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Biology

प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए Mitochondrial स्थानीयकरण और एक परमाणु कोशिका चक्र kinase, Cdk1 के फंक्शन

Published: February 25, 2016 doi: 10.3791/53417
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Radiation Oncology, University of California, Davis

Introduction

स्तनधारियों में, कोशिका चक्र प्रगति cyclins और cyclin निर्भर kinases (Cdks) 1 द्वारा नियंत्रित उच्च आदेश दिया की घटनाओं पर निर्भर है। इसकी cytoplasmic, परमाणु, और centrosomal स्थानीयकरण के माध्यम से, CyclinB1 / Cdk1 इस तरह के परमाणु लिफाफा टूटने और केंद्रपिंड जुदाई 2 के रूप में बँटवारा में अलग अलग घटनाओं सिंक्रनाइज़ करने में सक्षम है। CyclinB1 / Cdk1 apoptosis 3 के खिलाफ mitotic कोशिकाओं की रक्षा करता है और mitochondrial विखंडन, नवगठित बेटी कोशिकाओं से 4 माइटोकॉन्ड्रिया की एक समान वितरण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम को बढ़ावा देता है।

स्तनधारी कोशिकाओं proliferating में, mitochondrial एटीपी आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) मशीनरी (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला) है, जो 5 बहु सबयूनिट परिसरों से बना है के माध्यम से उत्पन्न होता है; जटिल मैं - जटिल वी (सीआई-सीवी)। निकोटिनामाइड अडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NADH): ubiquinone oxidoreductase या जटिल मैं (सीआई) के सबसे बड़े और कम से कम पांच परिसरों 5 की समझ में आ रहा है। जटिल ग45 सब यूनिटों, जिनमें से 14 की onsists उत्प्रेरक मूल रूप में। एक बार इकट्ठे, जटिल एक हाथ मैट्रिक्स और दूसरे हाथ भीतरी झिल्ली 6.7 में एम्बेडेड में फैला हुआ है के साथ एक एल के आकार का संरचना मान लिया गया है। सीआई सब यूनिटों में म्यूटेशन mitochondrial विकारों 8 की एक किस्म के कारण हैं। OXPHOS में एक कार्यात्मक कुशल सीआई न केवल समग्र mitochondrial श्वसन 9 के लिए, लेकिन यह भी सफल सेल चक्र प्रगति 10 के लिए आवश्यक है। तंत्र इस झिल्ली ही सीमित स्वास्थ्य और रोग में एंजाइम जटिल के कामकाज अंतर्निहित Unravelling उपन्यास नैदानिक ​​प्रक्रियाओं और उन्नत चिकित्सकीय रणनीति के विकास को सक्षम हो सकता है। हाल ही में एक अध्ययन में हमने पाया है कि CyclinB1 / Cdk1 परिसर (गैप) 2 जी 2 / (धोखा) एम चरण में माइटोकॉन्ड्रिया में translocates और सीआई सब यूनिटों phosphorylates mitochondrial ऊर्जा उत्पादन, संभावित बढ़ाने के लिए सेल के दौरान कोशिकाओं की वृद्धि की ऊर्जा जरूरतों को ऑफसेट करने के लिए 11 चक्र। यहाँ हम थानेदारप्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और रणनीति है कि अन्यथा परमाणु / cytoplasmic kinases की mitochondrial translocation अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके mitochondrial substrates के रूप में अच्छी तरह से उनके mitochondrial स्थानीयकरण CyclinB1 / Cdk1 एक उदाहरण के रूप में प्रयोग के कार्यात्मक परिणामों wcase।

लग रहा है कि CyclinB1 / Cdk1 जटिल जब जरूरत माइटोकॉन्ड्रिया विशेष overexpression और इस परिसर के पछाड़ना के अध्ययन के लिए प्रेरित किया माइटोकॉन्ड्रिया में translocates। प्रोटीन के माइटोकॉन्ड्रिया विशिष्ट अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए, एक ब्याज की प्रोटीन के एन टर्मिनस में माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना अनुक्रम (एमटीएस) जोड़ सकते हैं। लक्षित कर दृश्यों माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रिया जहां वे सामान्य रूप से रहते हैं 12 में mitochondrial प्रोटीन की छँटाई अनुमति देते हैं। हम एक 87 आधार माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना मानव साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट 8A (COX8) के अग्रदूत से निकाली गई अनुक्रम का इस्तेमाल किया और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) में यह क्लोन है CyclinB1 या लाल फ्लोरोसेंट -taggedप्रोटीन (आरएफपी) -tagged Cdk1 फ्रेम में plasmids हैं। इस विधि हमें माइटोकॉन्ड्रिया में CyclinB1 और Cdk1 निशाना बनाने की अनुमति दी है, विशेष रूप से उनके परमाणु पूल को प्रभावित किए बिना इन प्रोटीनों की mitochondrial अभिव्यक्ति बदल रहा है। fluorescently इन प्रोटीनों टैग करके, हम वास्तविक समय में अपने स्थानीयकरण निगरानी करने में सक्षम थे। इसी तरह, हम जो हमें विशेष रूप से mitochondrial अभिव्यक्ति और Cdk1 के कार्यों नीचे दस्तक करने की अनुमति एक प्लाज्मिड आरएफपी टैग प्रमुख नकारात्मक Cdk1 युक्त, एमटीएस में पेश किया है। यह kinases Cdk1 तरह दोहरी localizations है कि mitochondrial और परमाणु कार्यों के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। इन दोहरी कार्यात्मक kinases के एन टर्मिनल में इंजीनियरिंग एमटीएस एक महान रणनीति नियोजित किया जा करने के लिए आसान और प्रभावी है कि प्रदान करता है।

चूंकि Cdk1 एक कोशिका चक्र काइनेज है, यह कोशिका चक्र प्रगति का निर्धारण करने के लिए जब Cdk1 माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीय है मौलिक है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम एक नई metho का उपयोग किया हैडी कोशिकाओं में डीएनए सामग्री की निगरानी करने के लिए। पारंपरिक तरीकों thymidine स्थानापन्न करने के लिए BrdU (bromodeoxyuridine), एक सिंथेटिक thymidine एनालॉग, जो कोशिका चक्र के एस चरण के दौरान नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया गया है का उपयोग शामिल है। तब कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से उनके डीएनए को दोहरा रहे हैं विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। इस पद्धति का एक नुकसान यह है कि यह डीएनए के विकृतीकरण की आवश्यकता है एसिड या गर्मी उपचार की तरह कठोर तरीके हैं, जो परिणामों 13,14 के बीच विसंगति में हो सकता है द्वारा BrdU एंटीबॉडी के लिए पहुँच प्रदान करना है। वैकल्पिक रूप से, हम एक समान दृष्टिकोण एक अलग thymidine अनुरूप, edu के साथ सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं की निगरानी के लिए उपयोग किया। Edu का पता लगाने के लिए कठोर डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है के रूप में हल्के साबुन उपचार नए संश्लेषित डीएनए में edu उपयोग करने के लिए पता लगाने अभिकर्मक सक्षम बनाता है। Edu विधि, और अधिक विश्वसनीय सुसंगत और उच्च throughput विश्लेषण 15 के लिए क्षमता के साथ साबित हो गया है।

अंत में, टीओ निर्धारित Cdk1 की mitochondrial substrates, हम शास्त्रीय दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन का एक उन्नत संस्करण है जो 2 डी DIGE नामक एक प्रोटिओमिक्स उपकरण का इस्तेमाल किया। दो आयामी वैद्युतकणसंचलन प्रथम आयाम और दूसरे में आणविक वजन में उनकी समविद्युतविभव बिंदु के अनुसार प्रोटीन को अलग करती है। चूंकि इस तरह के रूप में फोस्फोराइलेशन बाद translational संशोधनों समविद्युतविभव बिंदु और प्रोटीन की आणविक वजन को प्रभावित, 2 डी जैल विभिन्न नमूनों के भीतर प्रोटीन की phosphorylation स्थितियों के बीच अंतर का पता लगा सकते हैं। प्रोटीन का आकार (क्षेत्र और तीव्रता) प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के साथ परिवर्तन स्पॉट, कई नमूनों के बीच मात्रात्मक तुलना की इजाजत दी। इस विधि का प्रयोग, हम बनाम उत्परिवर्ती माइटोकांड्रिया-लक्षित Cdk1 व्यक्त कोशिकाओं जंगली प्रकार में फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन को अलग करने में सक्षम थे। विशिष्ट प्रोटीन स्पॉट है कि जंगली प्रकार में दिखाया लेकिन माइटोकांड्रिया-लक्षित उत्परिवर्ती Cdk1 तैयारी में याद कर रहे थे और अलग थेमास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचान की।

पारंपरिक 2 डी जैल में, triphenylmethane रंगों जेल पर प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 2 डी DIGE प्रोटीन electrophoretic गतिशीलता पर कम से कम प्रभाव के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल के उपयोग करता है। विभिन्न प्रोटीन के नमूने विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक, एक साथ मिश्रित और समान जैल से अलग कर दिया, एक भी जेल 16 पर कई नमूने के सह वैद्युतकणसंचलन अनुमति के साथ लेबल किया जा सकता है। इस जेल के लिए जेल विविधताओं, जो जेल आधारित प्रोटिओमिक्स अध्ययन में एक महत्वपूर्ण समस्या है कम करता है।

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Protocol

संवर्धित कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया के 1. अलगाव

  1. के लिए कोशिकाओं (आईबीसी) बफर अलगाव बफर की तैयारी
    1. तैयार 0.1 एम Tris / MOPS (Tris (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (एन -morpholino) propanesulfonic एसिड): आसुत जल के 800 मिलीलीटर में Tris के 12.1 ग्राम भंग, MOPS पाउडर का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित, कुल करने के लिए आसुत जल जोड़ने 4 ओ सी पर 1 एल और दुकान की मात्रा
    2. 0.1 एम EGTA (इथाइलीन ग्लाइकॉल बीआईएस (2-aminoethyl ईथर) tetraacetic एसिड) तैयार / Tris: आसुत जल के 800 मिलीलीटर में EGTA के 38.1 ग्राम भंग, Tris पाउडर का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित, 1 एल की कुल मात्रा के लिए आसुत जल जोड़ने और 4 ओ सी पर दुकान
    3. तैयार 1 एम सुक्रोज: आसुत जल की 100 मिलीलीटर में सुक्रोज की 34.23 ग्राम भंग, ओ सी -20 में 20 मिलीलीटर aliquots, और दुकान बनाने
    4. सी बफर 20 मिलीलीटर 0.1 एम EGTA / Tris के 1 मिलीलीटर 10 0.1 एम Tris / mops के मिलीग्राम और जोड़कर आईबी की 100 मिलीलीटर की तैयारी: आईबी सी बफर तैयार; 1 एम सुक्रोज की। 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए आसुत पानी जोड़ें। 7.4 पीएच को समायोजित करें।
  2. सेल बफर की तैयारी
    1. सेल 20 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.5), 150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA (ईथीलीन diamino tetraacetic एसिड), 1 मिमी EGTA युक्त बफर तैयार, 1% ट्राइटन X-100, 2.5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट, 1 मिमी β- glycerophosphate, 1 मिमी सोडियम orthovanadate। proteinase अवरोधकों 1 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin और 1 मिमी PMSF (phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड) सही उपयोग करने से पहले जोड़े।
  3. माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव
    1. हार्वेस्ट 3 एक्स 10 7 ठंडा 1x पीबीएस (फॉस्फेट खारा बफर) के साथ कोशिकाओं, 10 मिनट के लिए 600 XG पर पीएच 7.4 और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं 4 ओ सी पर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 मिलीलीटर ठंडा आईबी सी बफर में गोली फिर से निलंबित।
    2. लगभग 10 मिनट के लिए एक ग्लास / ग्लास ऊतक बनाने की मशीन का उपयोग कोशिकाओं Homogenize। 10 मील के लिए 600 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज homogenate स्थानांतरण4 ओ सी पर n कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया के लिए, ग्लास / Teflon युग्मन उपयोग के रूप में यह कम ग्लास / ग्लास ऊतक चक्की से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए हानिकारक है।
    3. 4 ओ सी पर 10 मिनट के लिए 7000 XG पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला और सेंट्रीफ्यूज लीजिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और cytosol प्रोटीन के रूप में बचाने के लिए।
    4. 4 ओ सी पर 10 मिनट के लिए 7000 XG पर गोली (माइटोकॉन्ड्रिया) 200 μl ठंडा आईबी सी बफर और सेंट्रीफ्यूज साथ दो बार धोने
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेल बफर में गोली फिर से निलंबित और इसे तुरंत का उपयोग करें या भविष्य में उपयोग के लिए -80 ओ सेल्सियस पर स्टोर। अगर कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया की जरूरत है, सतह पर तैरनेवाला discarding के बाद शेष बफर में गोली फिर से निलंबित। mitochondrial अंश आगे गिराए माइटोकॉन्ड्रिया के समारोह का नुकसान हो सकता है। बर्फ पर दुकान और 1 में तैयारी का उपयोग - 3 अच्छे परिणाम के लिए मानव संसाधन।
    6. एक में तीस 3-सेकंड फटने के लिए resuspended गोली Sonicateबर्फ स्नान, 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र, और mitochondrial अंश के रूप में सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।

Cdk1, CyclinB1 और COXIV, एक mitochondrial निवासी प्रोटीन की 2. सह-immunostaining

  1. 24 अच्छी तरह प्लेटें हे / एन या अप करने के लिए 70% संगम में coverslips पर 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं को विकसित। मध्यम Aspirate और 500 μl ठंडा 1 एक्स पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें।
  2. 500 μl ठंडा 4% 10 मिनट के लिए आरटी पर paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फिक्सिंग समाधान Aspirate और साथ 500 μl 1 एक्स पीबीएस 3 बार, 5 मिनट के झटकों कोमल आरटी पर प्रत्येक के साथ कोशिकाओं धो लें।
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के 500 μl में 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं Permeabilize। समाधान Aspirate और 500 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक धो लें। अवरुद्ध समाधान जोड़ें (500 μl, पीबीएस 1% बीच 20 से युक्त में 1% बीएसए (गोजातीय सीरम albumin)) आरटी पर 30 मिनट के लिए।
  4. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी 1: 250 (वी वी) 500 में1; वांछित प्राथमिक विभिन्न प्रजातियों में उठाया एंटीबॉडी के साथ समाधान को रोकने और कोशिकाओं सेते पार सिगनल से बचने के लिए एल (CyclinB1 (माउस) और COXIV (खरगोश) या Cdk1 (माउस) और COXIV (खरगोश) 30 के लिए आरटी पर - 60 मिनट या हे / एन ओ सी 4 पर
  5. के 1 एक्स पीबीएस 3 बार 500 μl, 5 मिनट प्रत्येक के साथ coverslips धो लें और फिर 1 पतला एंटीबॉडी के साथ सेते: 500 μl से धोने पीबीएस 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक के द्वारा पीछा 1 घंटे के लिए आरटी पर अवरुद्ध समाधान 500 μl में 1,000।
  6. विरोधी फीका बढ़ते समाधान के 20 μl के साथ coverslips माउंट और नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील। छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग सही दूर या स्लाइड 1 के लिए 4 ओ सी पर अंधेरे में रखने के लिए - 2 सप्ताह।

3. सोडियम कार्बोनेट बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया की निकासी

  1. खंड 1. फूट डालो mitochondrial वर्णित के रूप में लगभग 20 x 10 7 कोशिकाओं को विकसित, फसल, पीबीएस के साथ एक बार धोने और माइटोकॉन्ड्रिया को अलग दो बराबर में आइसोलेट्सपिछले centrifugation (कदम 1.3.4 से पहले) माइटोकॉन्ड्रिया गोली से पहले टीएस; बचाने के लिए आधा कुल माइटोकांड्रिया (3.2 कदम) के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, (निम्न कदम 3.3-3.6) घुलनशील और झिल्ली बाध्य प्रोटीन को अलग करने के लिए सोडियम कार्बोनेट निकासी के लिए दूसरे आधे का उपयोग करें।
  2. Lyse कुल माइटोकॉन्ड्रिया सेल बफर के 30 μl के साथ गोली और -80 ओ सी में lysate स्टोर तक immunoblotting में इस्तेमाल किया।
  3. Mitochondrial गोली के अन्य आधा करने के लिए, 0.1 एम ना 2 3 सीओ (सोडियम कार्बोनेट), पीएच 11.0 के 250 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  4. 100,000 20 मिनट के लिए XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और कदम करने के लिए 3.5 आगे बढ़ें। Lyse गोली कदम 1.3.6 के रूप में सेल बफर और sonicate के 30 μl का उपयोग कर। -80 ओ सेल्सियस पर स्टोर तक immunoblotting में इस्तेमाल किया।
  5. 20% ताजा बना Trichloroacetic एसिड (टीसीए) के एक बराबर मात्रा सतह पर तैरनेवाला में जोड़े प्रोटीन वेग और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए।
  6. Centrif10 मिनट के लिए 15,000 XG पर uge। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, जब तक immunoblotting में इस्तेमाल -80 ओ सी में सेल बफर और दुकान के 80 μl में गोली भंग।

4. माइटोकॉन्ड्रिया के भीतरी और बाहरी झिल्ली (Mitoplasts के अलगाव) के पृथक्करण

  1. , लगभग 20 x 10 7 कोशिकाओं, फसल बढ़ने पीबीएस के साथ एक बार धोने और पिछले centrifugation (कदम 1.3.4 से पहले) माइटोकॉन्ड्रिया गोली से पहले 10 बराबर भागों में खंड में वर्णित 1. अलग mitochondrial भिन्न के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया अलग।
  2. hypotonic सुक्रोज बफर के संकेत एकाग्रता के 30 μl में प्रत्येक गोली भंग (1 मिमी EDTA, 10 मिमी MOPS / Koh (पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड), पीएच 7.2, सूक्रोज एकाग्रता से लेकर 25 - 200 मिमी) के साथ या बिना 50 ग्राम / एमएल trypsin ( 1 टेबल देखें) और बर्फ पर 30 मिनट सेते हैं।
  3. शीशियों युक्त टी को रोकने के लिए trypsin (1 मिमी PMSF के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए) 10 मिमी PMSF के 3 μl जोड़ेवह पाचन trypsin और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  4. 10 मिनट के लिए 4 ओ सी में 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र। -80 में एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, कदम 1.3.6 के रूप में सेल बफर, sonicate के 30 μl में गोली lyse, और ओ सी दुकान

5. का निर्माण माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित GFP / आरएफपी टैग CyclinB1 / Cdk1 वैक्टर और उनके Mitochondrial स्थानीयकरण की पुष्टि

  1. pEGFP-एन 1 या pERFP की NheI और BamHI स्थलों पर GFP के एन टर्मिनस या आरएफपी में फ्रेम में -; (161 न्यूक्लियोटाइड के बीच) मानव साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट 8A (COX8 के अग्रदूत से निकाली गई 76 लाख टन) को निशाना अनुक्रम माइटोकॉन्ड्रिया क्लोन -N1 वैक्टर मानक आणविक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग कर।
  2. जब CyclinB1 और Cdk1 जीनों के लिए पीसीआर प्राइमरों डिजाइनिंग, पीसीआर प्राइमरों के '5 को BamHI प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइटों (बोल्ड) जोड़ें।
    फॉरवर्ड Cdk1 BamH15 'कैग टी जी जी एटीसी सी एए TGG आग एटीटी अता सीसीए एएए टी
    रिवर्स Cdk1 BamH1 5 'CTG टी जी जी एटीसी सी टीजी कैट सीटीटी सीटीटी AAT CTG एटीटी
    फॉरवर्ड CyclinB1 BamH1 5 'अता TGG ​​एटीसी CAA TGG CGC टीसीसी भूमिकाः टीसीए
    रिवर्स CyclinB1 BamH1 5 'अता TGG ​​एटीसी CTG सीएसी सीटीटी टी जी सी सी सीएसी एजीसी
  3. मानक तकनीक निम्नलिखित इन प्राइमरों का उपयोग Cdk1 और CyclinB1 जीन बढ़ाना। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर BamHI प्रतिबंध एंजाइम की 1 μl के साथ पीसीआर उत्पादों डाइजेस्ट। एक 1% agarose जेल पर पाचन उत्पादों चलाएँ। एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, सही आकार के डीएनए टुकड़े बाहर कटौती और जेल एक जेल निकासी किट का उपयोग करने से डीएनए शुद्ध।
  4. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर MTS-pEGFP-N1 और BamHI एंजाइम की 1 μl के साथ टन-pERFP-N1 plasmids के 1 माइक्रोग्राम डाइजेस्ट। बछड़ा-Intes के 1 μl जोड़े37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए tinal alkaline फॉस्फेट (सीआईपी)। एक 1% agarose जेल पर पाचन उत्पादों चलाने के लिए और 5.3 चरण में के रूप में जेल से रेखीय plasmids शुद्ध।
  5. 5.3-3 DH 2 ओ की 20.5 μl ligase बफर के μl, टी -4 ligase के 0.5 μl, और कदम 5.4 और कदम से Cdk1 या CyclinB1 के 5 μl से प्लाज्मिड की 1 μl जोड़कर एक बंधाव प्रतिक्रिया सेट अप 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  6. 10 मिलीग्राम पर मानक तकनीक निम्नलिखित बंधाव मिश्रण के 10 μL के साथ सक्षम कोशिकाओं को बदलने कोलाई DH5α और बढ़ने बैक्टीरिया / एमएल केनामाइसिन युक्त लेग अगर प्लेटों हे / एन 37 डिग्री सेल्सियस पर कालोनियों प्राप्त करने के लिए।
  7. हे से एक कॉलोनी उठाओ / एन बढ़ी एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग प्लेटें, ट्यूब केनामाइसिन-लेग युक्त एक 5 मिलीलीटर में टिप डालने और सेते हे / एन। प्लाज्मिड निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार miniprep किट का उपयोग अलग है, और मानक तकनीक का उपयोग कर प्लाज्मिड अनुक्रम।
  8. Transfect तेजी से बढ़ रही MCF10A कोशिकाओं (1.5 x 10 4 कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त) चरण में 5.7 से टन-टन-Cdk1 आरएफपी या CyclinB1-GFP plasmids के साथ 1 के एक प्लाज्मिड / अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात की तैयारी द्वारा: 2 (डब्ल्यू: वी, 100 एनजी : 0.2 μl) 100 μl सीरम और एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में।
  9. आर्द्रता नियंत्रण (5% सीओ 2, 95% सापेक्ष आर्द्रता) के साथ एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्लाज्मिड / अभिकर्मक मिश्रण में कोशिकाओं को सेते हैं।
  10. DMSO के 100 μl में पाउडर की 50 ग्राम भंग द्वारा mitochondrial लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट रंगों के 1 मिमी स्टॉक समाधान तैयार है। 2.5 माइक्रोन के समाधान के लिए काम कर प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस में 400: स्टॉक समाधान 1 पतला। शेयर समाधान के लिए एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  11. संस्कृति के माध्यम से 98 μl के साथ लाल रंग का 2.5 माइक्रोन की 2 μl मिक्स एक 50 एनएम अंतिम एकाग्रता तैयार करने के लिए।
  12. लाल रंग 2 मिनट के लिए मध्यम युक्त साथ CyclinB1-GFP असर MCF10A कोशिकाओं (5.8 कदम में उत्पन्न) के सेल संस्कृति के माध्यम से बदलें। दोहराएँCdk1 आरएफपी असर MCF10A कोशिकाओं के लिए हरे रंग के साथ एक ही प्रक्रिया।
  13. अतिरिक्त धुंधला समाधान से छुटकारा पाने के लिए, 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए पीबीएस 1x 100 μl जोड़ने के 100 μl 1 एक्स पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  14. और Cdk1 आरएफपी (560 एनएम और 565 पर उत्सर्जन की उत्तेजना - 620 एनएम) 40X बढ़ाई फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर - माइटोकॉन्ड्रिया और CyclinB1-GFP (536 एनएम 494 पर 488 एनएम और उत्सर्जन से उत्तेजना) कल्पना।

2 डी DIGE के माध्यम से विभिन्न फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की पहचान 6.

  1. नमूना तैयार करना
    1. माइटोकॉन्ड्रिया अलग करने और 1.3 चरण में के रूप में mitochondrial अंशों lyse। प्रत्येक नमूना और 15 सेकंड के लिए भंवर करने के लिए 20% टीसीए (पानी में Trichloroacetic एसिड) की एक समान मात्रा में जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते के रूप में प्रोटीन समाधान से बाहर वेग।
    2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 9,300 XG, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 60 μl ठंड एसीटोन (100%) जोड़ने के द्वारा पीछा किया पर अपकेंद्रित्र नमूने5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 9,300 XG पर centrifugation।
    3. एसीटोन धोने कदम (चरण 6.1.2) एक बार और दोहराएँ, तैरनेवाला निकालें और 50 μl DIGE लेबलिंग बफर (7 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 4% CHAPS, 30 मिमी Tris, पीएच 8.5) में नमूने फिर से निलंबित।
  2. फ्लोरोसेंट रंजक तैयार
    1. शेयर समाधान तैयार: 1 nmol / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए नए सिरे से डाइमिथाइल formamide (DMF) के 5 μl में रंगों (5 nmol) भंग। कुछ महीनों के लिए उपयोग करें जब तक -20 ओ सी पर शेयर डाई समाधान स्टोर।
    2. काम कर समाधान तैयार: रंगों 5 मिनट के लिए आरटी पर स्थापित करने के लिए अनुमति दें। 200 pmol / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए DMF के 4 μl के साथ डाई की 1 μl पतला। प्रयोग के दौरान बर्फ पर रखें। नोट: 3 सप्ताह के लिए काम कर समाधान -20 ओ सी में रखा जा सकता है।
  3. लेबल प्रोटीन
    1. प्रति 12.5 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन डाई समाधान काम करने की 1 μl मिक्स। अप पैमाने के रूप में की जरूरत है। जमा मानकों के लिए, 6 जोड़ने1; जमा प्रोटीन 300 माइक्रोग्राम को Cy2 काम समाधान के एल।
    2. 12,000 एक्स जी 30 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर। 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं। इस्तेमाल किया काम कर समाधान के 1 μl प्रति 10 मिमी लाइसिन की 1 μl जोड़कर लेबलिंग बंद करो। अच्छी तरह मिक्स और 10 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं।
    3. पूल व्यक्तिगत रूप से नमूने लेबल और पुनर्जलीकरण बफर (7 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 4% CHAPS, 1.2% destreak, 1% pharmalytes, bromophenol नीला) के साथ मिश्रण। कुल मात्रा 125 μl होगा।
    4. 30 सेकंड के लिए भंवर नमूने और नमूने 30 मिनट के लिए आरटी पर स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं। लोड 7 सेमी पीएच 4 पर नमूने के 125 μl - 9, समविद्युतविभव ध्यान केंद्रित (IEF) स्ट्रिप्स।
  4. प्रथम आयाम वैद्युतकणसंचलन
    1. पट्टी धारकों (ताबूतों) इलेक्ट्रोड प्लेट पर रखें, यकीन है कि पट्टी धारकों पूरी तरह से साफ और शुष्क हैं बना रही है। एक ताबूत में 125 μl नमूने पिपेट, पूरे ताबूत भर में समान रूप से फैल गया।
    2. tweeze का प्रयोगरुपये IEF पट्टी उठाओ, ध्यान से प्लास्टिक सुरक्षा कवर को हटाने, और यह (नीचे जेल पक्ष) ताबूत / पुनर्जलीकरण बफर में जगह है। हवा के बुलबुले फँसाने से बचें। धीरे-धीरे ताबूत को भरने - खनिज तेल के साथ (1 1.5 मिलीलीटर) और जगह ताबूत ताबूतों पर शामिल किया गया है।
    3. तालिका 2 में प्रोटोकॉल के बाद ध्यान केंद्रित समविद्युतविभव शुरू:
      नोट: एक बार रन पूरा हो गया है, स्ट्रिप्स -80 ओ सी में प्लास्टिक ट्यूब में संग्रहित किया जा सकता है या सीधे संतुलन और दूसरा आयाम पर चले गए।
  5. दूसरा आयाम - सोडियम dodecyl सल्फेट-जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ)
    1. संतुलन
      1. एसडीएस संतुलन बफर (पट्टी प्रति 8 मिलीलीटर, 6 एम यूरिया, 30% ग्लिसरॉल, 2% एसडीएस) पिघलना। dithiothreitol वजन (डीटीटी, एसडीएस संतुलन बफर के 1 मिलीलीटर प्रति 10 मिलीग्राम डीटीटी)। 4 मिलीलीटर एसडीएस संतुलन बफर में डीटीटी भंग।
      2. वजन आई ए ए (iodoacetamide, 25 एसडीएस संतुलन बफर के 1 मिलीलीटर प्रति मिलीग्राम आई ए ए)।4 मिलीलीटर एसडीएस संतुलन बफर में आई ए ए भंग।
      3. बाद में उपयोग के लिए एक पानी के स्नान में agarose समाधान सीलिंग 1 मिलीलीटर पिघला।
      4. अगर स्ट्रिप्स जमे हुए थे, उन्हें पूरी तरह से पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। प्लेस reswelling ट्रे में ऊपर की ओर जेल स्ट्रिप्स। प्रत्येक पट्टी करने के लिए डीटीटी के साथ एसडीएस संतुलन बफर के 4 मिलीलीटर जोड़ें और कोमल झटकों के साथ 15 मिनट के लिए सेते हैं।
      5. डीटीटी के साथ सभी एसडीएस संतुलन बफर डालो। प्रत्येक पट्टी करने के लिए आई ए ए के साथ एसडीएस संतुलन बफर के 4 मिलीलीटर जोड़ें और कोमल झटकों के साथ एक और 15 मिनट के लिए सेते हैं। आई ए ए बफर के साथ संतुलन के बाद, एसडीएस संतुलन बफर के डालना।
    2. एसडीएस पृष्ठ
      1. मिनी जैल खोलना, कंघी को हटाने और जेल और DDH 2 ओ के साथ कुओं कुल्ला जेल के नीचे सफेद टेप निकालें चलाने से पहले। सही तरीके से जेल पर पट्टी ओरिएंट, जेल उन्मुखीकरण मौके काटने के लिए महत्वपूर्ण है।
      2. छोटी प्लेट ऊपर और जेल शीर्ष सामना करना पड़ ई के साथ काउंटर पर जेल फ्लैट जगहxperimenter। anodic अंत के साथ लंबा थाली पर पट्टी रखना (++ बारकोड के साथ समाप्त) जेल के बाईं ओर का सामना करना पड़। एक शासक का उपयोग करना, धीरे-धीरे जेल सतह पर नीचे पट्टी धक्का। पट्टी और जेल के बीच हवा के बुलबुले फँसाने से बचें। एक गिलास प्लेट स्टैंड में जेल खड़े हो जाओ।
      3. कैसेट के उद्घाटन के लिए गर्म सील agarose समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। सुनिश्चित करें कि सभी हवाई बुलबुले एक फ्लैट शासक का उपयोग कर बाहर दबाया कर रहे हैं। तंत्र को इकट्ठा करने और 90 मिनट के लिए एक निरंतर 125 वी पर जेल चला रहे हैं।
      4. जब जेल पूरा चल रहा है, 2 मिलीलीटर DDH 2 हे के साथ एक biomolecular इमेजर पर जेल जगह है और 635 एनएम उत्तेजना लेजर और 665 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ प्रतिदीप्ति अधिग्रहण मोड में जेल स्कैन।
    3. phosphoprotein धुंधला
      1. 30 मिनट के लिए 50% और 10% मेथनॉल एसिटिक एसिड मिश्रण (10 एमएल) के साथ जेल में दो बार ठीक करें। 10 मिलीलीटर 60 के लिए दाग phosphoprotein के साथ तीन बार और दाग 10 मिनट के लिए पानी की 10 मिलीलीटर के साथ धो - 90 मिनट, द्वारा पीछा30 मिनट में तीन बार के लिए समाधान destain 10 मिलीलीटर के साथ destaining।
      2. 532 एनएम / 560 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन पर एक लेजर स्कैनर जेल के साथ 5 मिनट में दो बार 10 मिलीलीटर पानी से धो लें और छवि जेल।
    4. प्रोटीन के पाचन और पहचान
      1. आबकारी विभिन्न के सभी निर्माता विनिर्देशों के अनुसार एक रोबोट स्पॉट बीनने का उपयोग microplate कुओं में जेल से प्रोटीन स्पॉट व्यक्त की, और जेल टुकड़े destain के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (2 मिलीलीटर) जोड़ें। 2 मिलीलीटर 100% acetonitrile के साथ निर्जलीकरण 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम concentrator में दो बार और सूखी धोने।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में 13 एनजी / μl संशोधित सुअर का trypsin के 100 μl के साथ जेल टुकड़े rehydrate। supernatants लीजिए और आगे 30 मिनट के लिए 50% acetonitrile में 5% trifluoroacetic एसिड के 100 μl के साथ प्रोटीन निकाल सकते हैं।
      3. वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज एकाग्रता से 5 μl करने के लिए नीचे पेप्टाइड्स ध्यान लगाओrator और असिस्टेड लेजर Desorption आयनीकरण मैट्रिक्स के साथ विश्लेषण - उड़ान के समय - मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (MALDI TOF एमएस / एमएस) 17।

7. इन विट्रो Kinase परख में

  1. Substrates की तैयारी
    1. उप-क्लोन परिसर मैं (सीआई) सब यूनिटों (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6, और NDUFA12) है, जो विभिन्न फॉस्फोरिलेटेड Cdk1 लक्ष्य के रूप में पहचाने जाते हैं, pGEX-5X -1 वेक्टर में Glutathione-S-ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) -tagged उत्पन्न करने के लिए बैक्टीरियल अभिव्यक्ति plasmids 11। नीचे प्रोटोकॉल के बाद उच्च आत्मीयता glutathione स्तंभों का उपयोग सीआई सब यूनिटों शुद्ध।
      1. संस्कृति जीएसटी टैग एक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) के 0.6 पहुँच गया था जब तक Luria-Bertani (पौंड) 37 ओ सी में एक प्रकार के बरतन में एम्पीसिलीन के 50 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ शोरबा में कोलाई तनाव बीएल -21 युक्त सीआई सबयूनिट। isopropyl-BD-thio-galactopyranoside (IPTG) पंथ में जोड़े0.1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में Ure, और एक अतिरिक्त 3 घंटे के लिए सेते हैं।
      2. बैक्टीरिया इकट्ठा करने के लिए और 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र में डीटीटी 5 मिमी, 1 एक्स proteinase अवरोध कॉकटेल युक्त 1 एक्स पीबीएस बफर के 5 मिलीलीटर, और 0.1% लाइसोजाइम फिर से निलंबित। Lyse बीस 5 एस फटने के लिए sonication द्वारा कोशिकाओं, और 10 मिनट के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटा दें।
      3. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और 4 के एक मात्रा के अनुपात में glutathione-agarose 4 बी मोतियों के साथ सेते हैं: आरटी पर 1 घंटे के लिए: (मनका सतह पर तैरनेवाला) 1।
      4. glutathione क्षालन बफर के 3 मिलीलीटर के साथ मोतियों से जीएसटी संलयन प्रोटीन Elute डायलिसिस के लिए आणविक झरझरा झिल्ली ट्यूबिंग में (10 मिमी glutathione 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0 में कम) और eluted प्रोटीन विषय (आणविक वजन कट ऑफ 12 -14 kilodaltons) 1 एक्स पीबीएस / 1 मिमी EDTA के साथ। 80 ओ सी - कम से शुद्ध प्रोटीन स्टोर
  2. Cdk1 Kinase परख
    1. काइनेज गधा शुरू करने से पहलेप्र, 30 डिग्री सेल्सियस और 100 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग ब्लॉकों की स्थापना की। पिघलना वाणिज्यिक CyclinB1 / Cdk1 एंजाइम जटिल और बर्फ पर substrates।
    2. बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। चूंकि 32 पी एटीपी आइसोटोप शामिल है, पेंच रेडियोधर्मिता के प्रसार को रोकने के लिए एक हे अंगूठी युक्त टोपी के साथ 1.5 मिलीलीटर नमूना ट्यूबों में सभी प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करते हैं।
      सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री सुरक्षा नियमों का पालन करें। कम से कम एक हाथ की दूरी पर एक 8 मिमी मोटी Plexiglas परिरक्षण और काम का प्रयोग करें। पानी के साथ किसी भी दूषित क्षेत्र के नीचे साफ कर लें।
    3. एक 30 μl प्रतिक्रिया 1 एक्स Cdk1 बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, 10 मिमी MgCl2, 2 मिमी डीटीटी, 1 मिमी EGTA, 0.01% बृज 35, पीएच 7.5), 0.6 मिमी ठंड एटीपी, 0.1 μCi 32 पी एटीपी युक्त बफर तैयार CyclinB1 / Cdk1 की 2 यूनिटों और सब्सट्रेट प्रोटीन के 6 माइक्रोग्राम। DDH 2 ओ के साथ 30 μl के लिए मात्रा समायोजित करें सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए, साथ 0.01 मिमी Histone एच 1, एक प्रसिद्ध CyclinB1 / Cdk1 सब्सट्रेट सब्सट्रेट की जगह।
      1. नकारात्मक विवाद के लिएएल प्रतिक्रियाओं, (1) केवल जीएसटी प्रोटीन और (2) के साथ 0.01 मिमी Histone एच 1 + 0.5 माइक्रोन के RO-3306, एक चयनात्मक Cdk1 अवरोध सब्सट्रेट की जगह के साथ सब्सट्रेट की जगह।
    4. पिपेट और सेंट्रीफ्यूज के साथ अच्छी तरह मिक्स ट्यूब के नीचे सभी तरल लाने के लिए, संक्रमण के जोखिम को कम से कम। 60 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और 10 मिनट के लिए 100 ओ सी में denature के लिए 5x एसडीएस नमूना बफर के 6 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए 160 वी पर 10% एसडीएस पृष्ठ जेल पर चलाने के लिए नमूने, या डाई सामने जब तक जेल के अंत तक पहुँच गया है। एक क्रोमैटोग्राफी कागज पर जेल स्थानांतरण और प्लास्टिक की चादर के साथ रैप।
      सावधानी: radioisotopes के साथ संपर्क में सभी तरल रेडियोधर्मी कचरे के रूप में व्यवहार किया और एक 5 गैलन पाली संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा सेवाओं द्वारा प्रदान की काबोइ में निपटाया जाना चाहिए।
    6. 1 दिन के लिए एक्स-रे फिल्म के लिए जेल बेनकाब या 1 सप्ताह तक -20 ओ रेडियो आइसोटोप की विशिष्ट गतिविधि के आधार पर सी थीऔर एंजाइम।

8. साइट निर्देशित mutagenesis प्रमुख नकारात्मक Cdk1 (D146N) उत्पन्न करने के लिए

  1. डिजाइन म्युटाजेनेसिस प्राइमरों; दो प्राइमरों, एक दूसरे के पूरक, उत्परिवर्ती साइट युक्त (जी एक न्यूक्लियोटाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा के बजाय एन डी एमिनो एसिड के लिए कोड के लिए) प्रत्येक पक्ष 11 पर 20 ठिकानों से घिरे।
  2. एक 50 μl पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) मिश्रण 1x प्रतिक्रिया बफर युक्त, 2.5 मिमी dNTPs, प्राइमरों के 10 माइक्रोन (दोनों आगे और रिवर्स), टेम्पलेट के 40 एनजी, और DDH 2 ओ को तैयार प्रतिक्रिया में डीएनए पोलीमरेज़ के 2.5 यू जोड़ें।
  3. निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएँ: 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट, 68 डिग्री सेल्सियस 6 मिनट; 16 चक्र (नोट: 68 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन समय डीएनए के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है 1 मिनट / केबी 10 केबी ≤ डीएनए के लिए आवश्यक है बड़ा डीएनए, 2 मिनट / केबी से अधिक चक्र के अनुसार 10 सेकंड के लिए।।)। 68 डिग्री सेल्सियस से 7 मिनट का पालन करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।
  4. जोड़नाDPN मैं प्रतिबंध एंजाइम (10 यू / μl) और 5.7 μl DPN मैं बफर के 2 μl, उंगली के साथ कोमल नल के साथ अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए 37 ओ सी पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  5. स्थानांतरण 10 μl DPN मैं इलाज परिवर्तन के लिए DH5α सक्षम कोशिकाओं के 50 μl में पीसीआर उत्पादों। 30 मिनट, 45 सेकंड गर्मी-झटके के बाद 42 ओ सी में और बर्फ पर 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। पौंड के 500 μl जोड़ें और लेग अगर प्लेट पर चढ़ाना पहले 1 घंटे के लिए 37 ओ सी पर हिला। 37 ओ सी पर हे / एन सेते
  6. हे से एक कॉलोनी उठाओ / एन एक बाँझ पीले विंदुक टिप का उपयोग अगर प्लेट बड़े हो गए, एक ट्यूब पौंड की 5 मिलीग्राम से युक्त में टिप छोड़ देता है, और बढ़ने हे / एन ओ सी एक 37 प्रकार के बरतन में। एक miniprep किट का उपयोग प्लाज्मिड अलग करने और प्लाज्मिड अनुक्रम निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उत्परिवर्तन पुष्टि करने के लिए।

Edu निगमन परख के साथ सेल चक्र चरण लंबाई की 9. निर्धारण

  1. सेल छंटनी
    1. transfect संकेत वैक्टर के साथ 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं (MTS-GFP / आरएफपी, टन-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-आरएफपी या MTS-Cdk1-DN-आरएफपी) एक 6 अच्छी तरह से थाली में 1 का उपयोग: 2 (डब्ल्यू: वी 2.5 माइक्रोग्राम: 5 μl) डीएनए के अनुपात: अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण 2.5 मिलीलीटर सीरम और 48 घंटे के लिए एंटीबायोटिक मुक्त संस्कृति मीडिया में तैयार किया। लाइव प्रकार की कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक प्रवाह के माध्यम से GFP टैग Cdk1 और आरएफपी टैग CyclinB1 प्रोटीन व्यक्त।
      1. , 1 एक्स पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें डिश में trypsin के 100 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 ओ सी पर सेते हैं। संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए एक 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें पारित करने के लिए जोड़ें। प्रवाह पर उन्हें लोड करने से पहले पीबीएस (एफसीएस / पीबीएस) में 1% भ्रूण बछड़ा सीरम के 500 μl के साथ एकल कक्ष निलंबन धो लें।
      2. स्थापित प्रोटोकॉल का पालन दोनों GFP और आरएफपी के साथ दाग डबल सकारात्मक कोशिकाओं के लिए 18 gating छँटाई पैरामीटर सेट। हल कोशिकाओं एक ट्यूब contai में कोशिकामापी से बाहर आने लीजिएनिंग सेल संस्कृति के माध्यम से और प्रोटोकॉल में 9.2 के रूप में edu पल्स-चेस लेबलिंग के साथ सेल चक्र प्रगति के विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. सेल चक्र लंबाई edu लेबल से फ्लो परख का उपयोग का मापन
    1. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में अच्छी तरह से प्रति और संस्कृति हे / एन 2.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह प्लेटों में बीज हल कोशिकाओं। 25 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में संस्कृति के माध्यम से edu जोड़ें। 1 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी पर सेते हैं।
    2. 500 μl पीबीएस में 1% BSA के साथ कोशिकाओं को धो लें और 10 के कुल के लिए 2 घंटा के अंतराल पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें इकट्ठा - 12 घंटा।
    3. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 350 XG पर तैरनेवाला त्यागें। फिक्सिंग समाधान (edu लेबलिंग किट के भीतर निर्माता द्वारा प्रदान की) आरटी पर 15 मिनट के लिए के 100 μl जोड़कर गोली हटाना और अच्छी तरह मिलाएँ।
    4. पीबीएस तीन बार में 1% बीएसए के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। ठीक करेंकोशिकाओं को फिर से 4 ओ सी पर 70% इथेनॉल हे / एन के 0.5 मिलीलीटर के साथ
      नोट: इथेनॉल फिक्सिंग पुनः संयोजक टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति की वजह से आंतरिक GFP / आरएफपी प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए महत्वपूर्ण है।
    5. 5 मिनट के लिए 350 XG पर फिर से कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और एक बार पीबीएस में 1 1 मिलीलीटर% BSA के साथ गोली धोने। आरटी पर 20 मिनट के लिए permeabilization बफर (0.1% ट्राइटन X-100, 1% बीएसए, 0.2 मिलीग्राम / एमएल RNase पीबीएस में ए) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    6. एक बार पीबीएस में 1% बीएसए के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। प्रतिक्रिया कॉकटेल के 0.5 एमएल प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
    7. पीबीएस में 1 1 मिलीलीटर% BSA में 1 से 50 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) पीबीएस एक बार में 1% BSA के मिलीलीटर और दाग डीएनए के साथ धो लें।
    8. प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण एडू-सकारात्मक जनसंख्या का पालन करें। डीएनए सामग्री के लिए दाग एडू-लेबल की कोशिकाओं (पीआई धुंधला, एक्स अक्ष) और edu (एलेक्सा 647 धुंधला, वाई अक्ष) के वर्तमान तितर बितर डॉट साजिश है।
      1. एलेक्स के लिए एपीसी चैनल का उपयोग करेंa647-edu सभी प्रकाश वर्तमान के साथ कम से कम 685 एनएम है कि फिल्टर से टकराने के एक 670/30 बैंड पास फिल्टर का उपयोग; और phycoerythrin (पीई) सभी प्रकाश उपस्थित कम से कम 600 एनएम है कि फिल्टर से टकराने के साथ इसे के सामने एक 581/15 बैंड पास फिल्टर के साथ पीआई के लिए चैनल।
      2. प्रवाह cytometry में पहली ट्यूब युक्त कोशिकाओं डालें और अधिग्रहण के लिए एक मानक gating रणनीति का उपयोग करें: सेल धुंधला के लिए पीआई (पीई चैनल) के बाद आकृति विज्ञान एक्स Alexa647-edu (एपीसी चैनल) के लिए प्लॉट एफएससी-क्षेत्र x एसएससी-क्षेत्र। सभी ट्यूबों एक नमूना प्रति 10,000 घटनाओं प्राप्त करने से एक के लिए रिकार्ड डेटा।
      3. Cytometry स्थापित प्रोटोकॉल 11,30 निम्न डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक प्रवाह का उपयोग कोशिकाओं और चरण लंबाई की कोशिका चक्र चरण वितरण निर्धारित करते हैं।

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Representative Results

CyclinB1 और Cdk1 के उप-mitochondrial स्थानीयकरण

सोडियम कार्बोनेट निकासी निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर या बाहर की सतह, अर्थात् बाहरी झिल्ली पर स्थित है कि क्या प्रयोग किया जाता है। एक बार एक प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर स्थानीयकरण करने के लिए दिखाया गया है, उप mitochondrial स्थानीयकरण के आगे दृढ़ संकल्प प्रोटीज पाचन के साथ संयुक्त mitoplasting के माध्यम से किया जा सकता है। CyclinB1 या Cdk1 के उप-mitochondrial स्थानीयकरण निर्दिष्ट करने के लिए, mitoplasts 25 मिमी से 200 मिमी आसमाटिक सुक्रोज की सांद्रता घटने के साथ hypotonic बफ़र्स में माइटोकॉन्ड्रिया गिराए द्वारा अलग थे। बाहरी झिल्ली, सूक्रोज के 150 मिमी पर टूटना शुरू होता है, जबकि भीतर की झिल्ली सुक्रोज 25 मिमी (चित्रा 1 ए) पर अंतिम एकाग्रता तक बरकरार है। mitoplasting साथ संयोजन में, प्रोटीज संरक्षण परख tryps का उपयोग किया जा सकता हैमें बाहरी झिल्ली फटने के बाद उजागर प्रोटीन को पचाने के लिए। इस intermembrane अंतरिक्ष प्रोटीन के पाचन में परिणाम होगा। ब्याज की प्रोटीन trypsin पाचन से सुरक्षित है, तो इस प्रोटीन की mitochondrial मैट्रिक्स स्थानीयकरण इंगित करता है। इस प्रतिनिधि चित्र में, mitochondrial मैट्रिक्स प्रोटीन Hsp60, और intermembrane अंतरिक्ष प्रोटीन Timm13 उप mitochondrial स्थानीयकरण मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया। Hsp60 के साथ, लेकिन Timm13, CyclinB1 और Cdk1 विपरीत इसी trypsin पाचन से संरक्षित किया गया है, उनके mitochondrial मैट्रिक्स स्थानीयकरण (चित्रा 1 बी) का संकेत है।

MTS- और GFP टैग CyclinB1 और Cdk1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति Mitochondrial

एमटीएस CyclinB1 या Cdk1 जीनों के एन टर्मिनस, जो उनकी सी टर्मिनस पर GFP या आरएफपी टैग है पर फ्रेम में क्लोन है। उसके एवज में पुनः संयोजक प्रोटीन माइटोकांड्रिया-लक्षित है GFP- या आरएफपी टैग CyclinB1 या Cdk1। उत्पन्न होता है और इस अध्ययन में इस्तेमाल निर्माणों की सूची आंकड़े में दिखाया गया है। इन निर्माणों, CyclinB1 और / या माइटोकांड्रिया में Cdk1 की overexpression हासिल की थी, पृथक mitochondrial अंशों के पश्चिमी सोख्ता द्वारा यहाँ दिखाया गया है (चित्रा 2) का उपयोग करना।

CyclinB1 / Cdk1 के संभावित Mitochondrial लक्ष्य 2 डी DIGE द्वारा निर्धारित

Cdk1 सेरीन / threonine (एस / टी) काइनेज परिवार एटीपी से एक फॉस्फेट के हस्तांतरण उत्प्रेरित (पी) प्रोलाइन करने के लिए उन्मुख एस टी या अवशेषों के अंतर्गत आता है। एक बिंदु उत्परिवर्तन है कि Cdk1 (D146N) की स्थिति में 146 से asparagine (एन) के एक aspartate (डी) अवशेषों की जगह एक प्रमुख नकारात्मक (डी.एन.) Cdk1 उत्परिवर्ती 19 उत्पन्न करता है। mitochondrial Cdk1 के समारोह का अध्ययन करने के लिए, एक माइटोकांड्रिया-लक्षित Cdk1-डी.एन. प्रोटीन एक प्लाज्मिड के निर्माण से उत्पन्न किया गया था (pERFP-एन 1-टन-Cdk1-डी.एन.) एक 29 एमिनो एसिड-लंदन युक्तजी mitochondrial को निशाना अनुक्रम (एमटीएस) मानव साइटोक्रोम सी oxidase आरएफपी टैग डी.एन.-Cdk1 से जुड़े सबयूनिट की आठवीं से निकाली गई। pERFP-एन 1-एमटीएस माइटोकांड्रिया-लक्षित ERFP प्रोटीन के उत्पादन के एक खाली वेक्टर नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। G2 में mitochondrial phosphoproteins / दोनों निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं एम पीएच 4-10 जेल स्ट्रिप्स के साथ 2 डी जेल विश्लेषण द्वारा profiled रहे थे। खाली वेक्टर transfectants (चित्रा 3, ऊपरी पैनल) के साथ तुलना में, mitochondrial phosphoproteins के एक समूह ने जाहिरा तौर पर अनुपस्थित था या Cdk1-डी.एन. transfectants (चित्रा 3, कम पैनल) में कमी आई है। स्पॉट का पता चला के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रिया में Cdk1 द्वारा phosphorylated की पहचान निर्धारित की।

सेल चक्र प्रगति और edu पल्स-परख के साथ चेस चरण लंबाई के निर्धारण

सेल चक्र whe की प्रगति की जांच करने के लिएn mitochondrial CyclinB1 / Cdk1 का स्तर बढ़ रहे हैं, एक पल्स-चेस लेबलिंग एक thymidine एनालॉग का उपयोग कर प्रयोग, ethynyl डिऑक्सीयूरिडीन (edu) डीएनए संश्लेषण 20 के दौर से गुजर कोशिकाओं की आबादी लेबल करने के लिए प्रदर्शन किया था। इस विधि एडू-सकारात्मक आबादी ट्रैकिंग जब कोशिकाओं एस और G2 / एम चरणों के माध्यम से प्रगति और G1 चरण में जमा करके एक 22 घंटा के खिड़की पर कब्जा कर लिया सेल चक्र के दृश्य की अनुमति देता। परिणाम बताते हैं कि लेबल एस चरण कोशिकाओं, एक वेक्टर नियंत्रण या उत्परिवर्ती CyclinB1 / साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में 6 घंटे की तुलना में के माध्यम से G2 / एम चरण प्रगति की है और कोशिकाओं में 4 घंटे के रूप में उपवास के रूप में G1 चरण में छपी जंगली प्रकार mitochondrial CyclinB1 / Cdk1 व्यक्त Cdk1 (चित्रा 4 ए), mitochondrial CyclinB1 की वृद्धि का संकेत है कि / Cdk1 कोशिका चक्र प्रगति accelerates।

आकृति 1
चित्रा 1. Mitochondrial CyclinB1 / मैट्रिक्स। (एबी) CyclinB1 और Cdk1 के उप-mitochondrial स्थानीयकरण में Cdk1 localizes mitoplasting और प्रोटीज संरक्षण परख द्वारा पता लगाया, चित्रा से वैंग एट अल।, 2014 11 संशोधित किया गया है। कुल (टी), गोली (पी), और सतह पर तैरनेवाला (एस) अंशों संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के अधीन थे। TIMM13 (एक अंतर-अंतरिक्ष प्रोटीन), और HSP60 (एक मैट्रिक्स प्रोटीन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Mitochondrial Cdk1 निर्माणों के अभिव्यक्ति। माइटोकांड्रिया-लक्षित CyclinB1 और / या जंगली प्रकार या प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती Cdk1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से अलग mitochondrial अंशों की पश्चिमी सोख्ता (plasmids संकेत कर रहे हैं नीचे 11 पर। pEGFP-एन 1-टन और pERFP-एन 1-एमटीएस वैक्टर टन-टन-CyclinB1 और Cdk1 क्रमशः) के लिए खाली वेक्टर नियंत्रण में थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Cdk1 के संभावित Mitochondrial substrates। Mitochondrial G2 / एम नुकीला माइटोकांड्रिया-लक्षित खाली वेक्टर (pERFP-एन 1-लाख टन, ऊपरी पैनल) या उत्परिवर्ती Cdk1 (pERFP-एन 1-टन-Cdk1-डी.एन. साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से निकाले प्रोटीन, कम पैनल), Cy5 (हरा) के साथ लेबल रहे थे 2-डी जेल से अलग कर दिया और फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन phosphoprotein डाई (लाल) के साथ दाग रहे थे। यह आंकड़ा वांग एट अल। 2014 11 से संशोधित किया गया है।"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Mitochondrial Cdk1 बढ़ाता G2 / एम संक्रमण और समग्र चक्र प्रगति।
Edu पल्स-चेस लेबलिंग के साथ कोशिका चक्र विश्लेषण। एडू-लेबल की कोशिकाओं के तितर बितर साजिश histograms डीएनए सामग्री (एक्स अक्ष) और edu (शाफ़्ट) के लिए तैयार किया गया। प्रत्येक पैनल में कम आंकड़े edu का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता लेबल नाभिक दिखा। समय अंक edu पल्स 11 के बाद ज में संकेत दिया गया था। सभी समय अंक के लिए, निम्न आबादी प्रदर्शित फाटकों खींचा गया: G0 / G1, एस, और G2 / एम। 6, 8, और 10 घंटे की समय अंक के लिए, शिक्षण लेबल G1 *, एस / G2 *, और G2 / एम * आबादी दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा वांग एट अल से संशोधित किया गया है। 2014 11। क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

सुक्रोज सांद्रता का इस्तेमाल
कोई trypsin 25 मिमी 50 मिमी 100 मिमी 150 मिमी 200 मिमी
+ trypsin 25 मिमी 50 मिमी 100 मिमी 150 मिमी 200 मिमी

तालिका 1 Hypotonic सुक्रोज बफ़र 4.2 चरण के लिए प्रयुक्त

स्टेप 1 30 वी 12 घंटा कदम और पकड़ो
चरण 2 300 वी 0.5 मानव संसाधन कदम और पकड़ो
चरण 3 1,000 वी 0.5 मानव संसाधन ढाल
5000 वि 1.33 मानव संसाधन ढाल
चरण 5 5000 वि 20,000 वी मानव संसाधन कदम और पकड़ो

तालिका 2 समविद्युतविभव प्रोटोकॉल चरण 6.4.5 के लिए प्रयुक्त

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Discussion

प्रोटीन अन्य subcellular अंगों के लिए किस्मत की तरह, mitochondrial लक्षित प्रोटीन उनके प्राथमिक या माध्यमिक संरचना के भीतर लक्षित करने का संकेत है कि उन्हें विस्तृत प्रोटीन translocating और तह मशीनों की सहायता से 21,22 organelle करने के लिए प्रत्यक्ष अधिकारी। लक्षित कर दृश्यों (एमटीएस) इस तरह के रूप में विशेष रूप COX8 mitochondrial निवासी प्रोटीन से प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रिया 11,23,24 में विशिष्ट प्रोटीन को निशाना बनाने के लिए किसी भी जीन अनुक्रम के एन टर्मिनस के लिए जोड़ा जा सकता है। इधर, CyclinB1 और Cdk1 जीन वैक्टर युक्त COX8 एमटीएस में और अभिव्यक्ति पर क्लोन किया गया, पुनः संयोजक CyclinB1 और Cdk1 माइटोकॉन्ड्रिया में अनुवादित किया गया। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह एक विशेष उप सेलुलर डिब्बे में जीन की अभिव्यक्ति के संशोधन के लिए सक्षम बनाता है, इस मामले में माइटोकॉन्ड्रिया, समग्र जीन अभिव्यक्ति को बदलने के बिना है। इस रणनीति के साथ, माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट एक परमाणु काइनेज का काम करता है, Cdk1 डे के थेtermined। इसी तरह, एक प्रमुख नकारात्मक Cdk1 के लिए एमटीएस जोड़कर, Cdk1 के माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट कार्यों के नीचे दस्तक हासिल की थी, जो माइटोकॉन्ड्रिया Cdk1 के विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति दी है, और Cdk1 समारोह की mitochondrial अनुपस्थिति के कार्यात्मक परिणामों के विश्लेषण के सक्षम होना चाहिए। दोनों माइटोकॉन्ड्रिया और नाभिक में Cdk1 का बढ़ाया अभिव्यक्ति में एमटीएस टैग परिणाम के बिना Cdk1 की overexpression, और इसलिए Cdk1 के माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट कार्यों के परिणामों की आगे की जांच के पेचीदा हो।

हालांकि, इस दृष्टिकोण सभी जीन उत्पादों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है के रूप में हम एमटीएस टैग के अलावा के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया में कुछ kinases स्थानांतरित करने पर कुछ असफल प्रयासों का अनुभव किया है। कुछ सेल लाइनों काफी अभिकर्मक के लिए प्रतिरोधी हो सकता है, और इष्टतम प्रोटोकॉल पाने में काफ़ी समय हो सकता है। यहां तक ​​कि जब कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और अभिकर्मक फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के साथ काम सफल होता है, कुछ समस्याओं को दर्शाती है सफलताएकत्रीकरण, गलत स्थानीयकरण, गैर कार्यात्मक fusions, और कमजोर संकेतों के रूप में एच।

माइटोकॉन्ड्रिया और mitoplasts के अलगाव के प्रमुख सीमाओं कम उपज और अन्य सेलुलर या उप-mitochondrial डिब्बों से संभावित संक्रमण शामिल हैं। यह सुझाव दिया है कि पक्षपाती कोशिकाओं पारंपरिक रासायनिक या यांत्रिक तरीकों से कुशलता से उठी नहीं कर रहे हैं, इसलिए, यह मुश्किल सुसंस्कृत पक्षपाती कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया की उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए कर रही है। यहाँ, हम MCF10A कोशिकाओं के पक्षपाती संस्कृतियों का उपयोग किया। के बारे में 30 उपज के लिए - 50 mitochondrial प्रोटीन की माइक्रोग्राम, 3 की एक प्रारंभिक राशि - 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं का उपयोग किया गया। homogenization कदम mitochondrial तैयारी के अंतिम उपज के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु है। सेल का इस्तेमाल किया तर्ज पर निर्भर करता है, स्ट्रोक और / या homogenization के समय की संख्या भिन्न हो सकते हैं। MCF10A कोशिकाओं के लिए, हमने देखा है कि गिलास / ग्लास homogenizer द्वारा homogenization के 10 मिनट के लिए आवश्यक है, जबकि माउस भ्रूण fibroblahomogenization के 5 मिनट - अनुसूचित जनजातियों (MEF) केवल 3 की आवश्यकता है। अत्यधिक homogenization mitochondrial झिल्ली को नुकसान हो और mitochondrial घटकों की रिहाई को ट्रिगर कर सकते हैं के बाद से, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए मानक स्थितियों के अनुभव के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। एक गिलास कांच homogenizer के उपयोग के गिलास / Teflon homogenizers की तुलना में mitochondrial तैयारियों की पैदावार बढ़ जाती है। कोशिकाओं की प्रारंभिक राशि के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के फ्रीज / विगलन खुला कोशिकाओं तोड़ने के लिए आवश्यक स्ट्रोक की संख्या बदल सकता है। अंत में, प्रोटीन विकृतीकरण और एकत्रीकरण homogenization के दौरान नमूना के स्थानीय हीटिंग की वजह से हो सकता है। अत: यह ऊतक चक्की पूर्व ठंड और इस प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर नमूने रखने के लिए है, आवश्यक।

इस लेख में प्रस्तुत एक अन्य विधि edu लेबलिंग का उपयोग वास्तविक समय में सेल चक्र की निगरानी है। Edu एक संशोधित thymidine एनालॉग जो fluorescently एक उज्ज्वल, photostable एलेक्सा स्त्राव डाई के साथ लेबल है। Edu effi हैciently नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया। इस विधि nucleoside एनालॉग, bromodeoxyuridine (BrdU) के साथ कोशिकाओं proliferating के पारंपरिक लेबलिंग का उपयोग करने के लिए एक बेहतर विकल्प है। BrdU सक्रिय डीएनए संश्लेषण के दौरान डीएनए में शामिल किया है। BrdU लेबल डीएनए की मात्रा का ठहराव इस तरह के उच्च गर्मी या उच्च अम्लता BrdU एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए BrdU अणुओं को बेनकाब करने के रूप में अपेक्षाकृत कठोर तरीकों से डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता है। डीएनए विकृतीकरण के लिए कठोर उपचार नमूना गुणवत्ता को प्रभावित और समय लगता है हो सकता। Edu के साथ, डिटर्जेंट permeabilization आम तौर पर edu पता लगाने अभिकर्मक डीएनए के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। डीएनए का उपयोग के लिए कठोर रसायनों या गर्मी का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना, edu विधि और अधिक सटीक का उपयोग करने के लिए आसान है, और संगत है। इसके अलावा फायदों edu प्रदान करता है से, वहाँ कुछ प्रसार का अध्ययन करने के edu के उपयोग के संबंध में चिंताओं को दिया गया है। Edu 72 घंटा से अधिक उपचार पर एक मामूली विरोधी proliferative गतिविधि है, जो negl को कम किया जा सकता है दिखायाigible स्तरों जब edu नाड़ी 1 घंटा 25 में रखा गया था।

एक संशोधन edu लेबलिंग के साथ कार्यरत फिक्सिंग समय और तरीका है। किट प्रदान की फिक्सिंग समाधान के साथ एक 15 मिनट के निर्धारण का सुझाव दिया। हालांकि, 70% इथेनॉल के साथ एक अतिरिक्त निर्धारण इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था। जहां कोशिकाओं को हर 2 घंटा एकत्र किए गए थे 1) समय के साथ सेल चक्र प्रगति का पालन करने के लिए, एक समय बिंदु प्रयोग, प्रदर्शन किया गया था: वहाँ इथेनॉल के इस्तेमाल के लिए दो कारण हैं। कोशिकाओं तक प्रयोगात्मक समय बिंदुओं के सभी पूरी हो चुकी हैं 4 ओ सी पर 70% इथेनॉल में रखा गया था। असल में, कोशिकाओं (महीनों के लिए कई सप्ताह) के लिए अब 70% इथेनॉल में रखा जा सकता है अगर जरूरत हो। 2) प्रयोग के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक GFP टैग Cdk1 और / या आरएफपी टैग CyclinB1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। GFP / आरएफपी प्रतिदीप्ति से edu और पीआई संकेतों को अलग करने के लिए, इथेनॉल निर्धारण GFP और आरएफपी प्रोटीन denature, और इसलिए edu एक प्रदर्शन से पहले उनके प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए उपयोग किया गया थाडी पीआई धुंधला। विकृत GFP / आरएफपी प्रोटीन अनिवार्य रूप से पूरी तरह से गैर फ्लोरोसेंट, शायद क्योंकि क्रोमोफोर नहीं रह 26,27 शमन से संरक्षित कर रहे हैं।

Cdk1 की mitochondrial लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, 2 डी DIGE विधि है, जो कई मायनों में पारंपरिक 2 डी जैल से बेहतर है इस्तेमाल किया गया था। 2 डी DIGE, विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक, जैसे, Cy 3, 5 और 2 में, लेबल के नमूने, जो एक जेल में 3 नमूने के ऊपर चल रहा है की अनुमति देता है, मानक 2D जेल में की तरह प्रतिकृति को चलाने के लिए आवश्यकता के बिना परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। फ्लोरोसेंट 2 डी DIGE में इस्तेमाल रंगों 100 एनजी / स्पॉट, इस प्रकार है, जो उच्च स्थान संकल्प और साथ 2 डी DIGE जैल पर चलने के लिए प्रोटीन की छोटी राशि की आवश्यकता पर triphenylmethane रंगों की तुलना में 0.2 एनजी / स्थान का एक बहुत ही उच्च संवेदनशीलता है प्रकाशन गुणवत्ता जेल स्कैन। एक स्वचालित सॉफ्टवेयर का पता लगाने यों और विभिन्न व्यक्त प्रोटीन को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। उच्च मौके संकल्प की वजह से, नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति अंतर सीएn सॉफ्टवेयर सहायता प्राप्त मौके मात्रा का ठहराव का उपयोग कर सही तुलना में किया जा; 10% तक कम एक अंतर 2 डी DIGE के माध्यम से पता लगाया जा सकता है, आसानी से बाद translational संशोधनों के दृश्य सक्षम करने से। का उपयोग सॉफ्टवेयर एडेड में जेल विश्लेषण भी डेटा के तेजी से अधिग्रहण के लिए सक्षम बनाता है। हालांकि, उपकरण के बाद से, इस तरह के फ्लोरोसेंट स्कैनर के रूप में, छवि अधिग्रहण के लिए आवश्यक हैं, इस विधि के प्रयोग के अतिरिक्त लागत शामिल है। 2 डी DIGE की अन्य सीमाओं चरम समविद्युतविभव अंक और बड़े आणविक भार के साथ 28,29 हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के गरीब प्रतिनिधित्व के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रोटीन शामिल हैं। ऐसे immunocytochemistry या पश्चिमी धब्बा के रूप में वैकल्पिक तकनीकों का उपयोग करते हुए 2 डी DIGE के साथ प्राप्त परिणामों की आगे की मान्यता उपन्यास निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 108 mitochondrial स्थानीयकरण उप mitochondrial स्थानीयकरण mitoplasts माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना अनुक्रम जटिल मैं कोशिका चक्र Cdk1
प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए Mitochondrial स्थानीयकरण और एक परमाणु कोशिका चक्र kinase, Cdk1 के फंक्शन
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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. … More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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