Introduction
Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein Protokoll für die Abtrennung von bakteriellen Endosporen aus vegetativen Bakterienzellen in Umweltproben bereitzustellen. Die Bildung von bakteriellen Endosporen ist eine Überlebensstrategie, in der Regel durch Verhungern ausgelöst, in einer Anzahl von Bakteriengruppen zum Stamm Firmicutes 1 gehör gefunden. Endosporen-bildende Bakterien sind gut untersucht, vor allem, da eine Reihe von Stämmen sind Krankheitserreger und folglich der medizinischen Bedeutung (zB Bacillus anthracis oder Clostridium difficile). Umwelt Stämme von Endosporen-bildenden Bakterien wurden aus nahezu jedem Umfeld (Boden, Wasser, Sediment, Luft, Eis, menschlichen Darm, Tiere gut, und mehr) 1-3 isoliert. Daher sind Firmicutes das zweithäufigste Stamm in Stammsammlungen 4.
Wegen ihrer hardy äußeren Rinde und Schutzkernproteine können Endosporen extremen Umweltbedingungen im Bereich fr überlebenom Austrocknung zu hohe Strahlungs, extreme Temperaturen und schädliche Chemikalien 5. Diese bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit macht es eine Herausforderung, DNA von Endosporen 6-8 extrahieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum sie in der Umweltsequenzierungsstudien 9,10 sehen worden. Andere Verfahren, wie die Zielrichtung Endosporen in Umweltproben durch fluoreszierende Antikörper 11, Quantifizierung von Dipicolinsäure (DPA) im Boden 12 und Sediment 13, Durchflusszytometrie 14 oder Pasteurisierung und anschließende Kultivierung 15,16 verwendet worden, um in abzurufen oder zu quantifizieren Endosporen Umweltproben. In den letzten Jahren optimierten DNA-Extraktionsverfahren als auch spezifische molekulare Primer zielen Endosporen spezifischer Gensequenzen wurden entwickelt 10,17-20. Dies hat dazu beigetragen, mehr Biodiversität in dieser Gruppe von Bakterien 21 offenbaren und hat sich auch auf Anwendungen in Industrie und Medizin zum Nachweis von Endosporen geführtZum Beispiel in Milchpulver 19.
Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf dem Unterschied in der Beständigkeit gegenüber Schad physikochemischen Bedingungen (wie Wärme und Reinigungsmittel) von bakteriellen Endosporen verglichen mit Zellen, vegetativen basiert. Vegetativen Zellen in einer Probe zu zerstören wir nacheinander erhitzen, Lysozym und niedrigen Konzentrationen von Detergentien. Die Zeit und die Kraft dieser Behandlungen sind optimiert worden, um nicht-Sporen zu zerstören, sondern um alle vegetativen Zellen lysieren. Einige Zellen in einer Umweltzellpool sind widerstandsfähiger als andere, so, um die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung aller vegetativen Zellen zu erhöhen, verwenden wir drei verschiedene Behandlungen. Der Vorteil und die Neuheit dieses Verfahrens ist, dass die Endosporen nach der Behandlung noch intakt und kann für weitere Downstream-Analysen verwendet werden. Dazu gehören DNA-Extraktion, quantitative PCR (qPCR) und Amplikon oder Metagenom-Sequenzierung (Targeting gezielt die Gruppe der Endosporen und damit Reduzierung diversity, bei gleichzeitiger Erhöhung Deckung). Die Endosporen könnte auch für die nachgeschalteten Anbau oder die Quantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, Durchflusszytometrie oder Detektion von DPA. Ein wichtiges Merkmal dieses Verfahrens ist, dass durch Vergleichen eines unbehandelten Probe mit einer behandelten Probe, kann man die Menge und Vielfalt von Endosporen in einer Umweltprobe zusätzlich zu der Komponente, die Zellen vegetativen abzuleiten.
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Protocol
1. Herstellung von Chemikalien und Geräte
- Bilden 500 ml einer 1% Natriumhexametaphosphat (SHMP) (NaPO 3) n-Lösung und durch Autoklavieren sterilisieren.
- Sterilisieren Nitrocellulose (NC) Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 47 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen.
- Sterilisieren NC-Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 25 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen.
- Wiegen und beachten Sie das Leergewicht von sterilen 50-ml-Röhrchen (mit Kappe auf) (ein Röhrchen je Probe).
- Vorbereitung Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) 1x: make Lösung von 10 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) und 1 mM EDTA Puffer. PH-Wert auf 8 und durch Autoklavieren sterilisieren.
- Vorbereitung Lysozymlösung (20 mg / ml) durch Auflösen von 0,02 g Lysozym in 1 ml TE-Puffer. Im Idealfall machen frische jeder Zeit. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 Woche.
- Vorbereitung physiologischen Lösung durch Lösen von 8 g / l Natriumchlorid(NaCl) in destilliertem Wasser. Durch Autoklavieren sterilisieren.
2. Trennung von Biomasse aus Sediment
- In 3 g Sedimentprobe, um vorher gewogenes steriles 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Ethanol-geflammt Metall Messlöffel. Führen Sie dies in einer sauberen, UV sterilisiert Biosicherheitswerkbank, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP Lösung zu der Probe unter Verwendung eines sterilen Bürette gefüllt. Die SHMP Lösung kann auch gefiltert, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Homogenisieren das Sediment und SHMP-Lösung mit einer Flüssigkeit Dispergierer / Homogenisator (zB Ultra-Turrax-Homogenisator). 70% Ethanol-sterilisiert oder autoklaviert Dispergierlaufrades vor der Verwendung. Führen Sie die Homogenisierung für 1 min bei 17.500 Umdrehungen pro Minute. Ließ die Probe für 2 Minuten ruhen und wiederholen die Homogenisierung für 1 min bei der gleichen Rotordrehzahl.
- Lassen Sie die Probe stehen für 10 min. Bei diesem Schritt werden die schwersten Teilchen (Mineralien) zu begleichen. Die Zellen und alle organischen Bestandteile der Probe jedoch wschlecht in Lösung bleiben. Danach den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Tube, während kümmert sich nicht um das Sediment Pellet stören.
- Um das Sediment Pellet hinzuzufügen erneut 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP-Lösung mit einem sterilen Bürette. Dann wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4. Diese Wiederholung sorgt für die Trennung von der maximalen Anzahl von Zellen und organische Teilchen aus der Mineralkomponente des Sediments. Der Überstand dieser zweiten Trennung kann mit dem Überstand aus der ersten Trennzusammengeführt werden.
Hinweis: Die folgenden Schritte werden alle auf dem Überstand durchgeführt (die Zellbiomasse). Die mineralische Komponente (Sediment Pellet) kann verworfen werden. - Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 g für 1 min. Dieser Schritt erhöht die Beschleunigungskraft genug, um kleine Mineralpartikel absetzen, während die biologischen Zellmaterials noch in Lösung bleibt. Nach dem Zentrifugieren den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in einesauberes 50-ml-Tube. Entsorgen Sie die Mineral Pellet.
- Bestimmen das endgültige Volumen der Lösung, die Biomasse durch Wiegen der Probe. Die Gewichtsbestimmung wird vermieden, daß die Probe in einem Messzylinder übertragen und reduziert die Gefahr einer Kontamination.
3. Sammlung von Biomasse auf Filter Membrane
- Bereiten Filtrationseinheit (47 mm Durchmesser Membranen) und Vakuumpumpe. Sterilisieren Sie die Filtereinheit entweder durch Autoklavieren oder (wenn Pyrexglas) durch Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen, bevor Sie mit dem Protokoll.
- In sterilen NC-Membran in die Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette.
- Die Hälfte des Überstandsprobe (aus Schritt 2.6) auf der Membranfiltrationseinheit und sammeln Zellen auf der Membran unter Verwendung der Vakuumpumpe.
- Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. Legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale.
- Schneiden Sie die Membran in die Hälfte unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Fügen Sie jede Hälfte der Membran in eine separate 2-ml-Tube. Eine Hälfte der Membran für die DNA-Extraktion und Analyse der gesamten Bakteriengesellschaft verwendet werden. Die andere Hälfte der Filter wird bei -80 ° C gelagert werden und dient als eine Sicherung.
- Zeigen neuen NC-Membran auf die Filtrationseinheit und sammeln Biomasse aus der zweiten Hälfte des Probenvolumens (aus Schritt 2.6) mit der Vakuumpumpe.
- Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. Legen Sie die gesamte Membran in eine separate 2-ml-Tube. Diese Probe wird für die Behandlung, um Endosporen von vegetativen Zellen getrennt verwendet werden. Die Probe kann bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert werden.
4. Lyse von vegetativen Zellen
- Führen Sie dieBehandlung Endosporen aus vegetativen Zellen auf der zuvor auf einem NC-Membran (Schritt 3.6) gesammelt Biomasse abzutrennen.
- Wenn die Membran war gefroren, lassen Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten auftauen. Dann legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale und schneiden Sie es (etwa 4 mal) in kleinere Stücke unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Dann legen Sie alle Membranfilterstücke in ein steriles 2 ml-Tube.
- Fügen Sie 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) Puffer (siehe 1.5) auf das Rohr, das die Probenmembran und mischen durch Wirbel. Bei diesem Schritt wird die Biomasse von der Membran in der TE-Pufferlösung entfernt.
- Das Röhrchen wird in einen Inkubator bei 65 ° C für 10 min und 80 min. Danach entfernen Sie den Schlauch aus dem Inkubator und abkühlen lassen für 15 Minuten.
- 100 ul frisch hergestelltes Lysozym (siehe 1.5), um eine Endkonzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Nicht das Lysozym nicht hinzufügen, bevor die Probe auf 37 ° C abgekühlt, da dies könnte degrade des Enzyms.
- Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 60 min und 80 min werden die optimalen Bedingungen für die Lysozym vegetative Zellen zu lysieren.
- Nach kompletter Lyse, fügen 250 ul 3 N Natriumhydroxid (NaOH) und 250 & mgr; l 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung zu der Probe. Durch das Hinzufügen dieses, das Probevolumen 1,5 ml erreicht und es besteht eine Endkonzentration von 0,5 N NaOH und einer Endkonzentration von 1% SDS.
- Inkubieren dieser Mischung bei RT für 60 min und 80 min. Zugabe der Base und Reinigungsmittel werden in endgültige Zell-Lyse zu helfen. Die Konzentration dieser Reinigungsmittel hat, um nicht die Endosporen schaden optimiert, während Lysieren vegetativen Zellen.
- Bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit, die Durchmesser von 25 mm Membranen hält durch Autoklavieren, oder (wenn Pyrexglas) Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen.
- Legen Sie eine 0,2 um NC-Membran (Durchmesser 25 mm) an der Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. </ li>
- Hinzufügen der Probe aus Schritt 4.7 auf die Membran und Filtern der Flüssigkeit unter Verwendung der Vakuumpumpe. Wenn Flüssigkeit durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe. Bei diesem Schritt wird die lysierte vegetative Zellmaterial entfernt wird, da es nicht auf die Membran zurückgehalten. Nur Endosporen auf der Membran verbleiben.
- 2 ml steriler physiologischer Lösung zu waschen Rest Wasch- und filtern Sie die Flüssigkeit mit Hilfe der Vakuumpumpe.
- Wenn Flüssigkeit vollständig gefiltert wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe. Verlassen die Membran auf der Filtrationseinheit.
5. DNase-Behandlung
Hinweis: Führen Sie die DNase-Behandlung direkt auf der Filtermembran. Es ist wichtig, dass die Filtereinheit nicht auslaufen und die Vakuumpumpe wird abgeschaltet.
- Fügen Sie 450 ul sterilem Wasser, 50 ul DNase-Reaktionspuffer (1x) und 0,5 ul DNase Enzym direkt auf der Filtermembran und lassen Sie es für 15 Minuten stehen gelassen. Wenn möglich, tun dies die Verdauung in einem Raum, der leicht ist Kriegmer als durchschnittliche RT, da das Enzym arbeitet besser bei Temperaturen von 25 ° C und darüber.
Anmerkung: Halten des Bunsenbrenners Seite der Filtereinheit erhöht auch die Temperatur und hat den zusätzlichen Vorteil, halten die Umgebung steril daher reduzierten Risiko der Kontamination der Proben. - Wenn die DNase-Verdau beendet ist, schalten Sie Vakuumpumpe, um das Enzym aus der Probe zu entfernen.
- Abzuwaschen restliche Enzym durch Zusatz und Filtrieren von 1 ml physiologischer Lösung.
- Wenn Flüssigkeit vollständig durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe und entfernen Sie die Filtermembran, Endosporen mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
Hinweis: Die Probe getrennt Endosporen ist nun bereit für Downstream-Analyse. Lagerung bei -20 ° C, wenn für die DNA-Extraktion oder alternativ bei 4 ° C verwendet werden, wenn für die Keimung und Kultivierung verwendet.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht 10,21. Bitte für die Umwelt Interpretation und Diskussion der Daten beziehen sich auf diesen Artikel.
Das Gesamtverfahren ist in Figur 1 zusammengefaßt und entspricht drei Hauptschritten: Zuerst wird die Trennung von Biomasse aus Sediment oder andere umwelt Matrix; Zweitens ist die Zerstörung von vegetativen Zellen; und drittens die nachgeschaltete Analyse der getrennten Endosporen. Downstream Analyse könnte bestehen, beispielsweise der DNA-Extraktion und Amplikon-Sequenzierung Vielfalt bestimmen. Die DNA-Extraktion optimiert werden muss, um die Lyse von Endosporen gewährleisten. In Sedimentproben haben wir dies durch die Verwendung eines kraftvollen sequentielle DNA-Extraktionsverfahren 10 erreicht. Die Anwendung des Verfahrens im Sediment zeigt eine signifikante Zunahme in der Fraktion der Endosporen bildende Firmicutes nach der Trennung. Im Amplikon-Sequenzierung der 16S rRNAGens, Firmicutes in den unbehandelten Proben (ganze Gemeinde) entsprach nur 8,0 und 19,0% der Sequenzen (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu nach der Behandlung Firmicutes repräsentiert 90,6% und 83,9% des endospore angereicherte Probe. Die zwei Großaufträge von Endosporen bildenden Firmicutes, Bacilliales und Clostridiales wurden mit der Methode angereichert, im Gegensatz zu der Abwesenheit von Aufträgen wie Lactobacilliales dass nicht endospore bildenden Firmicutes sind. Um zu zeigen, daß das Verfahren besonders geeignet ist für die Anreicherung von wahren Endosporen wurden andere Gruppen, die zur Herstellung von sporenartigen Strukturen analysiert. Dementsprechend ist die Frequenz des Actinobacteria, Cyanobakterien und Myxococcales nahm nach der Behandlung, um Zellen zu lysieren.
Die Effizienz der Behandlung wurde ebenfalls unter Verwendung von Reinkulturen demonstriert. Ein endospore Herstellung (> 95% Endosporen) Paenibacillus alvei, Bacillus subtilis und Bacillus megaterium Escherichia coli wurden behandelt, wie in dem Protokoll für die Lyse von vegetativen Zellen beschrieben. Alle Kulturen wurden anschließend in Nährbouillon bei 37 ° C inkubiert und das Wachstum wurde unter Verwendung von optischen Dichte bei 600 nm Wellenlänge gemessen. Wachstum wurde für die Endosporen Kulturen beobachtet, während kein Wachstum wurde in dem behandelten E. beobachtet coli-Kultur, was beweist, dass die vegetativen Zellen sind irreversibel geschädigt (Abbildung 2).
Figur 1. Übersicht der Versuchsdurchführung. Verfahren zur Ableitung Endosporen bildenden Bakterien in Umweltproben zu bereichern. Der Schritt der Abtrennung von Zellen und Endosporen vom Umweltmatrix kann in Abhängigkeit von der Art der Probe (dh Wasserprobe) weggelassen werden. In der Figur sind die nachgeschalteten Verfahren auf der Sporen angereicherte Fraktion corre angewendetchen, um DNA-Extraktion und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Schritte können durch Kultivieren ersetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Überprüfung der Behandlung auf Reinkulturen. Wachstumskurven Verifizieren des Wachstums von Endosporen-bildende Bakterien von einer Suspension von Endosporen von Bacillus subtilis, Bacillus megaterium und Paenibacillus alvei und einer Zellkultur von Escherichia coli mit dem Verfahren zur Lyse behandelt der Zellen. Behandelt = ○. Unbehandelt = ●. Fehlerbalken aus drei unabhängigen Kulturen. Wachstum der Kontrollkulturen und Wiederwachstum des behandelten Kulturen wurde als optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge gemessen. Diese Zahl wurde neu gedruckt from Wunderlin et al. 2014 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Sediment 1 | Sediment 2 | |||
| ganze Gemeinde | endospore angereicherte | ganze Gemeinde | endospore angereicherte | |
| Firmicutes | 8.0 | 90,6 | 19,0 | 83,9 |
| Bazillen | 0,5 | 100 | 5.7 | 15.1 |
| Clostridien | 7.4 | 76,9 | 12,5 | 63,2 |
| Actinobacteria | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| Cyanobakterien | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0,2 | 0.0 |
| Andere Bakterien | 87,8 | 8.3 | 75,7 | 13,9 |
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Discussion
Der Widerstand der Endosporen externe aggressive physikochemische Faktoren (zB Temperatur oder Waschmittel) wurde verwendet, um ein Verfahren, um bakterielle Endosporen von vegetativen Zellen in Umweltproben getrennt entwickeln. Dies ist die erste umfassende Methode, um Endosporen aus Umweltproben in einem zerstörungsfrei zu isolieren. Früheren Methoden zu quantifizieren ist, nachzuweisen oder zu analysieren Endosporen Proben wurden über die Messung des spezifischen Proxies für Endosporen wie Dipicolinsäure oder spezifischer Marker-Gene. Demgegenüber ist bei dem hier vorgestellten Protokoll, ausgenommen Endosporen Probenbestandteile entfernt werden, so dass die Endosporen schließlich als einzige und gereinigten Reste der Probe bleibt. Obwohl auch andere Verfahren wie Pasteurisierung oder Dichtegradientenzentrifugation wurden vorgeschlagen, um für Endosporen 22 anzureichern, unsere Tests gezeigt, dass Dichtegradientenzentrifugation nicht geeignet ist als ein allgemeines Verfahren zur UmweltprobenAufgrund physiologischer Differenzen und unterschiedlichen Dichten der verschiedenen Arten von Endosporen Nern (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu kann unser Protokoll leicht an alle Arten von Umweltproben verwendet werden und eignet sich für nachfolgende Anwendungen einschließlich molekularer Methoden oder Kultivierung.
Es gibt zwei kritische Schritte in dem Protokoll. Die erste ist die Abtrennung von Biomasse aus der Probenmatrix (dh Sedimentpartikeln). Wesentlich ist, dass die Anzahl der Zellen von der Matrix getrennt ist, maximiert werden, um nicht einen Teil der Vielfalt zu übersehen. Für Sedimentproben, wie hier verwendet, ist eine der wichtigsten Einschränkungen des Protokolls ist die Tatsache, daß einige Zellen oder Sporen können nicht aus dem Sedimentmatrix abgelöst wurden und deshalb nicht in die nachgeschaltete Analyse, die eine potentielle Beschränkung des Verfahrens besteht darin enthaltenen . In Abhängigkeit von der Probenmatrix (zum Beispiel wenn es Huminsäuren) Zellen können fest daran gebunden werden kann und daher schwer zu lösen.Die Verwendung von ortho-Phosphat-Puffer sowie gute Homogenisierung mit einem Homogenisator oder Mischer sind wichtig bei diesem Schritt. Um die Wiederherstellung zu steigern, wird das Verfahren der Homogenisierung und Entfernung von Biomasse zweimal wiederholt, wie im Protokoll geschrieben. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt und für Proben von Süßwasser-See Sediment optimiert. Einige Parameter möglicherweise nicht optimal für die anderen Arten von Proben sein. Ein Weg, um die Gemeinschaft Fraktion, die möglicherweise in dem Verfahren übersehen wurde analysiert würde, um das Sediment Matrix zur DNA-Extraktion und Amplikon-Sequenzierung unterwerfen. Wie möglich Modifikationen der Technik, kann der Schritt der Abtrennung der Biomasse aus der Probenmatrix weggelassen werden. Insbesondere, wenn die Umweltprobe nicht enthält organisches Material oder mineralische Partikel, die mit dem stromabwärts-Protokoll (zB Wasser, andere Flüssigkeiten oder gereinigte Kulturen) stören könnten, können vor Trennung nicht erforderlich ist. Für flüssige Proben das Protokoll können Sie direkt im Kapitel 3 zu starten(Sammlung von Biomasse auf Filtermembran).
Der zweite wichtige Schritt des Protokolls ist die Behandlung mit Lysozym, Hitze, NaOH und SDS zu zerstören vegetativen Zellen. Temperatur, Dauer sowie Chemikalienkonzentration wurden alle als nicht Endosporen schaden optimiert, während die Zellen zu zerstören. Diese Parameter sollten daher eng gehalten werden, wie sie sind. Die Verwendung eines ersten Schrittes des Erhitzens der Probe bei 65 ° C sehr wirksam war, um speziell für Endosporen wählen im Vergleich zu anderen Arten von bakteriellen Sporen oder Sporenartigen Strukturen unter den Bakterienstämmen von Actinobacteria Myxobakterien, Cyanobakterien auftritt, die im Allgemeinen nicht hitzebeständig. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, sind nicht-sporenbildender Bakterien nach der Behandlung noch (8,3% bis 14%) vor. Einige Erklärungen dafür sind, dass Sedimentproben sind sehr komplex und können auch den Hafen beständig nicht sporenZellen. Darüber hinaus können übrig gebliebene organische Material ein bestimmter ermöglichen ttached Zellen überleben die Behandlung. Um den Anteil an nicht sporenbildenden Zellen in den behandelten Proben weiter zu reduzieren, sollte das Verfahren auf individuelle Probentyp optimiert werden.
Das Verfahren stellt eine neuartige Werkzeug für die gezielte Untersuchung von endospore Nern in Umweltproben. Die Behandlung, um vegetative Zellen zerstören kann auf Reinkulturen von Zellen und Endosporen getestet und an die individuellen Widerstand der Zellen entsprechen. Die Zerstörung der Zellen kann in den Kurven in Figur 2 gezeigten behandelten Kulturen zu sehen. Das verzögerte Wachstum der behandelten Kulturen kann aufgrund der Zeit, die Endosporen müssen neu keimen und zu bewegen, in der exponentiellen Wachstumsphase sein. Andere mögliche Erklärungen für diese Verzögerung könnte auch eine Schwächung des endospore Kultur oder niedriger Zellzahlen nach der Behandlung sein. Wenn die getrennten Endosporen sind nicht für die DNA-Extraktion verwendet wird, kann der letzte Schritt der DNase-Behandlung verzichtet werden kann.
nt "> Future Anwendungen dieser Technik konnten in Industrien pathogenen Endosporen erkannt werden müssen in Betracht gezogen werden. Ein Beispiel ist in der Lebensmittelindustrie und der klinischen Forschung, wo die Detektion und Analyse (zur Identifizierung) der Endosporen und seine Unterscheidung von vegetativen Zellen (beispielsweise von Lebensmitteln wie Milch oder Erzeugnisse auf Milchbasis) ist von entscheidender Bedeutung. Dies könnte insbesondere relevant bedenkt, dass viele Standardverfahren berücksichtigen direkten DNA-Extraktion aus einer Probe unter Verwendung lytischen Enzymen, die nicht dazu geeignet sind, Endosporen Lyse werden, was somit wird sehen werden kann. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Zellen entfernt werden, und die anschließende Analyse Antworten auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Endosporen im Gegensatz zu den Zellen bereitzustellen. Andere Anwendungen umfassen die Analyse von Endosporen Ebene in verschiedenen Umweltproben (beispielsweise Eis oder Sedimentkernen ), die historischen Archive der Umweltbedingungen sind. In vielen Umgebungen mit relativ stabilen environmental Bedingungen (zB See Sedimentoberfläche) endospore bildenden Firmicutes können in Form von vegetativen Zellen gedeihen. Wenn die Bedingungen sich verschlechtern (beispielsweise durch Nährstoffverarmung im Sediment Beerdigung oder einer Verschiebung hin zu anaeroben Bedingungen) die Zellen zu verschieben, in Endospore Staat. Daher können die abgerufenen endospore Gemeinden aus Sedimentkernen die Umgebungsbedingungen zum Zeitpunkt der Bestattung zu reflektieren und damit als paläoökologische Indikator für die Bedingungen vor der Beerdigung verwendet werden. Wir sind jedoch immer noch das Sammeln von Informationen diesen Anspruch zu unterstützen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Schweizerischen Nationalfonds Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 und No. 151948 und Fundation Pierre Mercier Pour La Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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