Introduction
Xenopus laevis estratto uovo è uno strumento potente e ampiamente applicato per studiare eventi cellulari complicati nella semplicità di un test cell-free. Fin dalla loro prima descrizione da Lohka & Masui 1 che sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi mitotici quali la condensazione della cromatina 2, del fuso 3, rottura membrana nucleare 4, ma anche il trasporto nucleocytoplasmic 5 o 6 replicazione del DNA. Gli eventi che si svolgono al termine della mitosi, necessari per la riforma del nucleo interfasico quali riforma membrana nucleare e poro nucleare complesso rimontaggio sono molto meno inteso rispetto ai primi eventi mitotico ma possono essere studiati in modo simile utilizzando Xenopus estratto uovo 7. Abbiamo recentemente stabilito un saggio basato su estratto uovo Xenopus per studiare cromatina decondensazione alla fine della mitosi 8, un processo sotto-indagato che attende its caratterizzazione dettagliata.
In metazoi, cromatina è altamente condensato all'entrata mitotica per eseguire fedelmente la segregazione del materiale genetico. Per garantire che la cromatina è accessibile per l'espressione genica e la replicazione del DNA durante interfase, deve essere de-compattato alla fine della mitosi. Nei vertebrati, cromatina è fino a cinquanta volte più compatta durante la mitosi rispetto interfase 9, in contrasto con lieviti dove la compattazione mitotico è generalmente molto inferiore, ad esempio, solo due volte nella S. cerevisiae 10. Vertebrato cromatina decondensazione è stata per lo più studiata nel contesto della riorganizzazione del DNA spermatico dopo la fecondazione delle uova. Un meccanismo molecolare, in cui nucleoplasmin, una proteina ovocita abbondante, scambia protamine specifici sperma di istoni H2A e H2B memorizzati nel uovo. Questo processo è stato anche chiarito utilizzando Xenopus estratto uovo 11, 12. Tuttavia, l'espressionedi nucleoplasmin è limitata a ovociti 13 e cromatina mitotico non contiene queste protamine specifici sperma. Pertanto cromatina decondensazione alla fine della mitosi è nucleoplasmin indipendente 8.
Per la reazione decondensazione in vitro impieghiamo estratto generato da attivi X. laevis uova e cluster cromatina isolate da cellule HeLa sincronizzate. Il trattamento di uova con un ionoforo del calcio imita il rilascio del calcio nel citoplasma dell'ovocita generato da ingresso dello spermatozoo durante la fecondazione. L'onda di calcio innesca la ripresa del ciclo cellulare e l'uovo, arrestato nella seconda metafase della meiosi, progredisce alla prima interfase 14. Pertanto, gli estratti di uova preparati forma attivata uova rappresentano lo stato uscita / interfase mitosi e sono competenti per indurre eventi specifici per l'uscita mitosi come cromatina decondensazione, membrana nucleare e poro riforma complessa. Per l'isolamento di ch mitoticaromatin cluster abbiamo usato una versione leggermente modificata del protocollo pubblicato da Gasser & Laemmli 15, dove i cluster cromosomiche sono rilasciate dai lisi da cellule HeLa sincronizzate in mitosi e isolati in poliammine contenenti buffer da centrifugazioni gradiente.
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Protocol
Mitotico cromatina Isolamento cluster da cellule HeLa
1. Preparativi
- Cultura cellulare Soluzioni
- Preparare mezzo modificato Eagle completa Dulbecco (DMEM) con l'aggiunta di siero fetale bovino al 10%, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM al DMEM. Preparare tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM KH 2 PO 4 in acqua deionizzata, e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N.
NOTA: PBS può essere mantenuto come 10x soluzione madre nel tempo a temperatura ambiente. Diluire con acqua deionizzata a 1x prima dell'uso. Filtrare nuovamente la soluzione 1x se sarà utilizzato in coltura cellulare. - Preparare uno stock di 40 mm di soluzione timidina (coltura cellulare adeguata) in DMEM medio. Sciogliere 0,97 g timidina in 90 ml di terreno DMEM. Regolare il volume finale a 100 ml. Conservare la soluzione magazzino a -20 °C. Sciogliere (ATTENZIONE! Lavorare sotto cappa chimica, indossare guanti e protezione per bocca) nocodazole a una / ml soluzione madre di 5 mg in DMSO.
- Preparare mezzo modificato Eagle completa Dulbecco (DMEM) con l'aggiunta di siero fetale bovino al 10%, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM al DMEM. Preparare tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM KH 2 PO 4 in acqua deionizzata, e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N.
- Mitotico Clusters Isolation Solutions
NOTA: Tutte le soluzioni descritte in 1.2 devono essere tenuti in ghiaccio dopo la preparazione / scongelamento durante l'intero esperimento.- Acqua deionizzata autoclave per 105 minuti a 121 ° C. Sciogliere spermina tetraidrocloride in autoclave, acqua deionizzata ad una concentrazione finale di 200 mM (69,6 mg / ml). Soluzione madre Conservare a -20 ° C. Sciogliere spermidina tricloridrato in autoclave, acqua deionizzata ad una concentrazione finale di 200 mM (50,8 mg / ml). Soluzione madre Conservare a -20 ° C.
- Preparare 5% (w / v) digitonina (ATTENZIONE! Lavorare sotto cappa chimica, indossare guanti e mascherina di protezione) in acqua deionizzata calda. Filtrare e conservare aliquote a -20 ° C. Sciogliere phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) (ATTENZIONE! Lavorare undecappa chimica r, indossare guanti e protezione per bocca) ad una concentrazione finale di 200 mM (35 mg / ml) in etanolo al 100%. Soluzione madre Conservare a -20 ° C.
- Sciogliere ditiotreitolo (DTT) con acqua deionizzata ad una concentrazione finale di 1 M (154 mg / ml) (ATTENZIONE! Lavorare sotto cappa chimica, guanti). Soluzione filtro e conservare magazzino a -20 ° C.
- Preparare un 100 volte mix inibitore della proteasi (ATTENZIONE lavorare sotto cappa chimica, indossare guanti!) Sciogliendo 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml leupeptina, 0,1 mg / ml pepstatina e 0,2 mg / ml aprotinina in acqua deionizzata. Soluzione madre Conservare a -20 ° C.
- Preparare una soluzione 10x magazzino di tampone A contenente 150 mM Tris-Cl (pH 7.4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM spermina tetraidrocloruro e 5 spermidina mM tricloridrato. Conservare tampone A a 4 ° C senza spermina e spermidina tetraidrocloride tricloridrato, cui si aggiungeappena poco prima di utilizzare.
NOTA: EDTA si dissolve solo a pH superiore a 8, quindi, per preparare una soluzione concentrata elevato stock EDTA-KOH (0,5 M consigliato), aggiungere 5 N KOH al pH sopra 8 per scioglierlo. Successivamente titolare fino a pH 7,4. - Preparare una soluzione 20x magazzino di tampone come contenente 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), KCl 400 mm, 400 mm EDTA-KOH (pH 7.4) e 5 mm di spermidina tricloridrato. Buffer Come può essere conservato in stesse condizioni tampone A.
NOTA: Preparare le soluzioni di lavoro da I a IV (vedo nei seguenti passi), il gradiente di glicerolo e le soluzioni particelle di silice colloidale contenenti particelle di silice (15-30 nm di diametro) rivestiti con polivinilpirrolidone non dializzabile (PVP) appena poco prima che l'isolamento Procedura (PMSF e digitonina dovrebbero essere aggiunti direttamente prima dell'uso come PMSF è labile in soluzioni acquose e digitonina tende a precipitare durante la conservazione a lungo termine in ghiaccio). - Preparare 100 ml di soluzione I aggiungendo 0,5x buffer A,1 mM DTT, 1: 100 del mix inibitore della proteasi e 0,1 mM PMSF in autoclave, acqua deionizzata. Preparare 50 ml di soluzione II (per lisi cellulare) aggiungendo 1x tampone A, 1 mM DTT, 1: 100 della miscela inibitore della proteasi, 0.1 mM PMSF, 0,1% e il 10% digitonina glicerolo in autoclave, acqua deionizzata.
- Preparare 200 ml di soluzione tampone contenente III 0,25x A, 1 mM DTT, 1: 100 del mix inibitore della proteasi, 0.1 mM PMSF e 0,05% digitonina in autoclave, acqua deionizzata. Preparare 40 ml di soluzione tampone contenente IV 1x Come, 1 mM DTT, 1: 100 della miscela inibitore della proteasi, 0,1 mM PMSF e 0,1% in digitonina autoclave, acqua deionizzata.
- Preparare 120 ml di soluzione di glicerolo gradiente aggiungendo 25% glicerolo e 0,1% di soluzione digitonina I.
- Preparare 150 ml di soluzione colloidale particelle di silice contenente il 60% v / v (volume per volume) di una sospensione contenente particelle di silice (diametro 15 a 30 nm) ricoperti con polivinilpirrolidone non dializzabile (PVP), 15% glicerolo, 2 mM spermidine tricloridrato e 0,8 mm spermina tetraidrocloruro in soluzione IV.
- Preparare tampone di archiviazione cluster contenente saccarosio 250 mM, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM spermidina tricloridrato, 0,2 mM spermina tetraidrocloride, 1: 100 della miscela inibitore della proteasi, 0,3% di BSA e 30% glicerolo. Il buffer di archiviazione cluster può essere conservato a -20 ° C.
- Preparare la soluzione correzione zucca contenente il 10% di formaldeide (ATTENZIONE! Lavorare sotto cappa chimica, guanti), il 50% glicerolo, raddoppiarli tampone Inseparabili Modified di Mark (MMR vedi 4.5.) E 0,2 mg / ml DAPI (ATTENZIONE! Indossare dei guanti). Conservare a 4 ° C in provette di luce protetta. Non è fondamentale per l'esperimento di utilizzare questa correzione zucca ricetta, ricette alternative potranno anche lavorare.
2. La sincronizzazione delle cellule
- Il giorno 1: Seed cellule HeLa in cinque 75 centimetri 2 (250 ml) flaconi con i media e incubare a 37 ° C in 5% CO 2.
NOTA: Questo produrrà in circa 18 x 10 6 cellule al giorno di isolamento grappolo cromatina. - Il 2 ° giorno: Quando le cellule sono almeno il 50% confluenti (circa la metà della superficie è coperta da cellule e vi è ancora spazio per le cellule a crescere), aggiungere timidina ad una concentrazione finale di 2 mM (blocco timidina) e cellule di coltura per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2.
NOTA: Questo arresterà le cellule al / confine fase S G1. - Il giorno 3: Aspirare terreno contenente timidina e aggiungere PBS sterile. Lavare le cellule dal delicato risciacquo con PBS sterile. Aspirare PBS e delicatamente aggiungere 15-20 ml di caldi completi cellule medie e di coltura fresco, DMEM da 3 a 4 ore a 37 ° C in 5% CO 2 rilasciarli dal blocco G1 / S-fase.
- Il giorno 3 (seguito): Dopo aver allentato le cellule dal blocco G1 / S-fase, aggiungere nocodazole ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. Diluire nocodazole aggiungendo 2 ml di soluzione madre (5 mg / ml) a 98ml di fresco medio DMEM, e aggiungere 1 ml di diluito nocodazole per ogni ml di coltura cellulare. Cellule di coltura per circa 12 ore a 37 ° C in 5% CO 2. Questo bloccherà le cellule in mitosi.
3. mitotiche cluster di isolamento
- Il giorno 4: Isolare cluster mitotico. Utilizzando un microscopio in campo chiaro, controllare se la maggior parte delle cellule sono mitotico. Se meno del 50% delle cellule sono aspettare fino mitotico più cellule raggiungono mitosi. Raccogliere cellule mitotiche toccando vigorosamente a lato del pallone (o spruzzando delicatamente con la pipetta), questo si staccherà restanti cellule mitotiche. Trasferire la sospensione cellulare a 50 ml provette coniche.
NOTA: Le cellule mitotiche diventano rotondo e può essere facilmente smontato dal basso pallone (proprio come le cellule dopo tripsinizzazione), a differenza delle cellule in altre fasi del ciclo cellulare, che sono piatte e saldamente attaccato al pallone. - Raccolta di cellule mitotiche facendo girare le provette a 1500 xg per 10 minuti (476; C o RT) e rimuovendo il supernatante dopo. Risospendere il pellet di cellule in 8 ml di PBS, piscina in uno da 50 ml tubo conico centrifuga, riempire il tubo completamente con PBS e girare ancora per 10 min a 1500 x g. Ripetere questa procedura di lavaggio tre volte in totale.
- Da ora in poi eseguire tutte le operazioni su ghiaccio con soluzioni fredde. Vigorosamente risospendere il pellet in 37 ml di soluzione fredda II. Trasferire la sospensione di un freddo 40 ml vetro-vetro omogeneizzatore utilizzando un 25 ml pipetta e Lisare cellule su ghiaccio da douncing con un pestello stretto fino a quando i cluster mitotiche siano privi di materiale citoplasmatico. Il numero di colpi è fortemente dipendente dal magazzino digitonina e può variare da 3 a 20 volte.
NOTA: L'omogeneizzazione può essere abbastanza vigoroso, ma deve essere considerata completa quando quasi tutte le cellule mitotiche sono lisati e i cluster sono visti per essere liberi di materiale citoplasmatico (vedi 3.4). - Dopo un paio di colpi mix 5-10 ml di sospensione cellulare 1: 2 con Trypan blu e controllare da MICRoscopy in una camera di Neubauer. Cromatina Quando le cellule sono lisate è macchiata blu e privo delle membrane cellulari (NOTA: eventuali residui citoplasmatici saranno accumulano intorno al blu cromatina macchiato e sarà facile distinguere).
NOTA: Le cellule mitotiche saranno lisare prima che le cellule interfasiche ma tuttavia attenzione a non esagerare omogeneizzazione al fine di evitare la contaminazione con i nuclei interfasiche e cromatina alterati. - Livello immediatamente l'intero lisato cellulare sui gradienti passo freddi (con 5 ml di 60% soluzione colloidale particelle di silice in basso, sovrapposte con 19,5 ml di soluzione di gradiente di glicerolo ciascuno) in cinque provette centrifugazione policarbonato (28.8 x 107.0 mm, si raccomanda di posizionare le provette su ghiaccio prima raffreddarli) usando una pipetta 10 ml. Non mantenere le cellule in soluzione II per lungo tempo, in tal modo si raccomanda di preparare i tubi e il gradiente precedenza (ad esempio, durante le fasi di lavaggio).
- Centrifugare i gradienti per 30 min a 1000 xga 4 ° C in un rotore ad angolo fisso.
NOTA: Nuclei, le cellule non lisati ei cluster vengono recuperati insieme all'interfaccia del glicerolo e le particelle colloidali di silice strati. - Rimuovere il liquido sopra l'interfase con una pipetta e trasferire il resto al omogeneizzatore freddo. Re-omogeneizzare miscela da 3-15 colpi (di nuovo a seconda del digitonina magazzino) con il pestello stretto per eliminare gli aggregati e per rimuovere le fibre del citoscheletro dai grappoli. Dopo ogni paio di colpi verificare l'efficienza di omogeneizzazione. Mescolare 1 ml di campione con 1 ml di zucca correzione integrate con DAPI ed esaminare al microscopio a fluorescenza.
NOTA: Il numero di corse è fondamentale la presenza di cluster di aggregati mezzi, che il numero di colpi è insufficiente, mentre cromatina mutilato e detriti nuclei indicano che l'omogeneizzazione era troppo forte. - Distribuire la soluzione tra quattro nuovi tubi in policarbonato centrifugazione (28,8 x107,0 millimetri) (10 ml di soluzione circa. Per provetta) e riempirli completamente con il 60% di soluzione di particelle di silice colloidale (ca. 30 ml di soluzione colloidale particelle di silice per provetta).
NOTA: evitare di sovraccaricare il colloidale particelle di silice gradiente dal cluster possono essere facilmente intrappolati se c'è troppa detriti citoplasmatica nel gradiente. - Spin per 5 minuti a 3000 xg, seguito da 30 min a 45.440 xga 4 ° C in un rotore ad angolo fisso.
NOTA: Come prima, nuclei interfasiche saranno tenute di entrare nel gradiente (se omogeneizzazione non è stato fatto troppo pesante che rilascia nuclei da detriti citoplasmatico) ma i cluster accumulerà circa 1,5 cm dal fondo della provetta, spesso come una palla vagante. - Rimuovere il liquido sopra i cluster con una pipetta, piscina il resto in un tubo, risospendere bene e ridistribuire ai due tubi di centrifugazione in policarbonato (28,8 x 107,0 mm). Diluire la sospensione cluster 1: 4 con la soluzione III, in ogni tubo e mescolare bene. Mark °e sito erano il pellet sarà e spin 1.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore ad angolo fisso.
- Risospendere il pellet in Solution III, piscina in uno da 50 ml tubo da centrifuga conica e riempire con la soluzione III. Centrifugare a soli 300 xg per circa 10 min. Non centrifugare a velocità maggiore - potrebbe causare aggregazione irreversibile dei cluster.
- Lavare nuovamente con Solution III in tubi di reazione 1,5 o 2 ml (risospendere il pellet e riempire i tubi completamente su) e centrifugare a 300 x g. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta. Risospendere pellet accuratamente in 250 microlitri di buffer archiviazione cluster (se si dispone di diversi pellet utilizzano 250 microlitri per tutti insieme e li piscina). Diluire 5-10 ml di campione 1: 2 con Trypan blu e contare nella camera di Neubauer. Se diluita applicabile di più per ottenere una concentrazione approssimativa di 500 cluster / mL.
- Spingere la sospensione attraverso un colino cella di 100 micron per assicurarsi di rimuovere l'aggregazione di clusters derivanti da risospensione improprio. I cluster possono essere conservati per mesi in -80 ° C. Per evitare ricongelamento multiplo rendono aliquote appropriate e lo snap congelare in azoto liquido.
4. Preparazioni di buffer per interfasico Xenopus laevis estratto Egg
NOTA: Xenopus laevis rane sono mantenuti e trattati in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla convenzione del Consiglio d'Europa sulla protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini (UE ratificato nel 1998) e la legge tedesca di pertinenza l'uso di animali vertebrati nel campo della ricerca.
- Preparare DTT e 100 volte mix inibitore della proteasi secondo 1.2.3 e 1.2.4. Sciogliere citocalasina B ad una concentrazione finale di 10 mg / ml in DMSO, aliquota (10 o 20 microlitri raccomandato) e conservare a -20 ° C.
- Sciogliere cicloeximide ad una concentrazione finale di 20 mg / ml in etanolo, aliquota (500 microlitriconsigliato) e conservare a -20 ° C. Sciogliere il ionoforo del calcio A23187 ad una concentrazione finale di 2 mg / ml in etanolo, aliquotare e conservare a -20 ° C.
NOTA: PI, DTT, citocalasina B, cicloeximide e A23187 possono essere ripetutamente congelati e scongelati. - Preparare 20x tampone di Mark Modified Ringers (MMR) contenente 2 M NaCl, KCl 40 mm, 20 mM MgCl 2, 40 mM CaCl 2, 2 mM EDTA e Hepes 100 mm, aggiustare il pH a 8,0 con 5 N KOH.
NOTA: Il 20x MMR può essere mantenuto nel corso lungo tempo a temperatura ambiente. A seconda delle quantità di uova, per una preparazione di estratto uovo interfasico 1 l di 1x MMR a rana iniettato e altri 5-10 litri per le fasi di lavaggio sono necessari. Ri-regolare il pH di 1x MMR alla versione 8.0 con 5 N KOH. 1x MMR pronti a tenere le rane a O / N x 1 deve essere a temperatura ambiente. 1x MMR preparato per la preparazione estratto dovrebbe essere mantenuto freddo fino al suo utilizzo, ma non è essenziale per l'esperimento che la 1x MMR è veramente freddo. - Preparare 1 L di suctampone contenente saccarosio 250 mm, 50 mM KCl, 2,5 mm MgCl 2 e Hepes 10 mM pH 7,5 rosa. Tampone saccarosio deve essere preparato il giorno prima di utilizzare acqua sterile e deve essere conservato a 4 ° C.
- Preparare la soluzione dejellying fresco la mattina dell'esperimento sciogliendo 2% di L-cisteina in 0,25x MMR. Regolare il pH a 7,8 con 5 N KOH. Conservare a 4 ° C fino al suo utilizzo.
5. Protocolfor interfasico Xenopu s estratto laevis Egg
- Iniettare 120 IE gonadotropina del siero di cavalla gravida (PMSG) nel sacco linfatico dorsale di ogni rana 3-10 giorni prima dell'esperimento (5 ml siringhe, 27 G ¾ '' aghi).
NOTA: Questa iniezione sarà indurre l'ovulazione. La quantità di uova una rana depone varia molto. Una rana bene, che potrebbe produrre uova che occupano un volume fino a 7 ml dopo essere stato in vacanza o jellynated che corrisponde a un massimo di 3,5 ml di estratto greggio. Tuttavia, ritengono che alcune rane potrebbero non appoggiare o lo faranno lauova marce y. - Iniettare 500 IE gonadotropina corionica umana (hCG) per la rana la sera prima dell'esperimento (5 ml siringhe, 27G ¾ '' aghi). Ciò indurre il rilascio delle uova. Mantenere le rane per 13-17 ore a 18 ° C in vasche individuali contenenti 1,2 l 1x MMR (pH 8).
- Raccogliere le uova da loro versando in 600-1,000 bicchieri di vetro ml.
NOTA: Prendere solo le buone partite di uova che vengono deposte singolarmente, simili per dimensioni e chiaramente pigmentati con un oscuro e un mezzo di colore chiaro. Non prendere le uova che formano stringhe o quello sguardo gonfio e bianco. Questi dovrebbero essere risolte durante tutta la procedura con una plastica pipetta Pasteur. Per una descrizione dettagliata del bene contro il male uova vedere Gillespie et al. 6 - Lavare uova intensamente, circa 4 volte, con 1x MMR per decantazione del surnatante quando le uova si sono stabiliti e riempire il bicchiere con tampone fresco dopo.
NOTA: Iluova sono stabili prima che siano dejellynated e tampone di lavaggio possono essere applicati direttamente sulle uova. - Dejellynate le uova da incubazione nella soluzione di cisteina 2%. Cambiare tampone una volta dopo 2-4 minuti di decantazione del buffer e riempire accuratamente il bicchiere con tampone fresca. Considerdejellying completa quando il volume delle uova diminuisce drasticamente e le uova diventano più densamente.
NOTA: Il dejellying ha bisogno di circa 5-7 minuti e deve essere interrotto quando visibile, ma più tardi dopo 10 min. - Uova Lavare circa 4 volte con 1x MMR di decantazione e ricarica il surnatante tampone.
NOTA: Le uova sono più fragili dopo essere dejellynated e, quindi, le fasi di lavaggio devono essere fatte più attentamente. La MMR dovrebbe essere piuttosto risciacquato sulla parete del bicchiere anziché direttamente sulle uova. - Attiva uova in 100 ml 1x MMR aggiungendo 8 ml di calcio ionoforo (2 mg / ml in etanolo). Smettere di attivazione quando protezione animale contrazione siaarriva visibile o dopo 10 min.
NOTA: La contrazione protezione animale può essere identificato con la compattazione del mezzo nero dell'uovo. - Lavare accuratamente 4 volte con 1x MMR per decantazione e ricarica il surnatante buffer.
- Incubare le uova per 20 min a 1x MMR a temperatura ambiente.
- Preparare i tubi centrifugazione durante il tempo di incubazione: Luogo 50 microlitri tampone saccarosio, 50 microlitri 100 volte mix inibitore della proteasi, 5 ml 1 M DTT, 12,5 ml cicloeximide (per evitare di traduzione, in particolare della ciclina B) e 2,5 microlitri citocalasina B (a prevenire la polimerizzazione) in 5 ml tubi centrifugazione (13 x 51 mm). In alternativa, per più di 30 ml di uova, 14 ml (14 x tubi 95 mm) può essere utilizzato, in questo caso volumi aumento di 2,4 volte.
- Lavare le uova due volte con freddo tampone saccarosio (decantare e buffer di ricarica nel bicchiere di vetro) e trasferirli in tubi centrifugazione utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con ampia apertura (tagliare l'estremità più stretta).
- PacchettoUova di filatura per 1 min a 130 x g. Mettere i tubi in 15 ml provette coniche per questo scopo (mettere le provette 14 ml in 50 ml provette coniche, rispettivamente). L'obiettivo è quello di eliminare il più buffer come possibile prevenire diluizione dell'estratto. Dopo la centrifugazione, rimuovere l'eccesso di tampone con una plastica pipetta Pasteur e, infine riempire più uova sulla parte superiore.
- Spin in un 6 x 5 ml oscillare rotore per 20 minuti a 21.000 xg a 4 ° C.
- Rimuovere estratto a bassa velocità con una siringa da 5 ml con 16 G 1 ½ '' ago, tra tuorlo giallo sulla parte superiore e detriti uovo rotto scuro nella parte inferiore. A questo scopo, spingere l'ago della siringa attraverso la parete della provetta appena sopra lo strato di detriti uovo rotto nella parte inferiore. Tenere il tubo contro una resistenza quando si spinge con l'ago.
NOTA: Un pieno di 5 ml di tubo di centrifugazione dà tra 1,8-2,5 ml di estratto. - Per 1 ml di estratto aggiungere 10 microlitri di 100 volte mix inibitore della proteasi, 1 mldi 1 M DTT, 2,5 ml cicloeximide (20 mg / ml) e 0,5 ml citocalasina B (10 mg / ml). Mantenere l'estratto in ghiaccio.
NOTA: L'estratto può essere sia utilizzato direttamente per l'esperimento o aliquotato, scatto congelati e conservati in azoto liquido per parecchi mesi. Congelamento l'estratto diminuirà la sua attività. Per gli esperimenti delicati come immunodeplezione si consiglia vivamente di utilizzare l'estratto fresco immediatamente.
6. Preparazione di buffer per in vitro Ricostituzione della cromatina decondensazione
- Preparare la soluzione energetica mix stock contenente 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml creatina fosfato e 2,5 mg / ml di chinasi della creatina in tampone contenente saccarosio 250 mm, 1,2 mM Hepes, 5.9 mM KCl e MgCl 0,3 mm 2. Aliquota e conservare a -80 ° C. Utilizzare appena dopo lo scongelamento, non ricongelare.
- Sciogliere 0,2 g / ml di glicogeno in acqua deionizzata. Conservare a -20 ° C. Sciogliere aminopurine 6-dimetil (DMAP) ad una concentrazione finaledi 0,25 M in DMSO. Aliquota e conservare a -20 ° C. Utilizzare appena dopo lo scongelamento, non ricongelare.
- Preparare 30% (w / v) di saccarosio in PBS, filtro e conservare a 4 ° C. Preparare la soluzione VikiFix 4% contenente 80 mm TUBI pH 6,8, 1 mM MgCl 2, 150 mm di saccarosio e il 4% paraformaldeide (PFA) (ATTENZIONE! Lavorare sotto cappa chimica, indossare guanti e protezione per bocca).
NOTA: Il PFA è difficile da sciogliere quindi si consiglia di farlo come segue: Per 1 l Viki-Fix sciogliere 24.2 g TUBI e 40 g PFA in bicchieri separati, entrambi a caldo (quasi bollente) acqua deionizzata. Entrambi sciogliere attraverso l'aggiunta di NaOH 10 N ma attenzione a non aggiungere troppo. Aggiungere 51,4 g di saccarosio e 1 ml 1 M MgCl 2 alla soluzione PFA. Aggiungere la soluzione PIPES all'altro mix. Riempire fino a 1 l volume finale e aggiustare il pH a neutralità aggiungendo NaOH. - Sciogliere 10 mg / ml di 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in acqua (ATTENZIONE! Indossare dei guanti). Conservare inal buio a -20 ° C.
7. Protocollo per in vitro Ricostituzione della cromatina decondensazione
- Spin estratto interfasico bassa velocità per 12 min a 386.000 xg in un angolo fisso 20 x 0,2 ml o 355 000 xg in un rotore 10 x 2,0 ml.
- Rimuovere delicatamente lo strato lipidico in alto utilizzando una pompa a vuoto o una pipetta e prendere il surnatante (in seguito denominato estratto ad alta velocità) evitando la contaminazione della membrana dal livello inferiore e scartare il pellet.
NOTA: per ridurre la contaminazione membrana possibile è consigliabile girare l'estratto due volte o per diluire l'estratto con il 20% del volume con tampone saccarosio prima della centrifugazione. Tuttavia, la diluizione e le fasi di centrifugazione aggiuntivi possono ridurre l'attività estratto. - Dispensare 18 ml di estratto ad alta velocità in una provetta da 1,5 ml di reazione, aggiungere 0,7 microlitri di cluster mitotico (ammontare può essere leggermente variata in funzione della cromatina concentrazione azione), 0,5 ml di glicogeno, 0,5 mlmix energetico e 0,3 DMAP ul. Utilizzare punte con un'ampia apertura per mescolare la reazione non appena viene aggiunto per impedire la cromatina taglio della cromatina decondensing.
NOTA: La reazione può essere condotta in presenza o assenza di membrane (vedi Figura 3). Per decondense cromatina in presenza di membrane, aggiungere 2 ml di membrane galleggiavano preparati secondo il protocollo descritto da Eisenhardt et al. 16 - Incubare la miscela di reazione fino a 2 ore (o meno per studiare precedenti punti temporali del processo decondensazione) a 20 ° C.
- Fissare il campione aggiungendo 0,5 ml di ghiaccio freddo Viki-Fix contenente 0,5% di glutaraldeide e 0,1 mg / ml DAPI e incubazione per 20-30 min in ghiaccio.
NOTA: Se i campioni vengono ulteriormente elaborati per immunofluorescenza, la fissazione dovrebbe essere fatto senza glutaraldeide come questo spesso interferisce con la colorazione anticorpale. Tuttavia, se viene analizzata solo la colorazione DAPI, l'aggiunta di eccessoaraldehyde conserverà una struttura della cromatina più bello. - Incubare coprioggetti rotonde (diametro 12 mm) per 5 minuti con la soluzione di lisina poli-L-per aumentare l'affinità dei coprioggetto alla cromatina. Asciugare il coprioggetto su carta da filtro in seguito.
- Assemblare i tubi a fondo piatto centrifugazione (6 ml, 16/55 mm) mettendo i coprioggetti con il sito rivestito all'inizio sul fondo del tubo di centrifugazione. Aggiungere 800 ml di cuscino di saccarosio 30% e lo strato campione fissato sulla parte superiore.
- Spin per 15 min a 2500 xga 4 ° C.
NOTA: I tubi centrifugazione a fondo piatto si adattano a rotori che adottano da 15 ml provette centrifuga coniche. - Decantare il surnatante, quindi rimuovere i coprioggetti dai tubi colpendo con attenzione la parte inferiore del tubo di centrifugazione con un 16 G 1 ½ '' ago della siringa. Per questo nastro scopo il coperchio dell'ago e l'ago stesso insieme al loro fondo e tagliare l'estremità anteriore del coperchio in modo che l'ago sporge circa 3mm fuori. Quando il vetrino viene sollevato dallo spillo su un sito, utilizzare una pinzetta per rimuovere il vetrino.
- Lavare il vetrino rapidamente immergendolo in acqua deionizzata, asciugare delicatamente toccando il suo lato di carta da filtro e posizionarlo sul vetrino su una goccia di mezzo di montaggio. Sigillare con smalto, asciutto e tenere nel buio.
NOTA: I campioni fissi senza glutaraldeide possono essere memorizzati in PBS in una piastra da 24 pozzetti e riutilizzarle per immunofluorescenza. Se conservata per diversi giorni, aggiungere 0,05% di sodio azide (NOTA! Indossare guanti) al PBS per evitare la contaminazione con batteri. - Analizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza del segnale DAPI (utilizzando ad esempio, un microscopio confocale con un laser 405 nm).
8. Preparazione del tampone per immunofluorescenza colorazione di In Vitro ricostituiti cromatina decondensazione Campioni
- Preparare PBS secondo 1.1.1. Sciogliere NH 4 Cl di un'alettala concentrazione al di 50 mm in PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C. Sciogliere 5 mg / ml DAPI in PBS (preparare al momento dell'uso). Aggiungere 0,1% Triton X-100 al PBS. Conservare a 4 ° C. Preparare tampone bloccante al momento dell'uso diluendo 3% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS + 0,1% Triton X-100.
9. Protocollo per immunofluorescenza colorazione di In Vitro ricostituiti cromatina decondensazione Campioni
NOTA:. Tutti i seguenti incubazione dei vetrini sono realizzati in una 24-pozzetti con almeno 250 soluzione pl per bene, se non diversamente indicato in vitro decondensazione campioni cromatina sono più sensibili di cellule fissate quindi fare attenzione quando si aggiungono o si rimuove soluzioni. Si raccomanda di utilizzare pipette Pasteur di plastica tagliata angolare. Per la procedura di lavaggio e di incubazione anticorpo secondario posizionare la piastra a temperatura ambiente sul dondolo o piattaforma rotante, in movimento non più veloce di 100 rpm.
- Quench campioni incubando coprioggettos con 1 ml di NH 4 Cl in PBS per 5 min. Campioni del blocco di loro incubazione con 1 ml tampone di bloccaggio per almeno 30 minuti.
- Assemblare una camera umida per l'incubazione con l'anticorpo primario: Mettere un tessuto bagnato sul fondo di una scatola richiudibile e il coperchio della piastra da 24 pozzetti capovolta sulla parte superiore del tessuto bagnato. Posizionare parafilm nel coperchio e aggiungere 70 ml di soluzione di anticorpi per campione sul parafilm. Per la soluzione di anticorpi, diluire antisiero o affinità anticorpi purificati 1: 100 in tampone di bloccaggio.
- Posizionare il coprioggetto capovolta sulla parte superiore della soluzione di anticorpi e incubare per 1 a 2 ore. Posizionare i coprioggetti indietro al 24 pozzetti con il lato rivolto verso l'alto del campione e lavare campioni tre volte per 10 min con 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Incubare vetrini per 1 ora a temperatura ambiente a 250 immunofluorescenza-tagged secondario ml diluito in tampone di bloccaggio ad una concentrazione consigliata dal produttore. Proteggere dalla luce. Lavare three volte per 10 min con 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Incubare i campioni per 10 minuti con 1 ml di 5 mg / ml DAPI in PBS. Lavare tre volte per 5 min con 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
- Lavare il vetrino rapidamente immergendolo in acqua deionizzata, asciugare delicatamente toccando il suo lato di carta da filtro e posizionarlo sul vetrino da microscopio in cima ad una goccia di mezzo di montaggio. Sigillare con smalto, asciugare e conservare a 4 ° C al buio fino all'uso. Analizzare i campioni al microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Ora la dipendenza della reazione decondensazione
La figura 1 mostra un tipico andamento temporale del dosaggio decondensazione. Il cluster di cromosomi visibili all'inizio della reazione decondenses e si fonde in un unico, rotondo e liscio nucleo. Quando l'estratto uovo è sostituito dal saccarosio tampone cluster cromosoma rimane condensata, che suggeriscono che l'attività decondensazione è presente nell'estratto uovo.
Decondensazione cromatina è un processo a carico di energia
La reazione decondensazione in vitro può essere convenientemente manipolato per esempio, per aggiunta di inibitori. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, l'ATP non idrolizzabile o analoghi GTP, ATPγS o GTPγS, sono stati aggiunti alla reazione. Entrambi inibiscono la proiezione decondensazione, che è un ATP e GTP dipendente, processo attivo (Figura 2).
Il dosaggio decondensazione è stata eseguita in presenza o assenza di membrane (figura 3). Si prega di notare che in entrambe le condizioni cromatina subisce decondensazione, ma l'aggiunta di membrane risultati nei nuclei più grandi. Molto probabilmente, riforma della membrana nucleare induce un passo decondensazione secondario da un altro meccanismo dipendente dal trasporto nucleare.
Figura 1. Naturalmente il tempo di th e in vitro decondensazione reazione. Mitotic cromatina ammassi di cellule HeLa sono state incubate con interfasico estratto uovo Xenopus. I campioni sono stati fissati in momenti indicati con il 4% PFA e 0,5% glutaraldeide, colorate con DAPI e analizzati dal co microscopia nfocal. Ri-stampata dal Magalska et al. 8. Barra della scala è 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. cromatina decondensazione richiede ATP e GTP idrolisi. Decondensazione cromatina è stata eseguita in presenza di 10 mM ATPγS, 10 mM GTPγS o buffer di controllo. I campioni sono stati fissati con 4% PFA e 0,5% glutaraldeide in momenti indicati e analizzati mediante microscopia confocale. Ri-stampata dal Magalska et al. 8. Barra della scala è 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. cromatina decondensazione in presenza ed in assenza di membrane. Decondensazione cromatina è stata eseguita in assenza (A) o presenza (B) di galleggiamento purificato membrane per 120 min. I campioni sono stati fissati con 4% PFA e 0,5% glutaraldeide e analizzate mediante microscopia confocale. La cromatina è macchiato con DAPI, membrane con DiIC 18 (1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato). Barra della scala è 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Xenopus laevis estratti a base di uova sono uno strumento molto utile per riprodurre fedelmente i processi cellulari in vitro, e questo sistema è stato utilizzato con successo nella caratterizzazione degli eventi del ciclo cellulare e la divisione cellulare 2, 3,5,6,17. A causa di grandi negozi di componenti nucleari sequestrati nell'uovo durante oogenesi, estratti a base di uova sono una fonte eccellente di componenti cellulari. Rispetto ad altri approcci come RNAi su linee cellulari di mammifero tessuto o manipolazione genetica, che offre diversi vantaggi: Il sistema non cellulare permette lo studio dei processi cellulari in cui la vitalità cellulare sarebbe altrimenti una limitazione. Inoltre singole fasi dei processi complessi possono essere analizzati in saggi semplici. Il test decondensazione qui presentato permette lo studio dei meccanismi molecolari di decondensazione postmitotici senza interferenze da altri eventi mitosi, rispettivamente. Estratti di uova di Xenopus sono facili da manipolare per esaurimento delle proteine specifichee aggiunta di inibitori o proteine mutate 8. Ad esempio, la Figura 2 mostra il risultato della somma dei non idrolizzabili ATP o GTP analoghi, ATPγS e GTPγS al dosaggio decondensazione. Per diluizione e centrifugazione differenziale di Xenopus uova componenti come membrane e citosol possono essere separati 16. La Figura 3 mostra il test decondensazione eseguita in presenza o assenza di membrane. Infine, il saggio acellulare può anche essere utilizzato per identificare nuovi fattori per esempio, da un approccio frazionamento. Usando questa strategia abbiamo individuato la AAA + -ATPasi RuvBL1 / RuvBL2 come decondensazione cruciale fattori 8.
Nei sistemi in vitro sulla base di X. laevis uova sono stati impiegati con differenti modelli di DNA:. Forbes et al hanno dimostrato che l'iniezione di fago λ DNA in X. unfertilized uova laevis indotto l'assemblaggio della cromatina su nakDNA ed fago λ. Come iniezione di DNA virale attivato l'uovo, l'assemblaggio della cromatina è stata seguita da formazione di una struttura nucleo-like 18 e analogamente λ-fago DNA può essere utilizzato in combinazione con estratti uovo per generare nucleo come strutture in vitro 19. Perline magnetiche rivestite con DNA sono stati utilizzati per studiare chromatinization di DNA 20 e il reclutamento di membrane nucleari 21 e assemblaggio di una membrana nucleare e pori complessi 22, anche se rimane aperta fino a che punto questo assomigliava un bona fide processo riassemblaggio nucleare . Il protocollo presentato qui permette decondensazione di isolati gruppi cromatina mitosi dalle cellule HeLa utilizzando estratto generato da uova di Xenopus attivati. Si ricostruisce accuratamente eventi che hanno portato a una riforma di un nucleo interfasico 8. Rispetto al gruppo reazione nucleare ampiamente applicato utilizzata per studiare la formazione della membrana nucleare evengono utilizzati complessi pori nucleari alla fine della mitosi, nel saggio decondensazione HeLa mitotico cromatina cluster invece di sperma DNA. DNA dello sperma può essere montato nella cromatina mitotico o anche cromosomi individuali su incubazione con estratto preparato da uova non fecondate e non attivati 3. Abbiamo deciso di usare i cluster mitotico come fonte di cromatina di semplificare la procedura ed evitare interferenze da condensazione della cromatina. Inoltre, la preparazione dell'estratto dell'uovo è leggermente modificata: Per la decondensazione cromatina estratto bassa velocità controllata da due fasi di centrifugazione ad alta velocità in rotori ad angolo fisso vengono utilizzati. Estratto a bassa velocità può essere conservato per un massimo di sei mesi in azoto liquido senza perdere la sua attività. Al contrario, nelle reazioni nucleari assemblaggio, citosol e membrane galleggiavano sono generati da estratti bassa velocità di diluizione e centrifugazione differenziale ad alta velocità prima possibile congelamento (vedi Eisenhardt et al. 16 per una detaiprotocollo led). Nel nostro sistema di analisi, aggiunta delle membrane permette la formazione di una membrana nucleare chiusa compresi complessi del poro nucleare. I nuclei risultanti sono competenti per l'importazione e l'esportazione nucleare 8. Così, questo sistema supporta sia cromatina decondensazione e busta riforma nucleare. È interessante notare, decondensazione cromatina è possibile anche in assenza di membrane (figura 3). Tuttavia l'aggiunta di membrane risultati in nuclei leggermente più grandi. Molto probabilmente, la riforma della membrana nucleare induce un passo decondensazione secondario da meccanismi ancora non definite, che dipende importazione nucleare.
Per l'isolamento di cluster cromatina mitotiche da cellule HeLa, è stata utilizzata una versione modificata del protocollo stabilito dalla Gasser e Laemmli 15. Cellule mitotiche sincronizzati vengono lisate in un tampone contenente il detersivo digitonina non ionico e da forze meccaniche. La cromatina è isolato come cluster che contengonotutti i cromosomi di un nucleo. La differenza fondamentale rispetto ai protocolli di isolamento singoli cromosoma è il fatto che le cellule non sono hypotonically gonfio ma raffreddato a 4 ° C prima di lisi. Ciò impedisce la disconnessione dei singoli cromosomi 15, 23. Rispetto al protocollo pubblicato da JR Paulson 23 che ha riconosciuto il vantaggio di isolamento di interi cluster cromatina, Gasser & Laemmli usati buffer-EDTA contenente buffer poliamminiche invece di Mg 2+ based per ridurre l'attività di chinasi, nucleasi, proteasi e fosfatasi e da questo diminuire la quantità di proteine e DNA modificazioni che si verificano durante il processo di isolamento 15. Inoltre, utilizzando un gradiente di silice colloidale di particelle durante la centrifugazione differenziale altamente riduce la contaminazione citoplasmatica. Il protocollo può anche essere utilizzata per isolare i cluster cromatina mitotiche dall'ovaia criceto cinese e cellule di topo 15.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca e l'ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON a WA) e un PhD Fellowship della Boehringer Ingelheim Fonds a AKS Figura 1 e 2 sono ristampati da Developmental Cell 31 (3), Magalska , RuvB-come la funzione ATPasi nella cromatina decondensazione alla fine della mitosi, 305-318, 2014 et al., gentile concessione di Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spermine tetrahydrochloride | Fluka analytical | 85610-25G | |
| spermidine trihydrochloride | Sigma | S2501-5G | |
| high-purity digitonin | Millipore | 300410-1GM | toxic |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | toxic |
| thymidine | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazole | Calbiochem | 487928 | toxic |
| 37% formaldehyde solution | Roth | 7398-1 | toxic |
| trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | toxic |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF hydrochloride | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatin | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinin | Roth | A162.3 | |
| Percoll (colloidal silica particles solution) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² tissue culture flasks | Greiner Bio-one | 658175 | |
| heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogenizer (40 ml tissue grinder) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer chamber | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µm cell strainer, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| cytochalasin B | Applichem | A7657,0010 | toxic |
| cycloheximide | Roth | 8682.3 | toxic |
| L-cystein | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG available as Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG available as Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mixed calcium-magnesium-salt) | Enzo | ALX-450-002-M010 | toxic |
| syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatine phosphat disodium salt | Calbiochem | 2380 | |
| creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | toxic |
| centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl) | Biozym | 729065 | |
| 50% glutaraldehyde solution, grade I | Sigma alderich | G7651-10 ml | toxic |
| 0.1% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920-100 ml | |
| flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories | H1000 | |
| tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl) | Biozym | 729055 | |
| 12 mm coverslips | Thermo Scientific | 0784 #1 |
References
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