Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Summary

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Abstract

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introduction

In zoogdieren, celcyclus progressie afhankelijk sterk geordende gebeurtenissen gecontroleerd door cyclinen en cycline-afhankelijke kinasen (Cdks) ^1. Via haar cytoplasma, nucleaire en centrosomal lokalisatie, CyclinB1 / Cdk1 is in staat om verschillende gebeurtenissen in mitose zoals nucleaire envelop afbraak en centrosome scheiding ² synchroniseren. CyclinB1 / Cdk1 mitotische cellen beschermt tegen apoptose ³ en bevordert mitochondriale splitsing, een kritische stap voor een gelijke verdeling van mitochondriën de nieuw gevormde dochtercellen ^4.

In prolifererende zoogdiercellen wordt mitochondriale ATP gegenereerd via oxidatieve fosforylering (OXPHOS) machines (elektronentransportketen), dat bestaat uit 5 multi-subunit complexen; complex I – complex V (CI-CV). Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): ubiquinone oxidoreductase of complex I (CI) is de grootste en minst begrepen van de vijf complexen ^5. Het complex consists van 45 subeenheden, 14 hiervan vormen de katalytische kern. Eenmaal geassembleerd, het complex uit van een L-vormige structuur met een arm uitsteekt in de matrix en de andere arm ingebed in het binnenste membraan ^6,7. Mutaties in CI subeenheden zijn de oorzaak van verschillende mitochondriale aandoeningen ^8. Een functioneel efficiënt CI in OXPHOS vereist niet alleen algemene mitochondriale respiratie ^9, maar ook voor een succesvolle celcyclusprogressie ^10. Het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het functioneren van deze membraangebonden enzymcomplex in gezondheid en ziekte kan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische procedures en geavanceerde therapeutische strategieën mogelijk te maken. In een recente studie, hebben wij gevonden dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria in de (Gap 2) G2 / (mitose) M fase en fosforyleert CI subeenheden mitochondriale energieproductie verbeteren, potentieel verhoogde energiebehoefte van cellen tijdens cel offset ¹¹ cyclus. Hier sho wewcase experimentele werkwijzen en strategieën die kunnen worden gebruikt om mitochondriale translocatie van andere nucleaire / cytoplasmatische kinasen bestuderen hun mitochondriale substraten en functionele gevolgen van de mitochondriale lokalisatie middels CyclinB1 / Cdk1 als voorbeeld.

De vaststelling dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria als dat nodig was voor de studies van de mitochondriën-specifieke overexpressie en knock-down van dit complex. Mitochondriën-specifieke expressie van eiwitten te bereiken, kan men een mitochondria doelsequentie (MTS) toevoegen aan de N-terminus van het eiwit van belang. Mitochondriën targeting sequenties kan de sortering van de mitochondriale eiwitten in de mitochondria welke gewoonlijk ¹² verblijven. We hebben een 87 base mitochondria targeting sequentie afgeleid van de voorloper van de menselijke cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) gebruikt en gekloond het in Green Fluorescent Protein (GFP) gemerkte CyclinB1 of Red FluorescentEiwit (RFP) gemerkte Cdk1 bevattende plasmiden in frame. Deze methode liet ons toe om te richten CyclinB1 en Cdk1 in de mitochondriën, in het bijzonder het veranderen van de mitochondriale expressie van deze eiwitten zonder dat hun nucleaire zwembad. Door fluorescent tagging deze eiwitten, waren we in staat om hun lokalisatie in real time te volgen. Zo hebben we MTS geïntroduceerd in een plasmide dat RFP-tag dominant negatief Cdk1, wat ons toeliet om specifiek knock down het mitochondriale expressie en functies van Cdk1. Het is essentieel om onderscheid te maken tussen mitochondriale en nucleaire functies van de kinasen die dubbele lokalisaties zoals Cdk1 hebben. Techniek MTS in de N-terminale van deze tweevoudige functionaliteit kinasen biedt een goede strategie die gemakkelijk toe te passen en effectief.

Aangezien Cdk1 is een celcyclus kinase is essentieel voor de voortgang van de celcyclus te bepalen wanneer Cdk1 wordt vertaald in mitochondria. Hiervoor hebben we een nieuwe metho gebruiktd gehalte aan DNA in cellen te volgen. Traditionele werkwijzen omvatten het gebruik BrdU (bromodeoxyuridine), een synthetisch analoog van thymidine, die wordt opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S fase van de celcyclus te vervangen thymidine. Vervolgens de cellen die actief replicerend hun DNA kan worden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU-antilichamen. Een nadeel van deze werkwijze is dat het denaturatie van DNA toegankelijk voor de BrdU antilichaam verschaffen door scherp methoden zoals zuur of warmtebehandeling, hetgeen kan leiden tot onverenigbaarheid tussen resultaten ^13,14. Als alternatief hebben we gebruik gemaakt van een soortgelijke benadering van het actief delende cellen met een andere thymidine analogon EDU controleren. Edu-detectie vereist geen agressieve DNA denaturatie een zacht reinigingsmiddel behandeling kan de detectie reagens om toegang te krijgen tot de EDU in nieuw gesynthetiseerde DNA. De EDE methode heeft bewezen betrouwbare, consistente en potentieel voor high-throughput analyse ¹⁵ zijn.

Tenslotte, to bepalen de mitochondriale substraten Cdk1, gebruikten we een proteomics tool genaamd 2D-DIGE, die is een verbeterde versie van de klassieke twee-dimensionale gelelektroforese. Tweedimensionale elektroforese scheidt proteïnen op basis van hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie en het molecuulgewicht in de tweede. Aangezien post-translationele modificaties als fosforylatie beïnvloeden het isoelektrisch punt en het molecuulgewicht van de eiwitten, kan 2D gels verschillen tussen fosforylatie status van eiwitten in verschillende monsters te detecteren. De grootte (stippellijn intensiteit) eiwit vlekken verandert met het expressieniveau van eiwitten, waardoor kwantitatieve vergelijking tussen meerdere monsters. Met behulp van deze methode, waren we in staat om de gefosforyleerde eiwitten te onderscheiden in wild-type versus mutant-mitochondriën gerichte Cdk1 tot expressie brengen. De specifieke eiwit plekken die toonde in het wild-type, maar ontbraken in de mitochondriën gerichte mutant Cdk1 voorbereiding werden geïsoleerd engeïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie.

In traditionele 2D-gels worden trifenylmethaankleurstoffen gebruikt om de eiwitten zichtbaar op de gel. 2D-DIGE gebruikt fluorescent eiwit labels met minimaal effect op proteïne elektroforetische mobiliteit. Ander eiwit monsters kunnen worden gelabeld met verschillende fluorescente kleurstoffen, gemengd en gescheiden door de identieke gels, waardoor de co-elektroforese van meerdere monsters op één gel ^16. Dit minimaliseert de gel naar gel variaties wat een kritiek probleem in gel-gebaseerde proteomics onderzoek.

Protocol

1. Isolatie van Mitochondriën uit gekweekte cellen Bereiding van isolatiebuffer Cellen (IBC) Buffer Bereid 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroxymethyl) aminomethaan / 3- (N -morpholino) propaansulfonzuur): Los 12,1 g Tris in 800 ml gedestilleerd water, breng de pH op 7,4 met behulp MOPS poeder, gedestilleerd water tot een totaalvolume volume van 1 L en bewaar bij 4 ° C. Bereid 0,1 M EGTA (ethyleenglycol bis (2-aminoethylether) tetra-azijnzuur) / Tris: Los 3…

Representative Results

Sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 en Cdk1 Natriumcarbonaat extractie wordt bepaald of een eiwit bevindt zich in de mitochondriën of op het buitenoppervlak, namelijk buitenste membraan. Zodra een proteïne blijkt te lokaliseren binnen de mitochondria, kan nadere bepaling van sub-mitochondriale lokalisatie worden gezet mitoplasting combinatie met protease vertering. Om de sub-mitochondriale lokalisati…

Discussion

Zoals de eiwitten die bestemd zijn voor andere subcellulaire organellen, de beoogde mitochondriale eiwitten bezitten targeting signalen in de primaire of secundaire structuur die hen direct naar het organel met behulp van uitgebreide eiwit translocatie en vouwmachines ^21,22. Mitochondriën targeting sequenties (MTS) uitsluitend verkregen van mitochondriale resident eiwitten zoals COX8 kan worden toegevoegd aan N-terminus van elke gensequentie specifieke eiwitten in de mitochondriën richten ^{11,23,24.</su…}

Materials

32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956