mM KCI, 137 mM NaCI, 10 mM Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ O och 2 mM KH ₂ PO ₄ i avjoniserat vatten och justera pH till 7,4 med 10 N NaOH.
      OBS: PBS kan hållas så 10x stamlösning med tiden vid RT. Späd den med avjoniserat vatten till 1x före användning. Filtrera 1x lösningen igen om det kommer att användas i cellkultur.
   2. Förbered en 40 mM lager av tymidin lösning (cellkultur lämplig) i DMEM-medium. Lös 0,97 g tymidin i 90 ml DMEM-medium. Anpassa den slutliga volymen till 100 ml. Butiksstamlösning vid -20 °C. Lös (OBS! Arbeta under kemisk huva, handskar och munskydd) nokodazol till 5 mg / ml förrådslösning i DMSO.
2. Mitotiska Clusters Isolation Solutions
   OBS: Samtliga lösningar som beskrivs i 1,2 behöver hållas på is efter framställning / upptining under hela experimentet.
   1. Autoklav avjoniserat vatten under 105 min vid 121 ° C. Lös spermin-tetrahydroklorid i autoklaverat, avjoniserat vatten till en slutlig koncentration av 200 mM (69,6 mg / ml). Butiksstamlösning vid -20 ° C. Lös spermidin trihydroklorid i autoklaverat, avjoniserat vatten till en slutlig koncentration av 200 mM (50,8 mg / ml). Butiksstamlösning vid -20 ° C.
   2. Förbered 5% (w / v) digitonin (OBS! Arbeta under kemisk huva, handskar och munskydd) i varmt, avjoniserat vatten. Filtrera och lagra alikvoter vid -20 ° C. Lös fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) (OBS! Fungerar under kemisk huva, handskar och munskydd) till en slutlig koncentration av 200 mM (35 mg / ml) i 100% etanol. Butiksstamlösning vid -20 ° C.
   3. Lös ditiotreitol (DTT) med avjoniserat vatten till en slutlig koncentration av 1 M (154 mg / ml) (OBS! Arbeta under kemisk huva, handskar). Filtrera och lagra förrådslösning vid -20 ° C.
   4. Bered en 100-faldig blandnings proteasinhibitor (FÖRSIKTIGHET arbeta under kemisk huv, använda handskar!) Genom upplösning av 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml leupeptin, 0,1 mg / ml pepstatin och 0,2 mg / ml aprotinin i avjoniserat vatten. Butiksstamlösning vid -20 ° C.
   5. Bered en 10x förrådslösning av buffert A innehållande 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM spermin-tetrahydroklorid och 5 mM spermidin trihydroklorid. Butiks buffert A vid 4 ° C utan spermin tetrahydro och spermidin trihydroklorid, som bör läggasnyligen strax före användning.
      OBS: EDTA upplöses endast vid pH-värden som är högre än 8, därför, för att framställa ett högkoncentrerat EDTA-KOH-stamlösning (0,5 M rekommenderas), tillsätt 5 N KOH till pH strax över 8 för att lösa upp den. Efteråt titrera ner till pH 7,4.
   6. Bered en 20x stamlösning av buffert Som innehållande 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCI, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) och 5 mM spermidin trihydroklorid. Buffert Som kan lagras under samma villkor som buffert A.
      OBS: Bered arbetslösningar I-IV (se i de följande stegen), den glycerolgradient och de kolloidala kiseldioxidpartiklarna lösningar innehållande kiseldioxidpartiklar (15 till 30 nm i diameter) som belagts med icke-dialyserbart polyvinylpyrrolidon (PVP) nyligen strax före isoleringen förfarande (PMSF och digitonin bör läggas direkt före användning som PMSF är labila i vattenlösningar och digitonin tenderar att fälla ut på långtidslagring på is).
   7. Förbered 100 ml lösning I genom att tillsätta 0,5 x buffert A,1 mM DTT, 1: 100 av blandningen proteashämmare och 0,1 mM PMSF i autoklaveras, avjoniserat vatten. Bered 50 ml av lösning II (för cellys) genom tillsats av 1 x buffert A, 1 mM DTT, 1: 100 av inhibitom mixen proteas, 0,1 mM PMSF, 0,1% digitonin och 10% glycerol i autoklaverat, avjoniserat vatten.
   8. Förbered 200 ml lösning III innehållande 0,25 x buffert A, 1 mM DTT, 1: 100 av hämmaren mixen proteas, 0,1 mM PMSF och 0,05% digitonin i autoklaveras, avjoniserat vatten. Förbered 40 ml av lösning IV innehåller 1x buffert As, 1 mM DTT, 1: 100 av hämmaren mixen proteas, 0,1 mM PMSF och 0,1% digitonin i autoklaveras, avjoniserat vatten.
   9. Bered 120 ml glycerolgradient lösning genom tillsats av 25% glycerol och 0,1% digitonin till lösning I.
   10. Bered 150 ml kolloidal kiseldioxidpartiklar lösning innehållande 60% volym / volym (volym per volym) av en suspension innehållande kiseldioxidpartiklar (15 till 30 nm diameter) överdragna med icke-dialyserbar polyvinylpyrrolidon (PVP), 15% glycerol, 2 mM spermidine trihydroklorid och 0,8 mM spermin-tetrahydroklorid i lösning IV.
   11. Förbered klusterlagringsbuffert innehållande 250 mM sackaros, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM spermidin-trihydroklorid, 0,2 mM spermin-tetrahydroklorid, 1: 100 av inhibitom mixen proteas, 0,3% BSA och 30% glycerol. Buffert Kluster lagring kan hållas vid -20 ° C.
   12. Förbered squash fix-lösning innehållande 10% formaldehyd (OBS! Arbeta under kemisk huva, handskar), 50% glycerol, det dubbla Mark modifierade Ringers buffert (MMR se 4.5.) Och 0,2 mikrogram / ​​ml DAPI (OBS! Handskar). Förvara vid 4 ° C i ljusa skyddade reaktionsrören. Det är inte avgörande för experimentet att använda denna squash fix recept, kommer alternativa recept också fungera.

2. Synkronisering av celler

1. På dag 1: Seed HeLa-celler i fem 75 cm ² (250 ml) kolvar med medium och inkubera det vid 37 ° C i 5% CO _2.
   OBS: Detta kommer att ge på cirka 18 x 10 ⁶ celler på dagen för kromatin kluster isolering.
2. På dag 2: När celler är minst 50% konfluenta (ungefär halv av ytan är täckt av celler och det finns fortfarande plats för celler att växa), tillsätt tymidin till en slutlig koncentration av 2 mM (tymidin blocket) och kulturceller för 24 h vid 37 ° C i _5% CO2.
   OBS: Detta kommer att arrestera celler vid G1 / S-fasen gränsen.
3. Dag 3: Sug medium innehållande tymidin och tillsätt steril PBS. Tvätta cellerna genom delikat sköljning med steril PBS. Aspirera PBS och försiktigt lägga 15-20 ml färska, varma komplett DMEM-medium och odlingsceller för 3-4 timmar vid 37 ° C i 5% CO ₂ för att frigöra dem från G1 / S-fasen blocket.
4. Dag 3 (fortsättning): Efter att ha släppt av cellerna från G1 / S-fasen blocket, lägga nokodazol till en slutlig koncentration av 100 ng / ml. Späd nokodazol genom att tillsätta 2 ^ il stamlösning (5 mg / ml) till 98pl färskt DMEM-medium, och tillsätt 1 pl utspätt nokodazol per varje ml cellkultur. Kulturceller för cirka 12 h vid 37 ° C i _5% CO2. Detta kommer att blockera celler i mitos.

3. Mitotiska Kluster Isolering

1. Dag 4: Isolera mitotiska kluster. Med hjälp av en ljusfältsmikroskopi, kontrollera om majoriteten av cellerna är mitotiska. Om mindre än 50% av cellerna är mitotiska vänta tills fler celler når mitos. Samla mitotiska celler genom att knacka kraftigt vid sidan av kolven (eller genom att försiktigt sprutning med pipetten) kommer detta lösgöra återstående mitotiska celler. Överför cellsuspensionen till 50 ml koniska centrifugrör.
   OBS: Mitotiska celler blir runt och lätt kan tas loss från kolven botten (precis som celler efter trypsinization), till skillnad från celler i andra cellcykelsteg, som är platt och stadigt fäst till kolven.
2. Harvest mitotiska celler genom att snurra rören vid 1500 xg under 10 min (476; C eller RT) och avlägsnande av supernatanten efteråt. Resuspendera cellpelleten i 8 ml PBS, pool i ett 50 ml koniskt centrifugrör, fylla röret helt med PBS och snurra igen i 10 min vid 1500 x g. Upprepa tvättn procedur tre gånger totalt.
3. Från och med nu utföra alla steg på is med kalla lösningar. Kraftigt återsuspendera pelleten i 37 ml kall lösning II. Överför suspensionen till en kall 40 ml glasglashomogenisator med hjälp av en 25 ml pipett och lyserar celler på is genom douncing med en stram mortelstöt tills mitotiska kluster är fria från cytoplasmiskt material. Antalet slag är mycket beroende av digitonin lager och kan variera från 3 till 20 gånger.
   OBS: Homogenisering kan vara ganska kraftig, men bör övervägas avslutad när nästan alla mitotiska celler lyseras och kluster anses vara fria från cytoplasma material (se 3.4).
4. Efter ett par slag blanda 5-10 ul av cellsuspensionen 1: 2 med Trypan blå och kontrollera genom microscopy i en Neubauer kammare. När cellerna lyseras kromatin färgas blå och fri från cellmembran (OBS: möjliga cytoplasmatiska rester blir ansamlas runt den blå färgade kromatin och kommer att vara lätt att skilja).
   OBS: Mitotiska celler kommer lysa innan interphasic celler men ändå vara noga med att inte överdriva homogenisering för att undvika kontaminering med interphasic kärnor och sargade kromatin.
5. Omedelbart lager den helcellslysat över kalla steggradienter (med 5 ml 60% kolloidalt kiseldioxidpartiklar lösning i botten, täcktes med 19,5 ml glycerolgradient lösning vardera) i fem polykarbonat centrifugrör (28,8 x 107,0 mm, är det rekommenderat att Placera rören på is innan svalna dem) med användning av en 10 ml pipett. Förvara inte celler i lösning II under en lång tid, varför det rekommenderas att förbereda rören och gradienten i förväg (t.ex. under tvättningsstegen).
6. Centrifugera gradienterna för 30 min vid 1000 xg vid 4 ° C i en rötor med fixerad vinkel.
   OBS: Kärnor är olyserade celler och kluster återvinnas tillsammans vid gränsytan mellan glycerol och de kolloidala kiseldioxidpartiklarna skikt.
7. Avlägsna vätskan ovanför interfas med hjälp av en pipett och överföra resten till den kalla homogenisator. Återhomogenisera blandningen genom 3-15 slag (återigen beroende på digitonin lager) med den snäva mortelstöt för att eliminera aggregat och att avlägsna cytoskelettala fibrer från klustren. Efter varje par stroke kontrollera hur effektiva homogenisering. Blanda 1 pl av provet med 1 pl av squash fix kompletterat med DAPI och undersöka under fluorescensmikroskop.
   OBS: antal slag är avgörande, förekomsten av kluster aggregat medel, att antalet slag är otillräcklig, medan manglade kromatin och kärnor skräp indikerar att homogeniseringen var för stark.
8. Fördela lösningen bland fyra nya polykarbonat centrifugrör (28,8 x107,0 mm) (ung. 10 ml lösning per rör) och fyll dem helt upp med 60% kolloidal kiseldioxidpartiklar lösning (ca. 30 ml kolloidalt kiseldioxidpartiklar lösning per rör).
   OBS: Undvik att överbelasta kolloidalt kiseldioxidpartiklar lutning eftersom kluster lätt kan fastna om det är för mycket cytoplasmisk skräp i gradienten.
9. Snurra under 5 min vid 3000 x g, följt av 30 minuter vid 45.440 xg vid 4 ° C i en rötor med fixerad vinkel.
   OBS: Som tidigare kommer interphasic kärnor hållas från att komma in gradienten (om homogenisering inte skedde alltför mycket som frigör kärnor från cytoplasmisk skräp) men kluster ackumuleras cirka 1,5 cm från botten av röret, ofta som en lös boll.
10. Avlägsna vätskan ovanför kluster med hjälp av en pipett, pool resten i ett rör, resuspendera bra och omfördela till två polykarbonat centrifugrör (28,8 x 107,0 mm). Späd klustret suspensionen 1: 4 med lösning III i varje rör och blanda väl. Märk: tee platsen var pelleten blir och snurra 1000 xg under 15 min vid 4 ° C i en rötor med fixerad vinkel.
11. Resuspendera pellets i Solution III, pool i en 50 ml koniskt centrifugrör och fyll upp med lösning III. Centrifugera vid endast 300 xg under ca 10 minuter. Centrifugera inte vid högre hastighet - det kan orsaka irreversibel aggregering av kluster.
12. Tvätta igen med Solution III i 1,5 eller 2 ml reaktionsrör (resuspendera pellets och fylla rören helt upp) och centrifugera vid 300 x g. Avlägsna supernatanten försiktigt med en pipett. Resuspendera pelleten försiktigt i 250 pl klusterlagringsbuffert (om du har flera pellets använder 250 pl för alla tillsammans och slå dem). Späd 5-10 | il av provet 1: 2 med trypanblått och räkna i Neubauer kammaren. I förekommande fall utspädd mer för att få en ungefärlig koncentration av 500 kluster / il.
13. Tryck suspensionen genom en 100 ìm cell sil för att se till att ta bort kluster aggregerings på grund av felaktig blandning. Grupperna kan lagras i månader i -80 ° C. För att undvika flera omfrysning göra lämpliga portioner och snap frysa i flytande kväve.

4. Beredningar av buffert för Interphasic Xenopus laevis äggextrakt

OBS: Xenopus laevis grodor underhålls och behandlas i enlighet med de riktlinjer och regler som anges i konventionen av Europarådet om skydd av ryggradsdjur som används för försök och andra ändamål (EU ratificerat 1998) och den tyska lagen avseende användningen av ryggradsdjur i forskning.

1. Förbered DTT och en 100-faldig proteasinhibitor blandning enligt 1.2.3 och 1.2.4. Lös cytokalasin B till en slutkoncentration av 10 mg / ml i DMSO, alikvot (10 eller 20 ^ rekommenderas) och förvara vid -20 ° C.
2. Lös cykloheximid till en slutlig koncentration av 20 mg / ml i etanol, alikvot (500 plrekommenderas) och förvara vid -20 ° C. Lös kalciumjonoforen A23187 till en slutkoncentration av 2 mg / ml i etanol, alikvot och förvara vid -20 ° C.
   OBS: PI, kan DTT, cytochalasin B, cykloheximid och A23187 upprepade gånger frysas och tinas.
3. Förbered 20x Marks Modified Ringers buffert (MMR) innehållande 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 _mM MgCl2, 40 _mM CaCl2, 2 mM EDTA och 100 mM Hepes, justera pH till 8,0 med 5 N KOH.
   OBS: 20x MMR kan hållas under lång tid vid RT. Beroende på mängden av ägg, för en framställning av interphasic äggextrakt 1 liter 1x MMR per injicerat groda och ytterligare 5-10 liter tvättsteg är nödvändiga. Åter justera pH i 1x MMR till 8,0 med 5 N KOH. 1x MMR beredd att hålla grodorna i O / N x 1 ska vara vid RT. 1x MMR förberedd för extraktet preparatet bör förvaras kallt tills den används, men det är inte avgörande för experimentet att 1x MMR är riktigt kallt.
4. Bered en L av sucros buffert innehållande 250 mM sackaros, 50 mM KCl, 2,5 _mM MgCl2 och 10 mM Hepes pH 7,5. Sackarosbuffert bör utarbetas dagen innan du använder sterilt vatten och bör hållas vid 4 ° C.
5. Förbered dejellying lösningen nyligen på morgonen av experimentet genom att lösa 2% L-cystein i 0,25 x MMR. Justera pH till 7,8 med 5 N KOH. Förvara vid 4 ° C tills den används.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu s laevis äggextrakt

1. Injicera 120 IE dräktigt sto serum gonadotropin (PMSG) i rygg lymfan sac varje groda 3-10 dagar före experimentet (5 ml sprutor, 27 G ¾ "" nålar).
   OBS: Denna injektion inducerar ägglossning. Mängden ägg en groda lägger varierar en hel del. En väl om groda kan producera ägg som upptar en volym på upp till 7 ml efter att de-jellynated som motsvarar upp till 3,5 ml råextrakt. Anser emellertid att vissa grodor kanske inte lägga eller kommer lay rötägg.
2. Injicera 500 IE humant koriongonadotropin (hCG) per groda kvällen före försöket (5 ml sprutor, 27G ¾ '' nålar). Detta kommer att leda till lanseringen av äggen. Håll grodorna för 13-17 timmar vid 18 ° C i varje enskild tank innehållande 1,2 l 1x MMR (pH 8).
3. Samla äggen genom att hälla dem i 600-1,000 ml glasbägare.
   OBS: Ta bara de goda partier av ägg som är individuellt som liknande i storlek och tydligt pigmenterade med en mörk och en ljus kulör hälften. Ta inte ägg som bildar strängar eller som ser svullet och vitt. Dessa bör sorteras ut under hela förfarandet med användning av en plast pasteurpipett. För en detaljerad beskrivning av bra kontra dåliga ägg se Gillespie et al. ⁶
4. Tvätta ägg intensivt, ungefär 4 gånger, med 1x MMR genom dekantering supernatanten när äggen har lugnat ner och påfyllning bägaren med färsk buffert efteråt.
   OBS!ägg är stabila innan de dejellynated och tvättbufferten kan appliceras direkt på äggen.
5. Dejellynate äggen genom inkubation i cystein lösning 2%. Byt buffert en gång efter 2-4 minuter genom dekantering bufferten och noggrant fylla bägaren med färsk buffert. Considerdejellying fullständig när volymen av äggen drastiskt minskar och äggen blir mer tätt packade.
   OBS! Dejellying behöver ca 5-7 minuter och bör stoppas när synlig men senast efter 10 minuter.
6. Tvätta ägg ungefär 4 gånger med 1x MMR genom dekantering och påfyllning av buffertvätskan.
   OBS: Äggen är skörare efter dejellynated och följaktligen tvättstegen behöver göras mer noggrant. MMR bör snarare sköljas på väggen av bägaren i stället för direkt på äggen.
7. Aktivera ägg i 100 ml 1x MMR genom tillsats 8 pl av kalciumjonofor (2 mg / ml i etanol). Stoppa aktivering när djur cap kontraktion varakommer synliga eller efter 10 minuter.
   OBS: Djuret lock kontraktion kan identifieras genom komprimeringen av den svarta halv av ägget.
8. Tvätta försiktigt 4 gånger med 1x MMR genom dekantering och påfyllning buffertvätskan.
9. Inkubera ägg i 20 min i 1x MMR vid RT.
10. Förbered centrifugrör under inkubationstiden: Placera 50 pl sukrosbuffert, 50 pl 100-faldig mix proteashämmare, 5 ^ 1 M DTT, 12,5 pl cykloheximid (för att förhindra translation, särskilt när det gäller cyklin B) och 2,5 pl cytochalasin B (till förhindra aktin polymerisation) i 5 ml centrifugrör (13 x 51 mm). Alternativt, för mer än 30 ml av ägg, 14 ml rör (14 x 95 mm) kan användas, i detta fall öka volymerna med 2,4 gånger.
11. Tvätta äggen två gånger med kall sackarosbuffert (dekantering och påfyllning buffert i glasbägare) och överföra dem till centrifugrör med hjälp av en plast pasteurpipett med bred öppning (avbröt smala änden).
12. Packaägg genom att snurra i 1 minut vid 130 x g. Placera rören i 15 ml koniska centrifugrör för detta ändamål (sätta 14 ml rör i 50 ml koniska centrifugrör, respektive). Målet är att ta bort så mycket buffert som möjligt för att förhindra utspädning av extraktet. Efter centrifugering, ta bort överskottet av buffert med en plast pasteurpipett och så småningom fylla fler ägg ovanpå.
13. Spin i en 6 x 5 ml swing-rotor under 20 min vid 21 tusen xg vid 4 ° C.
14. Ta bort låg hastighet extrakt med hjälp av en 5 ml spruta med en 16 G 1 ½ '' nål, mellan gul äggula ovanpå och mörk trasiga ägg skräp i botten. För detta ändamål trycker sprutans nål genom väggen av centrifugröret strax ovanför skiktet av brutna ägg skräp i botten. Håll röret mot ett motstånd när man trycker med nålen.
    OBS: En fylld 5 ml centrifugrör ger mellan 1,8-2,5 ml extrakt.
15. Per 1 ml extrakt tillsätt 10 pl 100-faldig mix proteashämmare, 1 plav 1 M DTT, 2,5 | al cykloheximid (20 mg / ml) och 0,5 ^ il cytokalasin B (10 mg / ml). Förvara utdraget på is.
    OBS: Extraktet kan antingen användas direkt för experimentet eller alikvoterades, snabbfrystes och lagrades i flytande kväve under flera månader. Frysning av extraktet kommer att minska sin verksamhet. För känsliga experiment som immunotömning är det starkt rekommenderat att använda färsk extrakt omedelbart.

6. Beredning av buffertar för In Vitro Beredning av Chromatin Decondensation

1. Förbered energimixen stamlösning innehållande 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml kreatinfosfat och 2,5 mg / ml kreatinkinas i buffert innehållande 250 mM sackaros, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCl och 0,3 _mM MgCl2. Alikvot och förvara vid -80 ° C. Använd nytt efter upptining, inte frysas.
2. Lös 0,2 g / ml glykogen i avjoniserat vatten. Förvara vid -20 ° C. Lös 6-dimetyl aminopurin (DMAP) till en slutlig koncentration0,25 M i DMSO. Alikvot och förvara vid -20 ° C. Använd nytt efter upptining, inte frysas.
3. Bered 30% (vikt / volym) sackaros i PBS, filter och förvara vid 4 ° C. Förbered 4% VikiFix lösning innehållande 80 mM PIPES pH 6,8, 1 _mM MgCl2, 150 mM sackaros och 4% paraformaldehyd (PFA) (OBS! Arbeta under kemisk huva, handskar och munnen skydd).
   OBS! PFA är svårt att lösa därför rekommenderas att göra det enligt följande: För en l Viki-Fix lösa 24,2 g RÖR och 40 g PFA i separata bägare, både i varmt (nästan kokande) avjoniserat vatten. Båda kommer att upplösas genom tillsats av 10 N NaOH men vara noga med att inte lägga alltför mycket. Lägg 51,4 ​​g sackaros och 1 ml 1 M _MgCl2 till PFA lösningen. Lägg rören lösningen till den andra blandningen. Fyll upp till 1 l slutlig volym och justera pH till neutral genom tillsats av NaOH.
4. Lös 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i vatten (OBS! Handskar). Lagra imörker vid -20 ° C.

7. Protokoll för In Vitro Beredning av Chromatin Decondensation

1. Spin låg hastighet interphasic extrakt under 12 minuter vid 386.000 xg i en fast vinkel 20 x 0,2 ml eller 355 000 xg i en 10 x 2,0 ml rotor.
2. Ta försiktigt bort lipidskiktet ovanpå med användning av en vakuumpump eller en pipett och ta supernatanten (därefter kallat höghastighets extrakt) undvika kontaminering membran från bottenskiktet och kassera pellet.
   OBS: För att minska risken för kontaminering membran är det lämpligt att snurra extraktet två eller att späda extraktet med 20% av volymen med sackarosbuffert före centrifugering. Emellertid kan utspädning och ytterligare centrifugeringssteg reducera extraktaktiviteten.
3. Pipett 18 ul med hög hastighet extrakt i en 1,5 ml reaktionsrör, tillsätt 0,7 pl mitotiska kluster (beloppet kan vara något varieras beroende på kromatin förrådskoncentration), 0,5 pl glykogen, 0,5 plenergimix och 0,3 pl DMAP. Använd tips med bred öppning för att blanda reaktions så snart kromatinet tillsättes för att förhindra skjuvning av decondensing kromatin.
   OBS: Reaktionen kan utföras i närvaro eller frånvaro av membran (se Figur 3). För att decondense kromatin i närvaro av membranen, tillsätt 2 pl av flöt membran framställda enligt protokollet beskrivet av Eisenhardt et al., ¹⁶
4. Inkubera reaktionsblandningen under upp till 2 timmar (eller mindre att studera tidigare punkter tid av decondensation processen) vid 20 ° C.
5. Fixera provet genom tillsats av iskall 0,5 ml Viki-Fix innehållande 0,5% glutaraldehyd och 0,1 mg / ml DAPI och inkubation under 20-30 minuter på is.
   OBS: Om proven kommer att bearbetas ytterligare för immunofluorescens bör fixeringen ske utan glutaraldehyd som detta ofta stör färgningsantikroppen. Men om endast den DAPI-färgning kommer att analyseras, tillsats av glutaraldehyde kommer att bevara en trevligare kromatinstruktur.
6. Inkubera runda täckglas (diameter 12 mm) för 5 minuter med poly-L-lysin lösning för att öka affiniteten hos täckglasen till kromatin. Torka täckglasen på filterpapper i efterhand.
7. Montera flatbottnade centrifugrör (6 ml, 16/55 mm) genom att sätta täckglasen med den belagda sajt till toppen på botten av centrifugeringsröret. Lägg 800 pl av 30% sackaroskudde och lager den fasta provet på toppen.
8. Spin under 15 min vid 2500 xg vid 4 ° C.
   OBS! Flatbottnade centrifugrör passa rotorer som antar 15 ml koniska centrifugrör.
9. Dekantera supernatanten och ta sedan bort täck från rören genom att peta försiktigt botten av centrifugeringsröret med en 16 G 1 ½ '' sprutnålen. För detta ändamål tejp locket av nålen och nålen själv tillsammans vid deras bottnar och skär den främre änden av locket så att nålen sticker ca 3mm ut. När täckglaset lyftes av nålen på en plats, använder pincett för avlägsnande av täckglas.
10. Tvätta täck snabbt genom att doppa det i avjoniserat vatten, torka det försiktigt genom att peka på dess sida till en filterpapper och placera den på objektglas på en droppe monterings media. Försegla den med nagellack, torr och hålla mörkret.
    OBS: Prover fast utan glutaraldehyd kan lagras i PBS i en 24-brunnar och användas vidare för immunofluorescensinfärgning. Vid förvaring under flera dagar, tillsätt 0,05% natriumazid (FÖRSIKTIGHET! Bära handskar) och PBS för att undvika kontaminering med bakterier.
11. Analysera proverna med fluorescensmikroskopi av DAPI-signalen (med användning av t ex, ett konfokalt mikroskop med en 405 nm laser).

8. Beredning av buffert för immunofluorescensinfärgning av In Vitro Rekonstituerade Chromatin Decondensation Prover

1. Förbered PBS enligt 1.1.1. Lös _NH4CI till en fenaal koncentration av 50 mM i PBS. Förvara denna lösning vid 4 ° C. Lös upp 5 | ig / ml DAPI i PBS (förbereda färsk). Lägg 0,1% Triton X-100 till PBS. Förvara vid 4 ° C. Förbered blockerande buffert nytt före varje användning genom att späda 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS + 0,1% Triton X-100.

9. Protokoll för immunofluorescensinfärgning av In Vitro Rekonstituerade Chromatin Decondensation Prover

OBS:. Alla efterföljande inkubationer av täck görs i en 24-brunnar med minst 250 ul lösning per brunn, om inte annat anges In vitro dekondenserad kromatin prov är mer känsliga än fixerade celler därför vara försiktig när du lägger till eller tar bort lösningar. Det rekommenderas att använda plast Pasteur pipetter skära kantig. För tvättsteg och sekundär antikropp inkubation placera plattan vid RT på gungande eller roterande plattform, flyttar inte fortare än 100 rpm.

1. Dämpnings prover genom inkubering täckglass med en ml _NH4CI i PBS under 5 minuter. Block prover genom att inkubera dem med 1 ml blockeringsbuffert under minst 30 min.
2. Montera en fuktkammare för inkubation med den primära antikroppen: Placera en våt vävnad på botten av en tillslutbar låda och locket på 24-brunnars plattan upp och ner på toppen av den våta vävnaden. Placera parafilm i locket och tillsätt 70 pl av antikroppen lösning per prov på parafilm. För antikroppslösningen, utspädd antiserum eller affinitetsrenade antikroppar 1: 100 i blockeringsbuffert.
3. Placera täckglasen upp och ner på toppen av antikroppslösningen och inkubera dem för en till 2 tim. Placera täckglasen tillbaka till 24-brunnar med provsidan uppåt och tvätta prover tre gånger i 10 min med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
4. Inkubera täck under 1 h vid RT i 250 ul sekundär fluorescerande-märkta antikropp spätts i blockerande buffert till en koncentration som rekommenderas av tillverkaren. Skyddas från ljus. Tvätta three tider för 10 min med 1 ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
5. Inkubera proverna i 10 min med 1 ml av 5 | ig / ml DAPI i PBS. Tvätta tre gånger under 5 min med en ml 0,1% Triton X-100 i PBS.
6. Tvätta täck snabbt genom att doppa det i avjoniserat vatten, torka det försiktigt genom att peka på dess sida till en filterpapper och placera den på objektglas på toppen av en droppe monterings media. Försegla den med nagellack, torr och hålla vid 4 ° C i mörker tills de användes. Analysera proverna genom fluorescensmikroskopi.

Representative Results

Tidsberoendet av decondensation reaktionen

Figur 1 visar en typisk tidsförloppet för decondensation analysen. Klustret av kromosomer synliga i början av reaktionen decondenses och övergår i en enda, rund och slät kärna. När äggextrakt ersätts av sukrosbuffert kromosom klustret förblir kondenserad, vilket tyder på att decondensation aktiviteten är närvarande i äggextrakt.

Kromatin decondensation är ett beroende processenergi

In vitro decondensation reaktion kan enkelt manipuleras t.ex. genom tillsats av inhibitorer. I experimentet som visas på fig 2, den icke-hydrolyserbara ATP eller GTP-analoger, ATPyS eller GTPyS, tillsattes till reaktionsblandningen. Båda hämmar decondensation visar att det är en ATP och GTP beroende, aktiv process (Figur 2).

Den decondensation utfördes i närvaro eller frånvaro av membran (Figur 3). Observera att båda villkoren kromatin genomgår decondensation, men tillsats av membran resulterar i större kärnor. Troligen, reformering av kärnhöljet inducerar en sekundär decondensation steg ännu en mekanism beroende av kärntransport.

Figur 1. Tidsförlopp för th e in vitro decondensation reaktion. Mitotisk kromatin kluster från HeLa-celler inkuberades med interphasic Xenopus äggextrakt. Prover fixerades vid angivna tidpunkter med 4% PFA och 0,5% glutaraldehyd, färgades med DAPI och analyserades genom sam nfocal mikroskopi. Åter ut från Magalska et al. ^8. Skala bar är 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Kromatin decondensation kräver ATP och GTP-hydrolys. Kromatin decondensation utfördes i närvaro av 10 mM ATPyS, 10 mM GTPyS eller kontrollbuffert. Prover fixerades med 4% PFA och 0,5% glutaraldehyd vid angivna tidpunkter och analyserades genom konfokal mikroskopi. Åter ut från Magalska et al. ^8. Skala bar är 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 "src =" / filer / ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg "/>
Figur 3. Kromatin decondensation i närvaro och frånvaro av membran. Kromatin decondensation utfördes i frånvaro (A) eller närvaro (B) av floatation renades membran för 120 minuter. Prover fixerades med 4% PFA och 0,5% glutaraldehyd och analyserades med konfokalmikroskopi. Kromatin är färgade med DAPI, membran med DiIC ₁₈ (1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat). Skala bar är 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Xenopus laevis ägg extrakt är ett mycket användbart verktyg för att återge cellulära processer in vitro, och detta system framgångsrikt använts i karakterisering av cellcykeln och celldelning händelser ^{2, 3,5,6,17.} På grund av stora förråd av nukleära komponenter sekvestrerade i ägget under oogenes, ägg extrakt är en utmärkt källa till cellkomponenter. Jämfört med andra metoder som RNAi på däggdjursvävnadscellinjer eller genmanipulation, erbjuder flera fördelar: Den cellfria systemet tillåter att studera cellulära processer där cellulär livsduglighet skulle annars en begränsning. Dessutom enstaka steg av komplexa processer kan analyseras i enkla analyser. Den här presenterade decondensation analysen möjliggör att studera molekylära mekanismer för postmitotisk decondensation utan störningar från andra mitotiska händelser, respektive. Xenopus ägg extrakt är lätta att manipulera genom utarmning av specifika proteineroch tillsats av inhibitorer eller muterade proteiner ^8. Till exempel visar fig 2 visar resultatet av tillsats av de icke-hydrolyserbara ATP eller GTP-analoger, ATPyS och GTPyS till decondensation analysen. Genom utspädning och differentialcentrifugering av Xenopus eggs komponenter som membran och cytosol kan separeras ¹⁶ Fig. 3 visar decondensation analysen utförs i närvaro eller frånvaro av membran. Slutligen kan den cellfria analysen också användas för att identifiera nya faktorer t.ex., genom en fraktione tillvägagångssätt. Med hjälp av en sådan strategi som vi har identifierat AAA ⁺ -ATPases RuvBL1 / RuvBL2 som avgörande decondensation faktorer ^8.

In vitro-system baserade på X. laevis ägg har använts med olika DNA-mallar. Forbes et al visade att injektion av fag λ DNA i obefruktade X. laevis ägg inducerade montering av kromatin på naked fag λ DNA. Som injektion av viralt DNA aktiverat ägget, var sammansättningen av kromatin följt av bildning av en kärna-liknande struktur ¹⁸ och på liknande sätt λ-fag-DNA kan användas i kombination med ägg extrakt för att alstra kärnan liknande strukturer in vitro ^19. Magnetiska pärlor belagda med DNA har använts för att studera chromatinization av DNA ²⁰ och rekrytering av kärnmembran ²¹ samt montering av en nukleär kuvert och por komplex ^22, även om det förblir öppen i vilken utsträckning detta liknade en bona fide kärnåtersamlingsprocess . Protokollet presenteras här tillåter decondensation av isolerade mitotiska kromatin kluster från HeLa-celler med användning av extrakt genereras från aktiverade Xenopus ägg. Det rekonstruerar noggrant händelser som leder till en reformering av en interphasic kärna ^8. Jämfört med den i stor utsträckning nukleära montering reaktion som används för att studera bildningen av kärnhöljet ochkärn porer komplex i slutet av mitos, i decondensation analys HeLa mitotiska kromatin kluster i stället för spermie-DNA används. Sperma DNA kan sättas samman till mitotisk kromatin eller ens individuella kromosomer vid inkubation med extrakt framställd från obefruktade och icke-aktiverade ägg ^3. Vi bestämde oss för att använda mitotiska kluster som kromatin källa att förenkla förfarandet och undvika störningar från kromatinkondensation. Dessutom är framställningen av äggextrakt något modifierad: För kromatin decondensation låg hastighet extrakt godkänts av två höghastighetscentrifugeringssteg i fasta vinkel rotorer används. Låg hastighet extrakt kan förvaras i upp till 6 månader i flytande kväve utan att förlora sin aktivitet. Däremot i kärnmonteringsreaktioner, cytosolen och flöt membran genereras från låga varvtal extrakt av utspädning och differential höghastighetscentrifugering före möjligt frysning (se et al. Eisenhardt ^{16 för} en detailedda protokoll). I vårt analyssystem, tillsats av membran medger bildning av en sluten kärnhölje inklusive kärn pore komplex. De resulterande kärnorna är behöriga för kärn import och export ^8. Således stöder detta system både kromatin decondensation och kärnhöljet reformation. Intressant nog är kromatin decondensation också möjlig i frånvaro av membran (Figur 3). Emellertid tillsats av membran resulterar i något större kärnor. Troligtvis, reformeringen av kärnhöljet inducerar en sekundär decondensation steg ännu odefinierade mekanismer, vilket beror på nukleära importen.

För isolering av mitotiska kromatin kluster från HeLa-celler, var en modifierad version av protokollet som inrättats genom Gasser och Laemmli ¹⁵ används. Synkroniserade mitotiska cellerna lyseras i en buffert innehållande den icke-joniska detergenten digitonin och genom mekaniska krafter. Kromatinet isoleras som kluster som innehålleralla kromosomer från en kärna. Den avgörande skillnaden i förhållande till enstaka kromosom isoleringsprotokoll är det faktum att cellerna inte är hypotoniskt svullen men kyls ned till 4 ° C före lys. Detta förhindrar frånkoppling av de enskilda kromosomerna ^{15, 23.} Jämfört med protokollet publiceras av JR Paulson ²³ som insett fördelen med isolering av hela kromatin kluster använde Gasser & Laemmli EDTA-innehållande polyamin buffertar i stället för Mg ²⁺ baserade buffertar för att minska aktiviteten hos kinaser, nukleaser, proteaser och fosfataser och genom detta minska mängden av protein och DNA-modifieringar som sker under isoleringsprocessen ^15. Dessutom, med hjälp av ett kolloidalt kiselpartiklar gradient under differentiell centrifugering minskar mycket cytoplasma förorening. Protokollet kan också användas för att isolera mitotiska kromatin kluster från kinesisk hamsterovarie och musceller ^15.

in vitro-kromatin decondensation kan vara åtminstone delvis förklaras av att involvera RuvBL1 / 2, men också en annan AAA ⁺ -ATPas, p97, som tar bort den mitotiska kinas Aurora B från kromatin under mitotiska exit ^24. Varför processen kräver GTP hydrolys är en av de öppna frågorna som vi avser att besvara denna inställning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1