Introduction
非洲爪蟾卵提取物是一个强大的和广泛应用的工具，研究在无细胞的测定法的简单复杂细胞事件。由于通过Lohka＆升井1首次描述它们已经被广泛地用于研究的有丝分裂过程，如染色质缩合2，主轴组件3，核膜破裂4，而且核质运输5或DNA复制6。发生在有丝分裂的末端的事件，所必需的interphasic核的改造如核膜改革与核孔复合重组小得多理解相比早期有丝分裂事件，但可使用爪蟾卵提取物7被类似研究。最近，我们建立了基于爪蟾卵提取物研究染色质解聚在有丝分裂8月底的检测，欠调查过程，等待着我TS细致的刻画。
在后生动物，染色质是高度会聚在进入有丝分裂，以便执行的遗传物质的忠实偏析。以确保该染色质是用于基因表达和DNA复制访问间期，它需要被解压缩在有丝分裂的末端。在脊椎动物中，染色质是高达50倍相比相间9有丝分裂期间更紧密，而相比之下，酵母，其中有丝分裂压实通常要低得多， 例如，只有两个倍S.酵母 10。脊椎动物的染色质解聚已大部分研究精子DNA重组的卵子受精后的环境。的分子机制，其中nucleoplasmin，一种丰富的卵母细胞的蛋白质，交换精子特异性精蛋白组蛋白H2A和H2B存储在蛋。这个过程也阐明用爪蟾卵提取11，12。然而，表达nucleoplasmin的仅限于卵母细胞13和有丝分裂的染色体不包含这些精子特异性鱼精蛋白。因此，在有丝分裂的结束染色质解聚为nucleoplasmin 独立的8。
对于体外解聚反应，我们采用的激活爪蟾卵和染色质集群从同步的HeLa细胞中分离产生的提取物。鸡蛋与钙离子载体治疗模仿的钙释放到受精过程中精子的进入所产生的卵母细胞。钙波触发细胞周期的恢复和卵子在减数分裂的第二个中期逮捕，发展到第一相间14。因此，准备形式激活卵卵提取物所代表的有丝分裂退出/间期状态，并有能力来诱导特异性的有丝分裂的退出状染色质解聚，核膜事件和孔复合体改造。对于有丝分裂通道的隔离romatin簇我们使用加塞＆的Laemmli 15，其中染色体簇从HeLa细胞中有丝分裂的同步和通过梯度离心分离在含有多胺缓冲器释放裂解发布的协议的一个略加修改的版本。
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Protocol
从HeLa细胞有丝分裂染色质集群隔离
1.准备
- 细胞培养液
- 通过加入10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中制备完整的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）中。制备含有2.7毫米氯化钾，137mM的氯化钠，10mM的磷酸氢二钠2H 2 O和2mM KH 2 PO 4在去离子水中，并调节pH至7.4用10N NaOH磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
注：PBS可以维持在RT 10倍原液随时间。用去离子水在使用前至1x稀释。再次过滤1X解决方案，它是否会在细胞培养中使用。 - 准备在DMEM培养基胸腺嘧啶溶液（细胞培养适合）40毫米的股票。溶解在90ml的DMEM培养基0.97克胸苷。调节最终体积至100ml。商店库存溶液在-20℃C.将（ 小心！下化学引擎盖工作，戴手套口保护）诺考达唑，以5毫克/毫升的DMSO储备溶液。
- 通过加入10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM中制备完整的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）中。制备含有2.7毫米氯化钾，137mM的氯化钠，10mM的磷酸氢二钠2H 2 O和2mM KH 2 PO 4在去离子水中，并调节pH至7.4用10N NaOH磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 有丝分裂集群隔离解决方案
注：在1.2中描述的所有解决方案，需要保持在冰上配制后/解冻在整个实验。- 高压釜的去离子水在121℃下105分钟。溶解在高压灭菌的去离子水精胺四盐酸盐，以200毫米（69.6毫克/毫升）的最终浓度。商店库存溶液在-20℃下。溶解在高压灭菌的去离子水亚精胺三盐酸盐的200mM的（50.8毫克/毫升）的最终浓度。商店库存溶液在-20℃下。
- 准备5％（重量/体积），毛地黄皂苷（ 注意！在化学罩工作，戴手套和嘴保护）热，去离子水。过滤和储存分装于-20℃。溶解苯甲基磺酰氟（PMSF）（ 小心！工作理解过程ř化学罩，戴手套口保护），以200毫米（35毫克/毫升）在100％乙醇的最终浓度。商店库存溶液在-20℃下。
- 溶解二硫苏糖醇（DTT），用去离子水使之达到1M（154毫克/毫升）的最终浓度（ 小心！下化学引擎盖工作，戴手套）。在-20℃下过滤并储存原液。
- 制备100倍的蛋白酶抑制剂混合物（ 小心下化学引擎盖工作，戴手套！）通过溶解10mg / ml的AEBSF（4-（2- Aminoethly - ） - benzensulfonylfluoride），0.2毫克/毫升亮肽素，0.1mg / ml的胃蛋白酶抑制剂和0.2mg / ml抑肽酶在去离子水中。商店库存溶液在-20℃下。
- 制备缓冲的10倍的原液A含有150mM三Cl（pH 7.4）中，800毫米氯化钾，20毫摩尔EDTA-KOH（pH 7.4）中，2毫精胺四盐酸盐和5mM亚精胺三盐酸盐。存储缓冲液A在4℃无精胺四胺和亚精胺三盐酸盐，它应该添加新鲜之前使用。
注：EDTA只溶解在pH值高于8，所以，以制备高浓缩的EDTA-KOH原液（推荐的0.5M）中，加入5-KOH至pH恰好高于8溶解。事后滴定至pH为7.4。 - 准备缓冲器的20倍原液作为含有100mM的Tris-HCl（pH为7.4），400毫米氯化钾，400毫摩尔EDTA-KOH（pH7.4）和5mM的亚精胺三盐酸盐。缓冲如可以相同的条件缓冲液A下被存储
注：就在隔离之前新鲜制备工作溶液I至IV（在下面的步骤见），甘油梯度和含有涂有非透析聚乙烯吡咯烷酮（PVP）二氧化硅颗粒（15至30纳米的直径）的胶体二氧化硅粒子的解决方案过程（PMSF和毛地黄皂苷应当在使用前直接加入作为PMSF是不稳定的水溶液中和毛地黄皂苷趋向于在冰上长期贮存以沉淀）。 - 制备100ml的解决办法，我加入0.5X缓冲液A，1mM的DTT，1：蛋白酶抑制剂混合物和0.1mM PMSF到高压灭菌的去离子水的100。通过添加1×缓冲液A制备加入50ml溶液II（细胞溶解），1mM的DTT，1：蛋白酶抑制剂混合物的100，0.1mM的PMSF，0.1％毛地黄皂苷和10％甘油进高压灭菌的去离子水。
- 制得200毫升溶液III含有0.25×缓冲液A，1mM的DTT，1：蛋白酶抑制剂混合物的100，0.1mM的PMSF和0.05％毛地黄皂苷在高压灭菌的去离子水。制备含有1x缓冲器40 ml溶液Ⅳ的砷，1mM的DTT，1：100的蛋白酶抑制剂混合物，0.1毫PMSF和在高压灭菌的去离子水0.1％毛地黄皂苷。
- 加入25％甘油和0.1％毛地黄皂苷到溶液I.制备120毫升甘油梯度溶液
- 准备加入150ml胶体二氧化硅粒子的溶液含有涂覆有非透析聚乙烯吡咯烷酮（PVP），15％甘油，2mM的s的悬浮液含有二氧化硅颗粒（15至30纳米直径）的60％体积/体积（每体积体积）permidine三盐酸盐和在解决方案IV 0.8毫精胺四盐酸盐。
- 制备含有250mM蔗糖，15毫摩尔的Hepes（pH为7.4），0.5毫亚精胺三盐酸盐，为0.2mM精胺四盐酸盐，1簇存储缓冲器：100中的蛋白酶抑制剂混合物，0.3％BSA和30％甘油。群集存储缓冲器可以保持在-20℃。
- 制备含有10％甲醛壁球修复溶液（ 小心！下化学引擎盖工作，戴手套），50％甘油，双重的Mark的改性林格氏缓冲液（MMR见4.5。）和0.2微克/毫升的DAPI（ 小心！戴手套）。在4℃下存放在避光反应管。这不是关键在实验过程中使用壁球修复配方，替代的食谱也将正常工作。
2.同步细胞
- 在第1天：种子HeLa细胞在5厘米75 2（250毫升）烧瓶与媒体和在5％的C孵育它在37℃下O 2。
注意：这将约18×10 6个细胞产生在染色质集群隔离的日子。 - 第2天：当细胞至少50％汇合（约一半的表面被细胞覆盖和仍有余地细胞生长），添加胸苷至2mM（胸苷块）的最终浓度，并培养细胞24小时于37℃在5％CO 2。
注意：这将阻止细胞在G1 / S期的边界。 - 第3天：吸中含有胸苷，并添加无菌PBS。通过细腻漂洗用无菌PBS洗涤细胞。吸出PBS并轻轻为3至4小时，在37℃，5％加15-20新鲜，温暖完全DMEM培养基和培养细胞毫升的 CO 2从在G1 / S期块释放它们。
- 第3天（续）：从在G1 / S期块释放细胞后，诺考达唑添加到100纳克/毫升的最终浓度。通过加入2微升原液（5毫克/毫升），以98稀释诺考达唑微升的新鲜DMEM培养基，并添加1微升稀释诺考达唑每毫升每一个细胞培养的。培养细胞约12小时，在37℃在5％CO 2。这将阻止在有丝分裂的细胞。
3.有丝分裂集群隔离
- 第4天：隔离的有丝分裂集群。使用明亮的视野显微镜，检查大多数细胞是有丝分裂。如果细胞的小于50％是有丝分裂的等待，直到更多的细胞达到有丝分裂。通过在烧瓶（或通过用吸管轻柔地喷洒）侧大力攻丝收集有丝分裂细胞，这将分离剩余的有丝分裂的细胞。细胞悬液转移到50毫升锥形离心管中。
注：有丝分裂的细胞变成圆形，可以很容易地从烧瓶底部（就像胰蛋白酶消化后的细胞）分离的，不像细胞在其他细胞周期的阶段，这是平的，牢固地附着在烧瓶中。 - 通过旋转的管在1500×g离心10分钟收获细胞的有丝分裂（4-76℃或RT）和除去上清液之后。重悬细胞沉淀于8ml PBS中，池成一个50ml锥形离心管中，然后在试管中完全用PBS，并在1500×g下再旋转10分钟。总共重复该洗涤过程三次。
- 从现在开始进行冰上所有步骤用冷水解决方案。大力重悬沉淀37毫升冷溶液II。通过与紧杵douncing使用在冰上25毫升移液管和裂解细胞的有丝分裂，直到簇可用胞质材料的悬浮液转移到40个冷毫升玻璃 - 玻璃均化器。笔划的数量是高度依赖于毛地黄皂苷库存，并可以从3到20倍而变化。
注：均匀化可以是相当剧烈，但应考虑完整时，几乎所有的有丝分裂细胞溶解和簇被看作是游离胞质材料（见3.4）。 - 经过几次中风混合5-10微升细胞悬浮液1：2台盼蓝检查由MICRoscopy在纽鲍尔室。当将细胞裂解染色质染色蓝和自由细胞膜的（注意：可能细胞质残余将周围积聚蓝染色染色质和将容易区分）。
注：interphasic细胞有丝分裂之前，将细胞溶解，但仍然要小心，不要过分同质化，以避免污染interphasic核和错位染色质。 - 立即层的全细胞裂解过冷步骤梯度（用5ml在底部60％的胶态二氧化硅粒子的溶液，覆盖有19.5的甘油梯度每种溶液毫升）在5聚碳酸酯离心管（28.8 x107.0毫米，建议置于冰上管前使用10毫升吸管冷却下来）。不保持细胞溶液II很长一段时间，因此，建议预先准备管和梯度（例如，在洗涤步骤）。
- 离心梯度30英里n将在1000 xg离心在4℃下在一个固定角转子。
注：核，未裂解的细胞和簇在甘油和接口的胶体二氧化硅粒子的层一起回收。 - 除去相间高于液体使用移液管，其余转移到冷匀浆。由3-15笔划（再次取决于毛地黄皂苷股票）与紧杵重均化混合物，以消除聚集体和以从簇除去细胞骨架的纤维。每对夫妇中风后检查同质化的效率。混合1微升样品与1微升壁球修复辅以DAPI和荧光显微镜下检查。
注：笔画的数目是至关重要的，集群的存在下聚合装置，该笔划的数量是不够的，而染色质错位和细胞核碎片表明同质性过强。 - 分布在四个新的聚碳酸酯离心管中的溶液（28.8 x107.0毫米）每管（大约10 ml溶液），并填充它们完全与60％的胶态二氧化硅粒子的溶液（约30 ml的每管胶体二氧化硅粒子的溶液）。
注意：避免过载的胶体二氧化硅粒子梯度因为簇中是否存在梯度过多细胞质碎屑可以很容易地捕获。 - 自旋5分钟，在3000×g离心，随后30分钟45440×g离心在4℃下在一个固定角转子。
注：如前，interphasic原子核将保持进入梯度（如果均质化却没有这样做太沉重，释放细胞核从细胞质碎片），但簇会积聚约1.5厘米的管子的底部，通常作为一个松散的球。 - 除去上面用吸管集群的液体，池，其余为一管，重悬井和再分配两个聚碳酸酯离心管（28.8 x107.0毫米）。稀释集群停牌1：4，在每个试管溶液III拌匀。马克日E盘均颗粒将是和在一个固定角转子自旋1000 xg离心15分钟，在4℃。
- 重悬在溶液中三球团，汇集成1个50毫升锥形离心管中，并填写了解决方案三。离心仅在300×g离心大约10分钟。不要离心以更高的速度 - 这可能会导致集群的不可逆的聚集。
- 在1.5或2毫升的反应管中溶液III再次清洗（悬浮颗粒和填充管完全向上）和离心300×g的。用吸管小心地取出上清。精心250微升集群存储缓冲区悬浮颗粒（如果你有几个小球用250微升了一起，汇集他们）。稀释5-10微升样品1：2与台盼蓝和在纽鲍尔室计数。如果适用稀更多以获得500簇/微升的近似浓度。
- 通过100微米的细胞过滤按下暂停，以确保删除群聚集- 从悬浮不当造成。簇可以储存数月在-80℃。为避免多次再冻结作出适当的分装和捕捉冷冻在液氮中。
4.准备缓冲器，用于Interphasic 非洲爪蛙卵提取物
注： 非洲爪蟾青蛙保持，并按照规定的欧洲脊椎动物的用于实验和其他用途（欧盟 批准1998年）保护理事会会议通过的指导方针和规定处理和德国法有关在研究中使用的脊椎动物。
- 准备DTT和根据1.2.3和1.2.4 100倍的蛋白酶抑制剂的组合。溶解细胞松弛素B为10毫克/毫升的DMSO，等分试样的最终浓度（10或20微升推荐）并储存在-20℃。
- 溶解菌酮的20毫克/毫升在乙醇中，等分试样的最终浓度（500微升推荐），并储存在-20℃。溶解的钙离子载体A23187的2毫克/毫升在乙醇中，等分试样并储存的终浓度在-20℃。
注：PI，DTT，细胞松弛素B，放线菌酮和A23187可反复冷冻和解冻。 - 制备含2M氯化钠，40毫米氯化钾，20毫米氯化镁2，40毫米氯化钙2,2毫米EDTA和100毫米HEPES，调节pH值至8.0与5-KOH 20倍马克的修改林格氏缓冲液（MMR）。
注：20X MMR可以保持在很长一段时间在室温。取决于鸡蛋的量，对于1制备的interphasic卵提取物1升每注入青蛙1倍的MMR和附加5-10升的洗涤步骤是必要的。重新调整1个MMR的pH至8.0，用5N KOH。 1X MMR准备让青蛙在O / N×1应在室温。对于提取物制剂制备1X孕产妇死亡率应保持低温，直到它被使用，但它不是为实验至关重要的1X MMR真的很冷。 - 准备1升SUC的玫瑰含有250mM蔗糖，50mM的氯化钾，2.5mM的MgCl 2的和10mM的Hepes pH为7.5的缓冲。蔗糖缓冲液应使用无菌水前一天制备，并应保持在4℃。
- 通过在0.25×MMR溶解2％L-半胱氨酸的新鲜制备dejellying溶液在实验的早晨。调节pH至7.8，用5N KOH。保持在4℃下直到它被使用。
5. Protocolfor Interphasic Xenopu 小号蟾卵提取物
- 实验（5毫升注射器，27G的¾'针）前3-10天注射120 IE孕马血清促性腺激素（PMSG）到每个青蛙背淋巴囊。
注：此注入将诱发排卵。一个青蛙下蛋量变化很大。良好铺设蛙可能产生卵子占据高达7毫升的体积被解除jellynated其对应于高达粗提取物3.5 ml的后。然而，考虑到某些青蛙可能没有打好还是会拉Ÿ坏蛋。 - 实验（5毫升注射器，27G¾'针），然后注入500 IE人绒毛膜促性腺激素（hCG）每青蛙晚上。这将引起鸡蛋的释放。保持青蛙为13-17小时，在18℃的含1.2升1X MMR（pH值8）个人坦克。
- 浇成600-1000毫升的玻璃烧杯收集鸡蛋。
注：取鸡蛋被单独放置，大小相似，并明确着色用深色和浅色的一半，只有良好的批次。别拿形成字符串或者看上去浮肿和白色的蛋。这些应该用塑料巴斯德吸管进行清理整顿贯穿整个过程。对于好与坏鸡蛋的详细说明，请参阅吉莱斯皮等人 。6 - 通过滗析当鸡蛋落户上清，再填充用新鲜的缓冲烧杯后集中洗蛋，约4倍，1倍MMR。
注意：鸡蛋是稳定它们dejellynated和洗涤缓冲液可直接应用在蛋上之前。 - 孵育在2％半胱氨酸溶液Dejellynate鸡蛋。通过倾析缓冲，并仔细填充用新鲜的缓冲烧杯一次后2-4分钟改变缓冲器。 Considerdejellying完整当蛋量急剧减少和蛋变得更加密集。
注：dejellying大约需要5-7分钟，应当停止时可见，但10分钟后，最新的。 - 用1X MMR洗蛋约4倍滗析和重新填充缓冲上清。
注：蛋被dejellynated后更脆弱，因此，在洗涤步骤需要更仔细地进行。该MMR应而试样落到烧杯的壁，而不是直接到鸡蛋。 - 通过添加8微升钙离子载体（2毫克/毫升在乙醇中）的激活在100鸡蛋毫升1×MMR。停止激活时，动物帽收缩是来自可见光或在10分钟后。
注：动物帽收缩可通过蛋的黑色半的压实来鉴定。 - 通过滗析和重新填充缓冲上清仔细洗4次，1个MMR。
- 鸡蛋孵育20分钟在1X孕产妇死亡率在室温。
- 在孵化时间准备离心管：将50微升蔗糖缓冲液，50微升100倍的蛋白酶抑制剂混合，5微升1 M DTT，12.5微升放线菌酮（防止特别是细胞周期蛋白B翻译）和2.5微升细胞松弛素B（以防止肌动蛋白聚合）在5毫升离心试管（13×51毫米）。可替代地，多于30 ml的鸡蛋，14 ml的试管（14×95毫米），可以使用在这种情况下，增加量为2.4倍。
- 冷蔗糖缓冲液（澄清和笔芯的缓冲区玻璃烧杯）两次将鸡蛋洗净后，并将它们转移到用塑料巴斯德吸管宽口（切断较窄的一端）离心管。
- 包鸡蛋纺丝在130×g下1分钟。把在15ml锥形离心管中的管用于这一目的（置于14 ml的试管在50毫升锥形离心管中，分别地）。我们的目标是除去尽可能多缓冲尽可能防止稀释提取物。离心后，用塑料巴斯德吸管除去过量的缓冲液和最终填满多个蛋在上面。
- 旋在一个6×5毫升在21000×g离心摆动转子20分钟，在4℃。
- 使用具有16克1-半''针头的5mL注射器，上顶黄色蛋黄和暗破蛋杂物在底部之间移除低速提取物。为了这个目的，通过离心管只是破蛋碎片在底部的层上方的壁推动注射器针头。用针头推时，请握住管抗阻力。
注：充满5毫升离心管中提取的1.8-2.5毫升给。 - 每毫升提取物加入10微升100倍的蛋白酶抑制剂混合，1微升的1M DTT，2.5微升菌酮（20毫克/毫升）和0.5微升细胞松弛素B（10毫克/毫升）。置于冰上的提取物。
注意：提取物可直接或者用于实验或等分，快速冷冻并储存在液氮中数月。冷冻提取物会降低其活性。对于微妙的实验，如免疫耗竭，强烈建议您立即使用新鲜的提取物。
6.准备缓冲区的染色质解聚的体外重组
- 制备含25毫摩尔ATP，25毫米GTP，127.5毫克/毫升的磷酸肌酸和2.5毫克/含250毫米蔗糖，1.2毫摩尔的Hepes，5.9毫米氯化钾0.3毫米氯化镁2缓冲液中肌酸激酶的能源结构原液。分装和储存在-80℃。解冻后使用新鲜，不重新冻结。
- 溶解0.2克/毫升糖原在去离子水中。储存在-20℃。溶解6-二甲基氨基嘌呤（DMAP），以使最终浓度的0.25 M在DMSO中。分装和储存在-20℃。解冻后使用新鲜，不重新冻结。
- 制备30％（重量/体积）蔗糖的PBS，过滤并储存于4℃。制备含80毫摩尔PIPES pH为6.8，1毫米氯化镁2，150毫米蔗糖和4％多聚甲醛（PFA）（ 注意！在化学罩工作，戴手套和嘴保护）4％VikiFix解决方案。
注：PFA难以因此溶解时，建议这样做如下：对于1升VIKI - 定影溶解24.2克PIPES和40g的PFA在单独的烧杯，无论是在热的（几乎沸腾）去离子水。双方将通过溶解加入10N的氢氧化钠但要注意不要加太多。添加51.4克蔗糖和1ml的1M MgCl 2的向PFA溶液。添加PIPES溶液的其他组合。填充到1升最终体积，并通过添加氢氧化钠调节pH至中性。 - 溶解10mg / ml的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在水（ 小心！戴手套）。存储在黑暗中在-20℃。
7.协议的染色质解聚的体外重组
- 自旋低速interphasic提取物12分钟，在386000×g离心在一个固定角20×0.2 ml或在355 000 XG在一个10×2.0 ml的转子。
- 轻轻地取出上使用真空泵或吸管顶端的脂质层并取上清（此后称为高速提取物）避免膜污染从底层弃沉淀。
注意：为降低潜在的膜污染，最好是旋萃取两次或稀释提取物与离心前蔗糖缓冲液的体积的20％。然而，稀释的和额外的离心步骤可以减少提取活性。 - 吸取18微升高速提取到1.5毫升的反应管中，加入0.7微升的有丝分裂簇（量可以根据染色质原料浓度稍微变化），0.5微升糖原，0.5微升能源结构，0.3微升DMAP。使用提示具有宽开口，以混合反应只要染色质中加入以防止decondensing染色质剪切。
注意：该反应可以在膜（ 参见图3）的存在或不存在下进行。到decondense染色质在膜的存在下，根据由艾森哈特等人描述的方案中添加2微升浮起膜制备。16 - 孵育反应混合物长达2小时，在20℃（或更低研究解聚过程的较早的时间点）。
- 通过加入冰冷的0.5毫升含有0.5％戊二醛和0.1毫克/毫升的DAPI和在冰上保温20-30分钟VIKI-修复固定样品。
注意：如果该样本将被进一步处理用于免疫荧光，所述固定应毫不戊二醛进行，因为这往往会干扰抗体染色。然而，如果仅DAPI染色进行分析，在加入过剩的araldehyde将保持一个更好的染色质结构。 - 孵育圆形盖玻片（直径12mm）中5分钟，用聚-L-赖氨酸溶液，以增加的盖玻片的亲和力染色质。干燥滤纸上的盖玻片之后。
- 通过将盖玻片与涂布站点顶端上的离心管的底部装配平底离心管（6毫升，五十五分之十六毫米）。添加800微升30％蔗糖垫层和层顶部的固定样品。
- 自旋15分钟，2500×g离心在4℃下。
注：平底离心管适合于采用的15毫升锥形离心管转子。 - 倒出上清液，然后通过小心地戳离心管的底部用16克1-半''注射器针头除去从管的盖玻片。用于此目的的磁带针的盖和针本身一起在它们的底部和切割盖的前端，使针棒约3毫米出去。当盖玻片在一个网站上举起了针，用镊子取下盖玻片。
- 通过浸渍在去离子水中快速洗盖玻片，通过触摸其侧到滤纸轻轻擦干，并把它放在上一滴安装媒体的显微镜载玻片。指甲油封，干燥，避光。
注：样品固定未经戊二醛可以存储在PBS在24孔板中并进一步用于免疫荧光染色。如果储存数天，添加0.05％叠氮化钠（ 小心！戴手套）与PBS，以避免细菌污染。 - 分析由DAPI信号的荧光显微镜的样品（使用例如，共聚焦显微镜有405nm激光器）。
8.准备缓冲对在体外重建染色质解聚样品免疫荧光染色
- 根据1.1.1准备PBS。溶解的 NH 4 C1至翅片人浓度50mM的于PBS中。保持该溶液于4℃。溶解5微克/毫升的DAPI的PBS（准备新鲜）。加0.1％的Triton X-100至PBS中。保持在4℃。准备通过在PBS + 0.1％的Triton X-100稀释3％牛血清白蛋白（BSA）在使用前封闭缓冲液新鲜。
9.协议为在体外重建染色质解聚样品免疫荧光染色
注：盖玻片以下所有孵育取得24孔板至少250微升的解决方案，每孔，如果没有特别说明体外解聚的染色质样品比固定的细胞更为敏感，因此要小心添加或删除解决方案时。建议使用塑料巴斯德吸液管切割角度。对于洗涤步骤和二级抗体孵育将板在室温在摇动或旋转平台，移动不超过100转得更快。
- 孵化盖玻片淬火样品s的1 ml的氯化铵在PBS 5分钟。块样品通过用1ml封闭缓冲液中至少30分钟，温育它们。
- 组装一湿度室中与第一抗体孵育：将一个湿织物上的可关闭的盒的底部和24孔板的盖子，将其放在湿纸巾的顶部。放置封口膜进入盖，并添加70微升的封口膜每采样抗体溶液。在封闭缓冲液100：该抗体溶液，稀的抗血清或亲和纯化的抗体1。
- 将盖玻片上的抗体溶液的顶倒置，并培育它们进行1至2小时。放置盖玻片回24孔板与样品面朝上洗样品三次10分钟用1毫升0.1％的Triton X-100的PBS中。
- 孵育盖玻片1小时在室温下在250μl的次级荧光标记的抗体稀释在封闭缓冲液中，以制造商推荐的浓度。避光。 THR洗ee值次，每次10分钟，用1ml的0.1％的Triton X-100的PBS中。
- 孵育样品10分钟以5微克1毫升/毫升的DAPI的PBS。 5分钟用1ml 0.1％的Triton X-100的PBS洗三次。
- 通过浸渍在去离子水中快速洗盖玻片，通过触摸其侧到滤纸轻轻擦干，并把它放在上一滴安装介质的顶部上的显微镜载玻片。用指甲油密封它，干燥，并保持在4℃下在黑暗中直到使用。通过荧光显微镜分析样品。
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Representative Results
在解聚反应的时间依赖性
图1显示了测定解聚的典型时间进程。可见的染色体在反应开始的簇decondenses并合并成一个单一的，圆和光滑的核。当卵提取物被替换蔗糖缓冲染色体簇仍稠，这表明，解聚活性存在于卵提取物。
染色质解聚是一个能源依赖的过程
在体外解聚反应可方便地操纵，例如，通过加入抑制剂。在关于图2所示的实验中，非水解ATP或GTP类似物，ATPγS或GTPγS的，加入到反应中。既抑制解聚有显示，这是一个ATP和GTP依赖，活动过程（ 图2）。
在存在或不存在的膜（图3）中进行的解聚法。请注意，在这两种条件下染色质经历解聚，但是另外的膜会导致更大的细胞核。最可能的是，核膜改革导致由另外的机制依赖于核运输辅助解聚的一步。
对前作 在体外 解聚反应。有丝分裂染色质团从HeLa细胞图1.时间当然孵育interphasic 爪蟾卵提取物。样品固定在指定的时间点，用4％的PFA和0.5％戊二醛，用DAPI染色，并通过共分析 nfocal显微镜。重新印刷从Magalska 等 。8。比例尺为5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.染色质解聚需要ATP和GTP水解。在10mMATPγS，10毫GTPγS或对照缓冲液的存在下进行解聚的染色质。样品固定用4％的PFA和0.5％戊二醛在指定的时间点，并通过共聚焦显微镜分析。重新印刷从Magalska 等 。8。比例尺为5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3“SRC =”/文件/ ftp_upload / 53407 / 53407fig3.jpg“/>
在不存在（A）或120分钟浮选纯化膜的存在下（B）的，进行图3染色质解聚在存在和不存在的膜。染色质解聚。样品固定用4％的PFA和0.5％戊二醛并通过共聚焦显微镜分析。染色质用DAPI染色，膜与介质隔离集成电路18（1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'- tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐）。比例尺为5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
非洲爪蟾卵提取物是忠实地再现体外细胞过程一个非常有用的工具，并且该系 统被成功地在细胞周期和细胞分裂事件2，3,5,6,17表征使用。由于隔离在卵子发生在卵核部件的大型商店，卵提取物的细胞成分的极好来源。相对于其他方法，如RNA干扰对哺乳动物组织的细胞系或遗传操作，它提供了几个优点：无细胞系统允许研究细胞过程中细胞生存力将是否则限制。此外单一步骤复杂过程可以用简单的测定法进行分析。在这里提出解聚法使学习有丝分裂后的解聚分子机制，没有从其他的有丝分裂事件的干扰，分别爪蟾卵提取物很容易就可以处理由特定蛋白质的耗尽和另外抑制剂或突变的蛋白质8。 例如 ，图2示出了添加非水解ATP或GTP类似物，ATPγS和GTPγS到解聚化验的结果。通过稀释和爪蟾卵组件，如膜和细胞溶胶可以分离16差速离心。 图3示出了在膜的存在或不存在进行解聚实验。最后，将无细胞试验也可用于鉴定新型因素例如，通过一个分馏的方法。利用我们已确定这种战略的AAA + -ATPases RuvBL1 / RuvBL2至关重要解聚因子8。
在体外系统基于X.蟾蛋已经采用不同的DNA模板：福布斯等人发现，注射λ噬菌体DNA导入未受精的X.蟾卵引起染色质上NAK大会EDλ噬菌体DNA。注射病毒DNA的活化蛋，染色质的组合件然后形成一个核状结构18和类似的λ噬菌体DNA的可组合使用卵提取物，以产生核状结构在体外 19。用DNA包被的磁珠已经被用于研究DNA 20的chromatinization一个核膜和招募核膜21以及装配和孔配合物22，虽然它仍保持打开在何种程度上这类似于一个真正的核重新组合过程。这里介绍的协议允许分离的有丝分裂染色体集群使用从非洲爪蟾激活卵子生成提取HeLa细胞解聚。它彻底重建导致的interphasic核8的改革事件。相比用于研究核膜的形成广泛应用核装配反应和核孔复合物在有丝分裂的端部，在解聚测定的HeLa有丝分裂染色体簇代替精DNA被使用。精子DNA可组装成有丝分裂染色质或之上孵育提取物未受精的和未激活的蛋3制备甚至单个染色体。我们决定使用的有丝分裂簇染色质源，以简化程序，避免从染色质缩合干扰。此外，卵提取物的制备是稍微修改：对于染色质解聚低速提取物通过在固定角转头2高速离心步骤清除被使用。低速提取物可以贮存长达6月液氮，而不会失去其活性。与此相反，在核装配反应，胞液和漂膜由低速提取物通过稀释和差的高速离心前可能冻结产生（参见，一个德泰艾森哈特等人 16导致协议）。在我们的测定系统，除了膜的允许的闭合核膜包括核孔复合物的形成。由此产生的细胞核胜任核进口和出口8。因此，该系统同时支持染色质解聚和核膜改革。有趣的是，染色质解聚，也可以在不存在膜（图3）。但是另外的膜产生稍大一点的细胞核。最有可能的，核膜的改革引起的二次解聚一步尚未定义的机制，它依赖于核进口。
对于有丝分裂染色体簇从HeLa细胞的分离中，使用由加塞和的Laemmli 15建立的协议的修改版本。同步有丝分裂细胞溶解于含有非离子去污剂毛地黄皂苷缓冲液和由技工的力。染色质分离为包含集群从一个细胞核所有染色体。相比单染色体分离方案的关键的区别是，该细胞不是hypotonically肿，但冷却至4℃裂解之前。这可以防止单个染色体15，23的断线。相比由JR保尔森23公布的协议识别谁整个染色质的簇的隔离的优点，加塞＆的Laemmli使用EDTA的含聚胺缓冲剂，代替的Mg 2+基于缓冲器来减少的激酶，核酸酶，蛋白酶和磷酸酶的活性和通过这种降低在分离过程15存在的蛋白质和DNA修饰的量。此外，在差速离心使用胶体二氧化硅粒子梯度高度降低细胞质污染。该协议也可以被用于分离的有丝分裂染色体簇从中国仓鼠卵巢和小鼠细胞15。
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Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会和ERC（AN377 / 3-2和309528 CHROMDECON到华盛顿州）和勃林格殷格翰全宗的博士研究生奖学金，以AKS图1和2是从的Developmental Cell 31（3），Magalska转载等人 ，RuvB样ATP酶在有丝分裂，305-318，2014年年底的功能染色质解聚，与爱思唯尔许可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37% formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 ml tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) | Biozym | 729065 | |
| 50% glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 ml | toxic |
| 0.1% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 ml | |
| flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
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