Introduction
この研究の目的は、環境試料中の栄養細菌細胞からの細菌の内生胞子を分離するためのプロトコルを提供することにあります。細菌内生胞子の形成は、門ファーミキューテス1に属する細菌群の数で見つかった生き残り戦略、通常は飢餓によって誘発されます。内生胞子形成細菌はよく株の数は、病原体であり、したがって、医療の重要性（例えば、 炭疽菌またはクロストリジウム・ディフィシル ）主な理由は、研究されています。内生胞子形成細菌の環境株は、ほぼすべての環境（土壌、水、底質、大気、氷、人間の腸、動物の腸、およびそれ以上）1-3から単離されています。したがって、ファーミキューテスは、培養コレクション4における第二の最も豊富な門です。
そのため、それらの丈夫な外皮質および保護コアタンパク質の、内生胞子は、FRの範囲の極端な環境条件に耐えることができます高い放射線、極端な温度や有害な化学物質から5 OM乾燥。この驚くべき抵抗は内生胞子6-8からDNAを抽出することが課題になります。彼らは環境配列決定研究9,10に見過ごされてきた理由はここにありそう説明しています。例えば、蛍光抗体11により環境試料中の内生胞子のターゲティングのような他の方法、土壌12と底質13でジピコリン酸の定量（DPA）は、14フローサイトメトリーまたは低温殺菌し、その後の栽培15,16で内生胞子を取得または定量化するために使用されています環境サンプル。近年では、最適化されたDNA抽出法と同様に、特定の分子的プライマー内生胞子特異的遺伝子配列を標的にする10,17-20を開発されています。これは、細菌21のこのグループの中でより多くの生物多様性を明らかにすることができましたし、また内生胞子の検出のための産業や医療への応用につながっています、粉乳19で例えば。
ここで紹介するプロトコルは、栄養細胞からの相対細菌内生胞子の（例えば、熱や洗剤など）の有害な物理化学的条件に対する抵抗の差に基づいています。サンプル中の栄養細胞を破壊するために、我々は連続的に熱、リゾチーム及び界面活性剤の低濃度を適用します。これらの治療の時間と強度は胞子を破壊するが、すべての栄養細胞を溶解しないように最適化されています。環境セル・プール内のいくつかの細胞は他のものより耐性があるので、すべての栄養細胞を破壊する可能性を高めるために、我々は、3つの異なる治療法を適用します。この方法の利点および新規性は、処置後の内生胞子はまだ無傷であり、さらなる下流の分析のために使用することができることです。これらは、DNA抽出、定量PCR（定量PCR）、およびアンプリコンまたはメタゲノムシーケンシング（具体的には内生胞子のグループをターゲットとするため、Dを減らすことが含まれますiversity、）カバレッジ向上させながら。内生胞子はまた、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはDPAの検出によって下流培養または定量化のために使用することができます。この方法の重要な特徴は、処理された試料と未処理試料と比較することにより、一つの細胞を栄養に対応する構成要素に加えて、環境試料中の内生胞子の数と多様性を推定することができることです。
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Protocol
化学物質や機器の作製
- 1％のヘキサメタリン酸ナトリウム（SHMP）（のNaPO 3）nは溶液500mlを加えて、オートクレーブで滅菌します。
- 密閉ガラスペトリ皿でオートクレーブ処理により滅菌ニトロセルロース（NC）フィルター（孔径0.22ミクロン、直径47ミリメートル）。
- 密閉ガラスシャーレでオートクレーブによりNCフィルター（孔径0.22ミクロン、直径25ミリメートル）を滅菌します。
- 滅菌50mlチューブ（キャップ付き）（サンプルあたり1チューブ）の空の重量を計量し、注意してください。
- トリスEDTA緩衝液（TE緩衝液）1Xを準備：10 mMトリス（ トリス （ヒドロキシメチル）アミノメタン）および1mM EDTA緩衝液の溶液を作ります。 pHを8に調整し、オートクレーブで滅菌します。
- 1ミリリットルのTE緩衝液中のリゾチーム0.02グラムを溶解することによりリゾチーム溶液（20 mg / mlの）を準備します。理想的には、毎回新鮮にします。わずか1週間4℃で保存してください。
- 8グラム/ Lの塩化ナトリウムを溶解して生理学的溶液を調製します蒸留水に塩化ナトリウム（NaCl）。オートクレーブで滅菌します。
土砂からのバイオマスの2分離
- 予め計量する堆積物試料3gのエタノール燃え上がっ金属スクープを使用して滅菌した50ミリリットルチューブを追加します。汚染を避けるためにきれいな、紫外線滅菌生物学的安全キャビネットの中でこれを実行します。
- ビュレットを卒業し、滅菌を使用したサンプルの1％（オートクレーブ処理）滅菌SHMP溶液15mlを追加します。 SHMP溶液は、汚染を避けるために濾過することができます。
- 液体分散機/ホモジナイザー（例えば、ウルトラタラックスホモジナイザー）と堆積物とSHMP液を均質化します。 70％エタノール、滅菌または使用前に分散ローターオートクレーブ。 17,500 rpmで1分間均質化を実行します。 2分間のサンプル残りをしようと、同じローター速度で1分間均質化を繰り返します。
- サンプルは10分間放置してみましょう。このステップでは、最も重い粒子（ミネラル）が沈降します。細胞サンプルの任意の有機成分がW病気の溶液中に残ります。堆積物ペレットを乱さないように注意しながらその後、清潔な50mlのチューブに（細胞バイオマスを含む）上澄み液を移します。
- 堆積物ペレットに滅菌を使用して再度1％（オートクレーブ処理）滅菌SHMP溶液15mlを加えビュレットを卒業。そして、ステップ2.3と2.4を繰り返します。この繰り返しは、堆積物の鉱物成分から細胞や有機粒子の最大量の分離を保証します。この第二の分離の上清を第一の分離からの上清とマージすることができます。
注意：次の手順は、すべての（細胞バイオマスを含む）上清に行われます。ミネラル成分（堆積物のペレット）を廃棄することができます。 - 1分間20×gでサンプルを遠心。生物細胞材料がまだ溶液中に残っている間このステップでは、小さな鉱物粒子を解決するのに十分な遠心力が増加します。遠心分離した後、へ（細胞バイオマスを含む）上澄み液を移します清潔な50mlのチューブ。ミネラルペレットを捨てます。
- サンプルを計量することにより、バイオマスを含有する溶液の最終容量を決定します。重量決意をメスシリンダーに試料を移送する必要が回避され、汚染の危険性を減少させます。
フィルター膜上のバイオマスの3コレクション
- 濾過ユニット（直径47mm膜用）と真空ポンプを準備します。 70％エタノールでそれを噴霧し、ブンゼンバーナーでそれを炎によって、オートクレーブまたは（パイレックスガラス場合）のいずれか濾過ユニットを滅菌します。それはプロトコルを続行する前に、冷ましてみましょう。
- エタノール燃え上がっ滅菌ピンセットを用いて濾過ユニットに無菌NC膜を追加します。
- 膜濾過ユニットに（ステップ2.6）からの上清サンプルの半分を加え、真空ポンプを用いて膜上の細胞を収集します。
- 液体が完全にフィルタを通過したときに、真空ポンプを停止し、慎重にエタンを用いて膜を除去しますOL-炎が鉗子を滅菌しました。滅菌ペトリ皿に膜を置きます。
- エタノール燃え上がっ滅菌はさみを使用して半分に膜をカットします。独立した2ミリリットルチューブに膜の各半分を追加します。膜の半分は、全細菌群集のDNA抽出および分析のために使用されます。フィルタの他の半分は、-80℃で保存し、バックアップとして機能します。
- 濾過ユニットに新しいNC膜を配置し、真空ポンプを用いて（ステップ2.6から）のサンプル容量の後半からのバイオマスを収集します。
- 液体が完全にフィルターを通過した場合には、真空ポンプを停止し、慎重にエタノール燃え上がっ滅菌ピンセットを用いて膜を除去します。独立した2ミリリットルチューブに膜全体を置きます。このサンプルは、栄養細胞からの内生胞子を分離するために治療のために使用されます。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
栄養細胞の溶解4.
- 実行治療は、以前にNC膜（ステップ3.6）に収集されたバイオマスに栄養細胞から内生胞子を分離します。
- 膜が凍結した場合は、解凍し、室温で10分間そのままにしておきます。その後、滅菌ペトリ皿に膜を配置し、エタノール - 燃え上がっ滅菌はさみを使用して小片に（約4倍）、それをカット。その後、無菌の2mlチューブにすべてのメンブレンフィルター片を配置します。
- サンプル膜を含むチューブに1×TE（トリスEDTA）バッファー（1.5参照）900μlを添加して、ボルテックスでよく混ぜます。このステップでは、バイオマスは、TEバッファー溶液中に膜から除去されます。
- 10分、80 rpmで65℃のインキュベーター内でチューブを置きます。その後インキュベーターからチューブを取り外し、それを15分間クールダウンしましょう。
- 2 mg / mlの最終濃度に到達するために新たに調製されたリゾチーム（1.5を参照）の100μLを加えます。サンプルは37℃に冷却する前に、これはDEG可能性として、リゾチームを追加しないでください酵素をRADE。
- リゾチームの最適条件は、栄養細胞を溶解し、60分、80 rpmで37℃でサンプルをインキュベートします。
- 溶解が完了した後、3 N水酸化ナトリウム（NaOH）及び6％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）試料溶液の250μLを250μLを加えます。これを追加することにより、サンプル容量を1.5mlに到達し、0.5 N NaOHを最終濃度1％SDSの最終濃度があります。
- 60分、80 rpmで室温で、このミックスをインキュベートします。ベースと洗剤を追加すると、最終的な細胞溶解に役立ちます。内生胞子に害を与えないよう栄養細胞を溶解しながら、これらの界面活性剤の濃度は、最適化されています。
- （パイレックスガラスがあれば）70％エタノールでそれを噴霧し、ブンゼンバーナーでそれを炎オートクレーブ処理により直径25mmの膜を保持している、または滅菌濾過ユニットを準備します。それがクールダウンしましょう。
- エタノール炎滅菌ピンセットを用いて濾過ユニットに0.2μmのNC膜（直径25mm）を配置します。</ LI>
- 膜上にステップ4.7からのサンプルを追加し、真空ポンプを用いて液体をフィルタリングします。液体が通過した場合には、真空ポンプをオフにします。それは、膜上に保持されないように、この段階で、溶解した栄養細胞物質が除去されます。唯一の内生胞子は、メンブレン上に残ります。
- 残留洗剤を洗い流し、真空ポンプを用いて液体をフィルタリングするために滅菌生理溶液2mlを追加します。
- 液体が完全にフィルタ処理した場合には、真空ポンプをオフにします。濾過ユニットの膜を残します。
5. DNアーゼ処理
注：フィルター膜に直接DNase処理を実行します。これは、濾過ユニットが漏れず、真空ポンプがオフにされることが重要です。
- フィルター膜上に直接滅菌水450μlを、DNアーゼ反応緩衝液（1×）、50μlの0.5μlのDNアーゼ酵素を追加し、15分間放置しました。可能な場合は、少し戦争である部屋で、この消化を行います平均室温よりもマー、酵素は、上記の25°Cの温度でうまく動作するので。
注：ブンゼンバーナーを維持することはさておき、濾過ユニットは、温度を上昇させると、無菌環境を維持するという利点を有し、したがって、サンプルの汚染の危険性を減少させました。 - DNase消化が完了したら、サンプルから酵素を除去するために真空ポンプをオンにします。
- 追加および生理溶液1mlをフィルタリングすることにより、残留酵素を洗い流します。
- 液体が完全に通過した場合には、真空ポンプの電源をオフにし、滅菌ピンセットを用いて内生胞子を含むフィルター膜を除去し、滅菌ペトリ皿にそれを置きます。
注：分離内生胞子のサンプルは現在、下流の分析のための準備ができています。発芽および栽培に使用した場合、-20℃で保存は、DNA抽出のためにまたは代替的に、4℃で使用した場合。
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Representative Results
ここに示された結果は、以前の10,21公開されています。データの環境解釈と議論のためにそれらの記事を参照してください。
全体的な手順を図1にまとめ、三つの主要なステップに対応されます。最初、堆積物からのバイオマスの分離または他の環境マトリックス;第二に、栄養細胞の破壊;そして第三に、分離内生胞子の下流分析。下流の分析は、例えば、DNA抽出及び多様性を決定するために、アンプリコンの配列決定により、構成することができ。 DNA抽出は、内生胞子の溶解を保証するように最適化する必要があります。堆積物の試料では、強力なシーケンシャルDNA抽出法10を用いてこれを達成しています。堆積物中の方法の適用は、分離後の内生胞子形成ファーミキューテスの割合の有意な増加を示しています。 16S rRNAのアンプリコン配列決定における遺伝子、未処理試料中のファーミキューテス（コミュニティ全体が）のみに8.0とシーケンスの19.0パーセント（ 表1）を対応しました。これとは対照的に、治療後にファーミキューテスは90.6パーセントと内生胞子が豊富なサンプルの83.9パーセントを占めています。内生胞子形成ファーミキューテス、BacillialesとClostridiales 2つの主な注文は、非内生胞子形成ファーミキューテスあるLactobacillialesような注文をしない場合と対照的な、この方法で濃縮しました。この方法は、真の内生胞子の濃縮のために特に適していることを実証するために、胞子のような構造を生成することができる他の基は、分析しました。したがって、放線菌、シアノバクテリアおよびMyxococcalesの頻度は細胞を溶解するために治療後に減少しました。
治療の効率は、純粋な培養物を使用して実証されました。 パエニバチルスalvei、枯草菌およびバチルス・メガテリウムの内生胞子製剤（> 95％の内生胞子） 大腸菌の栄養細胞培養栄養細胞を溶解するためのプロトコルに記載のように、処理しました。すべての培養物を、次いで、37℃で栄養ブロス中でインキュベートし、成長は600 nmの波長での光学密度を測定しました。全く成長を治療E.で観察されなかった成長が内生胞子の培養物について観察されました大腸菌の培養、その栄養細胞が不可逆的に損傷されている証明（ 図2）。
実験手順の図1.概要。手順は、環境試料中の内生胞子形成細菌を豊かにするために使用されます。環境マトリックスから細胞及び内生胞子を分離する工程は、試料の種類（ すなわち、試料水）に応じて省略することができます。図では、下流の方法は胞子濃縮画分のカレに適用しますDNA抽出およびハイスループットシークエンシングに、それに相当。これらのステップは、培養で置き換えることができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
純粋培養の治療図 2.検証。 枯草菌、 バチルス・メガテリウム、およびパエニバチルスalveiと溶解するための方法で処理された大腸菌の細胞培養物の内生胞子の懸濁液から内生胞子形成細菌の成長を確認する成長曲線細胞の。 =○処理しました。未処理=●。三つの独立した培養物からのエラーバー。対照培養物と処理した培養物の再成長の成長は、600nmの波長での光学密度として測定しました。この図は、F、再印刷されていますROM Wunderlin ら 2014権限を持つ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 土砂1 | 土砂2 | |||
| 地域社会全体 | 内生胞子に富みます | 地域社会全体 | 内生胞子に富みます | |
| ファーミキューテス | 8.0 | 90.6 | 19.0 | 83.9 |
| 桿菌 | 0.5 | 10.0 | 5.7 | 15.1 |
| クロストリジウム | 7.4 | 76.9 | 12.5 | 63.2 |
| 放線菌 | 2.4 | 1.0 | 4.4 | 2.1 |
| 藍色細菌 | 1.1 | 0.1 | 0.7 | 0.1 |
| Myxococcales | 0.7 | 0.0 | 0.2 | 0.0 |
| 他の細菌 | 87.8 | 8.3 | 75.7 | 13.9 |
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Discussion
外部積極的な物理化学的要因（例えば、温度や洗剤）の内生胞子の抵抗は環境試料中の栄養細胞から細菌内生胞子を分離する方法を考案するために使用されました。これは、非破壊的な方法で環境サンプルから内生胞子を単離するための最初の包括的方法です。サンプル中の内生胞子を、定量検出または分析する従来の方法は、ジピコリン酸または特定のマーカー遺伝子として内生胞子のための特定のプロキシの測定に基づいていました。これとは対照的に、ここで紹介するプロトコルで、内生胞子以外の試料成分が除去され、そのように内生胞子は、最終的には、サンプルの唯一かつ精製された名残として残っています。例えば、低温殺菌または密度勾配遠心分離などの他の方法は、内生胞子22を濃縮するために提案されているが、我々のテストでは、密度勾配遠心分離は、環境試料のための一般的な方法としては適切ではないことを示しました生理的差異及び内生胞子形成剤（データは示していない）の様々な種の異なる密度に起因します。対照的に、我々のプロトコルは、容易に環境試料の全てのタイプに適用され、分子的方法または培養などの下流の用途に適していることができます。
プロトコルにおける2つの重要なステップがあります。最初は、サンプルマトリクス（ すなわち、堆積物粒子）からのバイオマスの分離です。それは、多様性の一部を見落とすしないように、マトリックスから分離した細胞の数は、最大化されることが不可欠です。底質試料については、ここで使用されるように、プロトコルの主な制限の一つは、いくつかの細胞または胞子が堆積物マトリックスから切り離されていないため、この方法の潜在的な制限である下流の分析に含まれていないかもしれないという事実があります。試料マトリックスに依存して（例えば、フミン酸が存在する場合）、細胞がしっかりとそれに結合し、解放することが困難な場合があります。ホモジナイザーやブレンダーでオルト - リン酸緩衝液ならびに良好な均質化を使用することは、この段階で重要です。プロトコルで記述されたように、回復を高めるために、均質化及びバイオマスの除去の手順を2回繰り返します。ここで説明されたプロトコルが開発され、淡水湖の堆積物のサンプルのために最適化されています。いくつかのパラメータは、試料の他のタイプのために最適ではないかもしれません。潜在的なプロセスで見落とされたコミュニティの割合を分析する一つの方法は、DNA抽出およびアンプリコン配列決定に土砂行列をかけることです。技術の可能な修飾として、試料マトリックスからのバイオマスの分離工程を省略することができます。環境試料は、下流のプロトコル（例えば、水、その他の液体または精製された培養液）に干渉する可能性有機材料または無機粒子を含んでいない場合は特に、以前の分離が必要とされない場合があります。液体試料のためのプロトコルは、第3章で直接起動することができます（フィルター膜上のバイオマスのコレクション）。
プロトコルの第2の重要なステップは、栄養細胞を破壊するリゾチーム、熱、NaOHおよびSDSを用いた治療です。内生胞子を害することのないように、細胞を破壊しながら、温度、時間などの化学物質の濃度はすべて、最適化されています。これらのパラメータは、したがって、厳密には、彼らがそうであるように維持されるべきです。 65℃で試料を加熱する第1工程の使用は、特に、一般的ではない放線菌、粘液細菌、シアノバクテリアの細菌門の間に発生する細菌胞子または胞子様構造の他のタイプに比べて胞子を選択することは非常に有効でした耐熱性。 表1に見られるように、非胞子形成細菌は、治療（8.3％〜14％）の後に依然として存在しています。このためのいくつかの説明は、堆積物試料は非常に複雑であり、また耐性非芽胞細胞を抱くことができることです。また、残りの有機材料は、特定のαを可能にすることができます治療を生き残るために細胞をttached。さらに、処理されたサンプル中の非胞子形成細胞の割合を減少させるために、この方法は、個々のサンプルのタイプに基づいて最適化されるべきです。
この方法は、環境試料中の内生胞子形成剤の標的に研究のための新たなツールを表します。栄養細胞を破壊する治療法は、細胞および芽胞の純粋培養で試験し、細胞の個々の抵抗に合わせて適合させることができます。細胞の破壊は 、図2に示す処理した培養物の曲線に見ることができる。処理した培養物の成長遅延が原因で内生胞子を再発芽及び指数増殖期に移行する必要がある時間であることができます。この遅延のための他の可能な説明は、治療後の内生胞子培養またはより低い細胞数の弱体化である可能性があります。分離した内生胞子は、DNA抽出のために使用されていない場合には、DNase処理の最後の工程を省略することができます。
NT ">この技術の将来の応用が病原性内生胞子を検出する必要がある産業で考えることができる。一例では、ここで栄養細胞の検出および分析（識別用）内生胞子を、その分化、食品産業及び臨床研究であります（例えば、ミルクまたはミルクベースの製品などの食品製品から）非常に重要です。これは、多くの標準的な手順は、このようになります胞子を溶解するようになっていない溶菌酵素を用いてサンプルから直接DNA抽出を、検討することを考慮すると、関連する特定のかもしれませんここに提示された方法では、細胞を除去することができる細胞とは対照的に、その後の分析は、内生胞子の存在下または非存在下に答えを提供する。見落とされる。他のアプリケーションは、異なる環境試料（例えば、氷または堆積物コアに内生胞子コミュニティの分析を含みます）環境条件の歴史的なアーカイブであること。比較的安定environmenと多くの環境でタル条件は、（例えば、湖の堆積物表面のため）内生胞子形成ファーミキューテスは栄養細胞の形で繁栄することができます。条件は（沈殿物の埋葬または嫌気的条件への移行時に栄養枯渇などによって）劣化すると細胞が内生胞子状態に移行。したがって、堆積物のコアから取り出した内生胞子コミュニティは埋葬時の環境条件を反映することができ、したがって、前の埋葬の条件の古生態指標として使用することができます。しかし、我々はまだこの主張をサポートするための情報を収集しています。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、助成金番号31003A-1分の132358、31003A_152972および第151948スイス国立科学財団を承認し、Fundationピエール・メルシエはラ・サイエンスを注ぎます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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