Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In zoogdieren, celcyclus progressie afhankelijk sterk geordende gebeurtenissen gecontroleerd door cyclinen en cycline-afhankelijke kinasen (Cdks) 1. Via haar cytoplasma, nucleaire en centrosomal lokalisatie, CyclinB1 / Cdk1 is in staat om verschillende gebeurtenissen in mitose zoals nucleaire envelop afbraak en centrosome scheiding 2 synchroniseren. CyclinB1 / Cdk1 mitotische cellen beschermt tegen apoptose 3 en bevordert mitochondriale splitsing, een kritische stap voor een gelijke verdeling van mitochondriën de nieuw gevormde dochtercellen 4.

In prolifererende zoogdiercellen wordt mitochondriale ATP gegenereerd via oxidatieve fosforylering (OXPHOS) machines (elektronentransportketen), dat bestaat uit 5 multi-subunit complexen; complex I - complex V (CI-CV). Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): ubiquinone oxidoreductase of complex I (CI) is de grootste en minst begrepen van de vijf complexen 5. Het complex consists van 45 subeenheden, 14 hiervan vormen de katalytische kern. Eenmaal geassembleerd, het complex uit van een L-vormige structuur met een arm uitsteekt in de matrix en de andere arm ingebed in het binnenste membraan 6,7. Mutaties in CI subeenheden zijn de oorzaak van verschillende mitochondriale aandoeningen 8. Een functioneel efficiënt CI in OXPHOS vereist niet alleen algemene mitochondriale respiratie 9, maar ook voor een succesvolle celcyclusprogressie 10. Het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het functioneren van deze membraangebonden enzymcomplex in gezondheid en ziekte kan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische procedures en geavanceerde therapeutische strategieën mogelijk te maken. In een recente studie, hebben wij gevonden dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria in de (Gap 2) G2 / (mitose) M fase en fosforyleert CI subeenheden mitochondriale energieproductie verbeteren, potentieel verhoogde energiebehoefte van cellen tijdens cel offset 11 cyclus. Hier sho wewcase experimentele werkwijzen en strategieën die kunnen worden gebruikt om mitochondriale translocatie van andere nucleaire / cytoplasmatische kinasen bestuderen hun mitochondriale substraten en functionele gevolgen van de mitochondriale lokalisatie middels CyclinB1 / Cdk1 als voorbeeld.

De vaststelling dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria als dat nodig was voor de studies van de mitochondriën-specifieke overexpressie en knock-down van dit complex. Mitochondriën-specifieke expressie van eiwitten te bereiken, kan men een mitochondria doelsequentie (MTS) toevoegen aan de N-terminus van het eiwit van belang. Mitochondriën targeting sequenties kan de sortering van de mitochondriale eiwitten in de mitochondria welke gewoonlijk 12 verblijven. We hebben een 87 base mitochondria targeting sequentie afgeleid van de voorloper van de menselijke cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) gebruikt en gekloond het in Green Fluorescent Protein (GFP) gemerkte CyclinB1 of Red FluorescentEiwit (RFP) gemerkte Cdk1 bevattende plasmiden in frame. Deze methode liet ons toe om te richten CyclinB1 en Cdk1 in de mitochondriën, in het bijzonder het veranderen van de mitochondriale expressie van deze eiwitten zonder dat hun nucleaire zwembad. Door fluorescent tagging deze eiwitten, waren we in staat om hun lokalisatie in real time te volgen. Zo hebben we MTS geïntroduceerd in een plasmide dat RFP-tag dominant negatief Cdk1, wat ons toeliet om specifiek knock down het mitochondriale expressie en functies van Cdk1. Het is essentieel om onderscheid te maken tussen mitochondriale en nucleaire functies van de kinasen die dubbele lokalisaties zoals Cdk1 hebben. Techniek MTS in de N-terminale van deze tweevoudige functionaliteit kinasen biedt een goede strategie die gemakkelijk toe te passen en effectief.

Aangezien Cdk1 is een celcyclus kinase is essentieel voor de voortgang van de celcyclus te bepalen wanneer Cdk1 wordt vertaald in mitochondria. Hiervoor hebben we een nieuwe metho gebruiktd gehalte aan DNA in cellen te volgen. Traditionele werkwijzen omvatten het gebruik BrdU (bromodeoxyuridine), een synthetisch analoog van thymidine, die wordt opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S fase van de celcyclus te vervangen thymidine. Vervolgens de cellen die actief replicerend hun DNA kan worden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU-antilichamen. Een nadeel van deze werkwijze is dat het denaturatie van DNA toegankelijk voor de BrdU antilichaam verschaffen door scherp methoden zoals zuur of warmtebehandeling, hetgeen kan leiden tot onverenigbaarheid tussen resultaten 13,14. Als alternatief hebben we gebruik gemaakt van een soortgelijke benadering van het actief delende cellen met een andere thymidine analogon EDU controleren. Edu-detectie vereist geen agressieve DNA denaturatie een zacht reinigingsmiddel behandeling kan de detectie reagens om toegang te krijgen tot de EDU in nieuw gesynthetiseerde DNA. De EDE methode heeft bewezen betrouwbare, consistente en potentieel voor high-throughput analyse 15 zijn.

Tenslotte, to bepalen de mitochondriale substraten Cdk1, gebruikten we een proteomics tool genaamd 2D-DIGE, die is een verbeterde versie van de klassieke twee-dimensionale gelelektroforese. Tweedimensionale elektroforese scheidt proteïnen op basis van hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie en het molecuulgewicht in de tweede. Aangezien post-translationele modificaties als fosforylatie beïnvloeden het isoelektrisch punt en het molecuulgewicht van de eiwitten, kan 2D gels verschillen tussen fosforylatie status van eiwitten in verschillende monsters te detecteren. De grootte (stippellijn intensiteit) eiwit vlekken verandert met het expressieniveau van eiwitten, waardoor kwantitatieve vergelijking tussen meerdere monsters. Met behulp van deze methode, waren we in staat om de gefosforyleerde eiwitten te onderscheiden in wild-type versus mutant-mitochondriën gerichte Cdk1 tot expressie brengen. De specifieke eiwit plekken die toonde in het wild-type, maar ontbraken in de mitochondriën gerichte mutant Cdk1 voorbereiding werden geïsoleerd engeïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie.

In traditionele 2D-gels worden trifenylmethaankleurstoffen gebruikt om de eiwitten zichtbaar op de gel. 2D-DIGE gebruikt fluorescent eiwit labels met minimaal effect op proteïne elektroforetische mobiliteit. Ander eiwit monsters kunnen worden gelabeld met verschillende fluorescente kleurstoffen, gemengd en gescheiden door de identieke gels, waardoor de co-elektroforese van meerdere monsters op één gel 16. Dit minimaliseert de gel naar gel variaties wat een kritiek probleem in gel-gebaseerde proteomics onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Isolatie van Mitochondriën uit gekweekte cellen

  1. Bereiding van isolatiebuffer Cellen (IBC) Buffer
    1. Bereid 0,1 M Tris / MOPS (tris (hydroxymethyl) aminomethaan / 3- (N -morpholino) propaansulfonzuur): Los 12,1 g Tris in 800 ml gedestilleerd water, breng de pH op 7,4 met behulp MOPS poeder, gedestilleerd water tot een totaalvolume volume van 1 L en bewaar bij 4 ° C.
    2. Bereid 0,1 M EGTA (ethyleenglycol bis (2-aminoethylether) tetra-azijnzuur) / Tris: Los 38,1 g EGTA in 800 ml gedestilleerd water, breng de pH op 7,4 met behulp Tris poeder, gedestilleerd water tot een totaalvolume van 1 L en bewaren bij 4 ° C
    3. Bereid 1 M Sucrose: Los 34,23 g sucrose in 100 ml gedestilleerd water, maken 20 ml porties en bewaar bij -20 o C.
    4. Bereid IB c buffer: Bereid 100 ml IB c buffer door het toevoegen van 10 ml 0,1 M Tris / MOPS en 1 ml 0,1 M EGTA / Tris tot 20 ml, Van 1 M sucrose. Voeg gedestilleerd water tot een totaal volume van 100 ml. Pas de pH tot 7,4.
  2. Bereiding van Cell Lysis Buffer
    1. Bereid de lysis buffer bevattende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (ethyleen diamino-azijnzuur), 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β- glycerofosfaat, 1 mM natriumorthovanadaat. Voeg proteaseremmers 1 ug / ml leupeptine en 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluoride) vlak voor gebruik.
  3. Isolatie van Mitochondriën
    1. Oogst 3 x 10 7 cellen met ijskoude 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), pH 7,4 en centrifugeer cellen bij 600 g gedurende 10 min bij 4 ° C Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml ijskoude IB c buffer.
    2. Homogeniseren van de cellen met behulp van een glas / glasvlies molen voor ongeveer 10 min. Breng de homogenaat om een ​​15 ml buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 o C. Voor functionele mitochondria, gebruiken glas / Teflon koppeling want het is minder schadelijk voor de mitochondriën dan het glas / glasvlies molen.
    3. Verzamel de bovenstaande vloeistof tot 1,5 ml en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C Breng de bovenstaande om een ​​1,5 ml tube en opslaan als cytosoleiwit.
    4. Was de pellet (mitochondria) tweemaal met 200 ul ijskoude IB c buffer en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in de cellysis buffer en gebruik onmiddellijk of bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Als functionele mitochondriën nodig zijn, resuspendeer de pellet in de resterende buffer na het weggooien van het supernatant. Verdunnen van het mitochondriale fractie verder kan leiden tot het verlies van functie van mitochondriën. Op te slaan op het ijs en het gebruik van de voorbereiding in 1-3 uur voor het beste resultaat.
    6. Ultrasone trillingen de geresuspendeerde pellet dertig 3-sec bursts perijsbad, centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 min en het supernatant opslaan als mitochondriale fractie.

2. Co-immunokleuring van Cdk1, CyclinB1 en COXIV, een mitochondriale Resident Protein

  1. Kweek 5 x 10 4 cellen op dekglaasjes in platen met 24 putjes O / N of tot 70% confluentie. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 500 ul ijskoude 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fix cellen met 500 ul ijskoude 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Zuig het fixeeroplossing en was de cellen met 500 ul 1 x PBS 3 keer 5 min elk onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
  3. Permeabilize de cellen met 0,2% Triton X-100 in 500 pi PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verstuif de oplossing en was de cellen 3 keer, 5 minuten elk met 500 pi PBS. Voeg de blokkerende oplossing (500 pl, 1% BSA (runderserumalbumine) in PBS met 1% Tween 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verdun het primaire antilichamen 1: 250 (v: v) in 5001; l van het blokkeren oplossing en incubeer de cellen met de gewenste primaire antilichamen opgewekt in verschillende soorten kruis signalering te voorkomen (CyclinB1 (muis) en COXIV (konijn) of Cdk1 (muis) en COXIV (konijn) bij kamertemperatuur gedurende 30 - 60 min of O / N bij 4 ° C.
  5. Was de dekglaasjes met 500 gl 1 x PBS 3 keer, 5 minuten elk en vervolgens geïncubeerd met secundair antilichaam verdund 1: 1000 in 500 pl blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur gevolgd door wassen met 500 pl PBS 3 keer, 5 minuten elk.
  6. Monteer de dekglaasjes met 20 ul van anti-fade montage oplossing en sluit de dia's met nagellak. Het imago van de dia's met behulp van een fluorescentiemicroscoop meteen of houden in het donker bij 4 ° C gedurende 1 - 2 weken.

3. natriumcarbonaat Winning van Intact Mitochondriën

  1. Grow ongeveer 20 x 10 7 cellen, oogst, een keer wassen met PBS en te isoleren mitochondria zoals beschreven in hoofdstuk 1. Divide mitochondriale isolaten in twee parts voor de laatste centrifugeren naar de mitochondriën (vóór stap 1.3.4) pellet; opslaan half te gebruiken als de totale mitochondria (stap 3,2), gebruik de andere helft voor natriumcarbonaat extractie (volgt 3,3-3,6) om oplosbare en membraangebonden eiwitten te scheiden.
  2. Lyse de totale mitochondria pellet met 30 pl cellysis buffer en bewaar het lysaat bij -80 ° C tot gebruik in immunoblotting.
  3. Voeg 250 ul van 0,1 M Na 2 CO 3 (natriumcarbonaat), pH 11,0, de andere helft van de mitochondriale pellet en incubeer op ijs gedurende 30 min.
  4. Centrifugeren bij 100.000 xg gedurende 20 min. Verzamel de supernatant en ga verder met stap 3.5. Lyse de pellet middels 30 pl cellysis buffer en ultrasone trillingen zoals in stap 1.3.6. Bewaar bij -80 ° C tot gebruik in immunoblotting.
  5. Voeg een gelijk volume van 20% vers gemaakte trichloorazijnzuur (TCA) aan het supernatant om de eiwitten neerslaan en houden op ijs gedurende 30 min.
  6. CENTRIFUGE bij 15.000 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant, los de pellet in 80 pl cellysis buffer en bewaar bij -80 ° C tot gebruik in immunoblotting.

4. Scheiding van Binnen en Buiten membranen van de mitochondriën (Isolatie van Mitoplasts)

  1. Groeien ongeveer 20 x 10 7 cellen, oogst, eenmaal wassen met PBS en isoleren mitochondria zoals in hoofdstuk 1. Scheid de mitochondriale fracties in 10 gelijke porties voor de laatste centrifugatie naar de mitochondriën (vóór stap 1.3.4) pelleteren.
  2. Lossen elke pellet in 30 ul van de aangewezen concentratie hypotone sucrose buffer (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (kaliumhydroxide), pH 7,2; sucrose concentratie variërend 25-200 mM) met of zonder 50 ug / ml trypsine ( zie tabel 1) en incubeer 30 min op ijs.
  3. Voeg 3 ul van 10 mM PMSF (tot een eindconcentratie van 1 mM PMSF bereikt) aan de trypsine bevattende flacons stoppen thij trypsine digestie en incubeer op ijs gedurende 10 min.
  4. Centrifugeer bij 14.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Transfer supernatant naar een nieuwe buis, lyseren de pellet in 30 ul van cellysis buffer, ultrasone trillingen zoals in stap 1.3.6, en op te slaan bij -80 o C.

5. Bouw van Mitochondriën-gerichte GFP / RFP-tag CyclinB1 / Cdk1 Vectoren en bevestiging van hun mitochondriaal Localization

  1. Kloon de mitochondria doelsequentie (MTS, afgeleid van de voorloper van menselijk cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) tussen nucleotiden 76-161) in frame in de N-terminus van GFP of RFP op Nhel en BamHI-plaatsen van pEGFP-N1 of pERFP -n1 vectoren onder gebruikmaking van standaard moleculaire kloneringstechnieken.
  2. Bij het ontwerpen van PCR primers voor CyclinB1 en Cdk1 genen, voeg BamHI restrictie-enzym herkenningsplaatsen (vetgedrukt) aan het 5 'van de PCR primers.
    Forward Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Reverse Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Forward CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Reverse CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
  3. Versterken de Cdk1 en CyclinB1 genen met behulp van deze primers volgende standaard technieken. Digest de PCR producten met 1 ui BamHI restrictie-enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur. Run de digestie producten op een 1% agarosegel. Met behulp van een scheermesje, stuurde de juiste sized DNA-fragmenten uit te zuiveren en het DNA uit de gel onder toepassing van een gel extractie kit.
  4. Digest 1 ug MTS-pEGFP-N1 en MTS-pERFP-N1 plasmiden met 1 ui BamHI enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur. Voeg 1 ul van Calf-Intestinal alkalische fosfatase (CIP) gedurende 30 min bij 37 ° C. Run de digestie producten op een 1% agarosegel en zuiveren lineaire plasmiden uit gel als in stap 5,3.
  5. Stel een ligatiereactie door toevoeging van 1 pi plasmide uit stap 5,4 en 5 gl Cdk1 of CyclinB1 van stap 5,3-3 ui ligase buffer, 0,5 pl T4 ligase en 20,5 ui dH 2 O. Incubeer O / N bij 4 ° C.
  6. Transformeren Escherichia coli DH5a competente cellen met 10 pl ligatiemengsel volgens standaard technieken en groeien de bacteriën op 10 mg / ml kanamycine bevattende LB-agarplaten O / N bij 37 ° C om kolonies te verkrijgen.
  7. Kies uit een kolonie van O / N volwassen platen met behulp van een steriele pipet, steek de punt in een 5 ml van kanamycine-LB-bevattende buis en incubeer O / N. Isoleer het plasmide middels miniprep kits volgens het protocol van de fabrikant en de sequentie plasmide met standaardtechnieken.
  8. Transfecteren exponentieel groeiende MCF10A cellen (1,5 x 10 4 cellen gezaaid op 96-well platen) met MTS-Cdk1-RFP of MTS-CyclinB1-GFP plasmiden uit stap 5.7 door het bereiden van een plasmide / reagens-verhouding van 1 transfectie: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 pl) in 100 gl serum- en antibiotica-vrij medium.
  9. Incubeer de cellen in plasmide / reagens mix voor 48 uur bij 37 ° C in een CO2 incubator met vochtregeling (5% CO2, 95% relatieve vochtigheid).
  10. Bereid 1 mM voorraadoplossing van mitochondriale rode en groene fluorescerende kleurstoffen door oplossen van 50 g poeder in 100 ul DMSO. Verdun de voorraad oplossingen 1: 400 in 1x PBS tot 2,5 uM werkende oplossingen te verkrijgen. De voorraadoplossingen kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende een jaar.
  11. Meng 2 pl 2,5 uM van rode kleurstof met 98 ul kweekmedium in een 50 nM uiteindelijke concentratie te bereiden.
  12. Vervang het kweekmedium CyclinB1-GFP MCF10A dragende cellen (gegenereerd in stap 5,8) met rode kleurstof bevattend medium gedurende 2 min. HerhaalDezelfde procedure met groene kleurstof voor Cdk1-RFP dragende MCF10A cellen.
  13. Was tweemaal met 100 gl 1 x PBS om zich te ontdoen van de overmaat kleuroplossing krijgen, voeg 100 pl 1x PBS om de 96-well plaat.
  14. Visualiseren mitochondria en CyclinB1-GFP (excitatie bij 488 nm en emissie bij 494-536 nm) en Cdk1-RFP (excitatie bij 560 nm en emissie bij 565-620 nm) op 96-well platen onder fluorescentiemicroscoop 40x vergroting.

6. Identificatie van differentieel Gefosforyleerd eiwitten via 2D-DIGE

  1. monstervoorbereiding
    1. Mitochondria isoleren en lyseren mitochondriale fracties als in stap 1,3. Voeg een gelijk volume van 20% TCA (trichloorazijnzuur in water) aan elk monster en vortex gedurende 15 seconden. Incubeer de monsters op ijs gedurende 30 min de eiwitten neer te slaan uit de oplossing.
    2. Centrifugeer monsters bij 9300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijder supernatant en voeg 60 ul koude aceton (100%) gevolgd doorcentrifugering bij 9300 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Herhaal de aceton wash (stap 6.1.2) nog een keer, verwijder supernatant en resuspendeer de monsters in 50 ul DIGE etikettering buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 8,5).
  2. Bereid de fluorescente kleurstoffen
    1. Bereid voorraadoplossing: Los kleurstoffen (5 nmol) in 5 pl vers dimethylformamide (DMF) tot een uiteindelijke concentratie van 1 nmol / pl. Bewaar de voorraad kleurstofoplossing bij -20 ° C tot gebruik gedurende enkele maanden.
    2. Bereid werkoplossing: Laat kleurstoffen om bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Verdun 1 pi kleurstof met 4 pi DMF tot een uiteindelijke concentratie van 200 pmol / ul. Houd op het ijs tijdens het gebruik. Opmerking: De werkoplossing kan bij -20 ° C gedurende 3 weken houdbaar.
  3. Label Eiwitten
    1. Meng 1 pl werken kleurstofoplossing per 12,5 ug eiwit. Opschalen als dat nodig is. Voor samengevoegde normen, toe te voegen 61, l Cy2 werkoplossing 300 ug eiwit samengevoegd.
    2. Vortex gedurende 30 seconden en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 30 sec bij 12.000 x g. Incubeer op ijs in het donker gedurende 30 min. Stop de labeling door het toevoegen van 1 pi 10 mM lysine per 1 ui werkoplossing gebruikt. Meng goed en incubeer op ijs in het donker gedurende 10 min.
    3. Pool individueel gelabelde monsters en meng met rehydratie buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, broomfenolblauw). Het totale volume wordt 125 pi.
    4. Vortex monsters voor 30 seconden en laat monsters om bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Belasting 125 pl monsters op 7 cm pH 4-9, isoelektrisch focusseren (IEF) strips.
  4. Eerste dimensie elektroforese
    1. Plaats de strip houders (doodskisten) op de elektrode plaat, zorg ervoor dat de strip houders zijn volledig schoon en droog. Pipet 125 ul monsters in een doodskist, het verspreiden van gelijkmatig over de hele kist.
    2. Met behulp van tweezers, pak de IEF strip, verwijder voorzichtig de plastic beschermhoes, en plaats het (gel kant naar beneden) in de kist / rehydratie buffer. Vermijd luchtbellen. Langzaam vult kist (1 - 1,5 ml) met minerale olie en leg de kist beslaat op de doodskisten.
    3. Begin isoelektrisch focusseren volgens het protocol dat in tabel 2:
      Let op: Als de run is voltooid, kan de strips in plastic buizen worden opgeslagen bij -80 ° C of direct overgegaan op equilibratie en de tweede dimensie.
  5. Tweede dimensie - natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)
    1. evenwicht
      1. Ontdooi SDS equilibratiebuffer (8 ml per strip, 6 M ureum, 30% glycerol, 2% SDS). Weeg dithiothreitol (DTT; 10 mg DTT per 1 ml SDS-equilibratiebuffer). DTT lossen in 4 ml SDS-equilibratiebuffer.
      2. Weeg IAA (joodacetamide, 25 mg IAA per 1 ml SDS-equilibratiebuffer).Los de IAA in 4 ml SDS-equilibratiebuffer.
      3. Smelt 1 ml afdichting agarose oplossing in een waterbad voor later gebruik.
      4. Als de stroken werden bevroren, zodat zij volledig ontdooien. Plaats strips gel kant naar boven in de reswelling lade. Voeg 4 ml SDS-equilibratiebuffer met DTT aan elke strook en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden.
      5. Giet alle SDS-equilibratiebuffer met DTT. Voeg 4 ml SDS-equilibratiebuffer met IAA elke strip en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Na het in evenwicht brengen met de IAA buffer, giet van de SDS equilibratiebuffer.
    2. SDS-PAGE
      1. Uitpakken mini gels, verwijder dan de kam en spoel de gel en de putten met DDH 2 O. Verwijder de witte tape aan de onderkant van de gel voordat u. Oriënteren de strip op de gel correct, gel oriëntatie is van cruciaal belang voor spot snijden.
      2. Plaats de gel plat op teller met het plaatje en gel bovenkant naar experimenter. Leg de strip op de grote plaat met anodische uiteinde (++ eindigen met de barcode) naar de linkerkant van de gel. Met behulp van een liniaal, duw langzaam de strook neer op gel oppervlak. Vermijd luchtbellen tussen de strip en de gel. Zet de gel in een glazen plaat staan.
      3. Voeg 1 ml thermosealbekken agarose oplossing voor het openen van de cassette. Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden geperst met behulp van een platte liniaal. Bouw de opstelling en laat de gel op een constante 125 V gedurende 90 min.
      4. Wanneer de gel klaar is met het uitvoeren, plaatst u de gel op een biomoleculaire imager met 2 ml DDH 2 O en scan de gel in fluorescentie overname mode met 635 nm excitatie laser en 665 nm emissie filter.
    3. fosfoproteïne kleuring
      1. Bevestig de gel met 50% methanol en 10% azijnzuur mengsel (10 ml) gedurende 30 minuten tweemaal. Was met 10 ml water gedurende 10 minuten en driemaal vlek met 10 ml fosfoproteïne vlek voor 60-90 min, gevolgd doorontkleuren met 10 ml destain oplossing 30 min driemaal.
      2. Wassen met 10 ml water 5 min tweemaal en het imago van de gel met een laser gel scanner bij 532 nm / 560 nm excitatie / emissie.
    4. Eiwitvertering en Identificatie
      1. Accijns alle differentieel tot expressie gebrachte eiwit spots van de gel in putjes microplaat met behulp van een robot spot-picker volgens de specificaties van de fabrikant, en voeg 100 mM ammoniumbicarbonaat (2 ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om de gel stukken destain. Dehydrateren met 2 ml 100% acetonitril twee keer wassen en drogen in een vacuüm concentrator voor 30 min.
      2. Hydrateren de gelstukken met 100 pl 13 ng / pl gemodificeerde varkens trypsine in 50 mM ammonium bicarbonaat gedurende 16 uur bij 37 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof en de eiwitten verder extract met 100 ui 5% trifluorazijnzuur in 50% acetonitril gedurende 30 min.
      3. Concentreer de peptiden tot aan 5 pl van vacuümcentrifuge concentterbestuurder en analyseren met MALDI - Time of Flight - tandem massaspectrometrie analyse (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro Kinase Assay

  1. Voorbereiding van de ondergrond
    1. Subkloon Complex I (CI) subeenheden (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 en NDUFA12), waarvan wordt vastgesteld dat differentieel gefosforyleerde Cdk1 doelstellingen in pGEX-5X-1 vector glutathion-S-transferase (GST) gemerkte genereren bacteriële expressieplasmiden 11. Zuiveren CI subeenheden met behulp van de hoge affiniteit glutathion kolommen de onderstaande protocol.
      1. Cultuur GST-gelabeld BI subunit bevattende Escherichia coli-stam BL-21 in Luria-Bertani (LB) bouillon met 50 ug / ml ampicilline in een schudinrichting bij 37 ° C totdat een optische dichtheid (OD) van 0,6 werd bereikt. Voeg isopropyl-BD-thio-galactopyranoside (IPTG) aan de cultusure bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM, en incubeer gedurende nog 3 uur.
      2. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten om de bacteriën te verzamelen en resuspendeer in 5 ml van 1 x PBS-buffer met 5 mM DTT, 1 x proteinase inhibitor cocktail, en 0,1% lysozym. Lyseren de cellen door sonicatie gedurende twintig 5 s uitbarstingen, en verwijder de celresten door centrifugatie bij 600 xg gedurende 10 min.
      3. Verzamel de bovenstaande vloeistof en incubeer met glutathion-agarose 4B korrels bij een volumeverhouding van 4: 1 (supernatant: bead) gedurende 1 uur bij KT.
      4. Elueer het GST-fusie-eiwitten van de bolletjes met 3 ml glutathion elutiebuffer (10 mM gereduceerd glutathion in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) en met de geëlueerde eiwitten dialyse moleculair poreus membraan buizen (molecuulgewicht cut-off 12 -14 kiloDalton) met 1 x PBS / 1 mM EDTA. Bewaar het gezuiverde eiwitten bij - 80 o C.
  2. CDK1 Kinasetest
    1. Voorafgaand aan het starten van het kinase kontay, ingesteld verwarmingsblokken tot 30 ° C en 100 ° C. Dooi commerciële CyclinB1 / Cdk1 enzymcomplex en substraten op ijs.
    2. Bereid het reactiemengsel op ijs. Sinds 32 P ATP isotoop is betrokken, de voorbereiding van alle reactiemengsels in 1,5 ml monster buizen met schroefdop met een O-ring om de verspreiding van radioactiviteit te voorkomen.
      Let op: Volg de regels radioactieve materiaal bescherming. Gebruik een 8 mm dik plexiglas afscherming en werken in ieder geval op een armlengte. Veeg de besmette gebied met water.
    3. Bereid een 30 pl reactiebuffer bevattende 1 x Cdk1 buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,01% Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM koud ATP, 0,1 uCi 32P ATP, 2 eenheden van CyclinB1 / Cdk1 en 6 ug substraat eiwit. Zet het volume op 30 pi met DDH 2 O. Voor positieve controlereactie, vervang het substraat met 0,01 mM histon H1, een bekende CyclinB1 / Cdk1 substraat.
      1. Bij negatieve control reacties (1) vervangen van het substraat met enige GST eiwit en (2) vervangen substraat met 0,01 mM histon H1 + 0,5 pM RO-3306, een selectieve remmer Cdk1.
    4. Goed mengen met een pipet en centrifuge om alle vloeistof bodem van de buis te brengen, waarbij het risico besmetting. Incubeer bij 30 ° C gedurende 60 minuten.
    5. Voeg 6 pl 5x SDS monsterbuffer om de reactie te stoppen en denatureren bij 100 ° C gedurende 10 minuten. Run monsters op 10% SDS-PAGE gel bij 160 V gedurende 2 uur, of totdat kleurstoffront is het einde van de gel bereikte. Transfer gel op een chromatografie papier en wikkel met plasticfolie.
      Let op: Alle vloeistof in contact komt met radio-isotopen moet als radioactief afval worden behandeld en afgevoerd in een 5-liter poly mandefles door de milieu en gezondheid en veiligheid diensten per institutionele richtlijnen.
    6. Maak de gel aan röntgenfilm gedurende 1 dag of tot 1 week bij -20 ° C afhankelijk van de specifieke activiteit van de radio-isotoop gebruikten het enzym.

8. Plaatsgerichte mutagenese te dominant negatief Cdk1 (D146N) genereren

  1. Ontwerp mutagenese primers; twee primers, complementair aan elkaar gemaakt met het mutante plaats (G worden vervangen door een nucleotide coderen voor N in plaats van D aminozuren) geflankeerd door 20 basen aan elke zijde 11.
  2. Bereid een 50 pl polymerase-kettingreactie (PCR) mengsel dat 1 x reactiebuffer, 2,5 mM dNTP's, 10 pM primers (voorwaartse en achterwaartse), 40 ng van het template, en DDH 2 O. Voeg 2,5 U van DNA polymerase in het reactiemengsel.
  3. Voer de volgende PCR-programma: 95 ° C 3 min, 95 ° C, 30 sec, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 cycli (Opmerking: 68 ° C incubatietijd wordt bepaald door de grootte van de DNA 1 min / kb vereist voor DNA ≤ 10 kb Voor grotere DNA, 2 min / kb plus 10 seconden per cyclus..). Volg van 68 ° C 7 min en houden op 4 ° C tot gebruik.
  4. Toevoegen2 pl Dpn I restrictie-enzym (10 U / pl) en 5,7 pi Dpn I buffer, goed mengen met zachte tik met de vinger en incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  5. Breng 10 pl Dpn I-behandelde PCR-producten in 50 pl DH5a competente cellen voor transformatie. Incubeer op ijs gedurende 30 min, gevolgd door 45 sec warmteschok bij 42 ° C en 5 min op ijs. Voeg 500 gl LB en schud bij 37 ° C gedurende 1 uur voor het uitplaten op LB-agarplaten. Incubate O / N bij 37 o C.
  6. Kies een kolonie van de O / N gekweekt agarplaten met een steriele gele pipetpunt, vallen de punt in een buis met 5 ml LB en groeien O / N in een 37 ° C schudinrichting. Isoleer plasmide onder toepassing van een miniprep kit en sequencen het plasmide de mutatie te bevestigen volgens het protocol van de fabrikant.

9. Vaststelling van de celcyclus fase lengtes met Edu Incorporation Assay

  1. Cell Sorting
    1. Transfect 2 x 10 5 cellen met aangegeven vectoren (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt-RFP of MTS-Cdk1-dn-RFP) in een 6-wells plaat met 1: 2 (w: v , 2,5 pg: 5 pl) verhouding van DNA: transfectiereagens mengsel bereid in 2,5 ml serum en antibiotica vrije cultuur media voor 48 uur. Levende soort cellen die stabiel de uiting van de GFP-tag Cdk1 en RFP-tag CyclinB1 eiwitten via flowcytometer.
      1. Was de cellen met 1 x PBS, voeg 100 ul van trypsine in de schaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 2 ml kweekmedium om de cellen te verzamelen en ze door een 70 urn filter om een ​​enkele celsuspensie te genereren. Was de enkele celsuspensie met 500 ul van 1% foetaal kalfsserum in PBS (FCS / PBS) voordat ze op flowcytometer.
      2. Stel de sortering parameters volgende vastgestelde protocollen 18 venstertijd voor dubbele positieve cellen gekleurd met zowel GFP en RFP. Verzamel de gesorteerde cellen die uit de cytometer in een buis containing celkweekmedium en het gebruik van deze cellen voor de analyse van de voortgang van de celcyclus met Edu pulse-chase etikettering als in protocol 9.2.
  2. Meting van de lengte van de celcyclus Met behulp van de EDU Labeling flowcytometrie Assay
    1. Zaad gesorteerd cellen in 6-well platen bij een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen per well en cultuur O / N bij 37 ° C in een CO2 incubator. Voeg EDU aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 25 uM. Incubeer bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 1 uur.
    2. Was de cellen met 1% BSA in 500 pi PBS en verzamelen in een 1,5 ml buis bij 2 uur intervallen voor een totaal van 10 - 12 uur.
    3. Centrifugeer cellen bij 350 g gedurende 5 min, gooi het supernatant. Los de pellet door het toevoegen van 100 pl fixeeroplossing (geleverd door de fabrikant in de labeling kit EDU) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en meng.
    4. Was de cellen met 1 ml van 1% BSA in PBS driemaal. Bevestig decellen opnieuw met 0,5 ml van 70% ethanol O / N bij 4 oC
      Opmerking: Ethanol bevestiging is kritisch voor de interne GFP / RFP fluorescentie doven door de recombinant-gemerkt eiwit expressie.
    5. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 350 xg gedurende 5 minuten en was het pellet met 1 ml van 1% BSA in PBS keer. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer permeabilisatie (0,1% Triton-X-100, 1% BSA, 0,2 mg / ml RNase A in PBS) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Was de cellen met 1 ml van 1% BSA in PBS keer. Voeg 0,5 ml van de reactie cocktail in elke buis en meng goed. Incubeer reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
    7. Wassen met 1 ml van 1% BSA in PBS en eenmaal vlek DNA met 50 ug / ml propidiumjodide (PI) in 1 ml van 1% BSA in PBS.
    8. Analyseer de cellen door flowcytometrie om de EDU-positieve populatie volgen. Present scatter dot plot van EDU-gelabelde cellen gekleurd voor DNA-gehalte (PI kleuring, X-as) en Edu (Alexa 647 kleuring, Y-as).
      1. Gebruik APC-kanaal voor Alexa647-Edu met behulp van een 670/30 band pass filter met alle licht aanwezig op minder dan 685 nm raken van dat filter; en phycoerythrin (PE) kanaal voor PI met een 581/15 band pass filter voor het met al licht aanwezig minder dan 600 nm raken van dat filter.
      2. Plaats de eerste buis met cellen in de flowcytometrie en gebruik een standaard gating strategie voor de acquisitie: Plot FSC-Area X SSC-omgeving voor morfologie, gevolgd door PI (PE kanaal) X Alexa647-edu (APC kanaal) voor mobiele kleuring. Record gegevens voor alle buizen één voor één het verwerven van 10.000 gebeurtenissen per monster.
      3. Bepaal de celcyclus faseverdeling van de cellen en fase lengtes met een flow cytometrie gegevensanalyse software volgens vastgestelde protocollen 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 en Cdk1

Natriumcarbonaat extractie wordt bepaald of een eiwit bevindt zich in de mitochondriën of op het buitenoppervlak, namelijk buitenste membraan. Zodra een proteïne blijkt te lokaliseren binnen de mitochondria, kan nadere bepaling van sub-mitochondriale lokalisatie worden gezet mitoplasting combinatie met protease vertering. Om de sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 of Cdk1 opgeven, werden mitoplasts geïsoleerd door het verdunnen van mitochondria in hypotone buffers met afnemende concentraties van de osmotische sucrose van 200 mm tot 25 mm. Het buitenmembraan begint barsten bij 150 mM sucrose, terwijl het binnenste membraan intact totdat de uiteindelijke concentratie 25 mM sucrose (figuur 1A) blijft. In combinatie met mitoplasting, kan protease bescherming test worden uitgevoerd met behulp van trypsin blootgestelde eiwitten volgende buitenste membraan breuk verteren. Dit resulteert in digestie van intermembrane ruimte eiwitten. Als het eiwit van belang wordt beschermd tegen trypsine digestie, duidt dit mitochondriale matrix lokalisatie van het eiwit. In dit representatieve waarde, werden mitochondriale matrix eiwit Hsp60, en intermembrane ruimte eiwit Timm13 gebruikt als sub-mitochondriale lokalisatie markers. Vergelijkbaar met Hsp60 maar in tegenstelling tot Timm13, CyclinB1 en Cdk1 werden beschermd tegen trypsine spijsvertering, met vermelding van hun mitochondriale matrix lokalisatie (Figuur 1B).

Mitochondriale Expressie van MTS- en GFP-tag CyclinB1 en Cdk1 Eiwitten

MTS wordt gekloneerd in frame aan de N-terminus van CyclinB1 of Cdk1 genen die GFP of RFP bakens aan hun C-terminus heeft. Het verkregen recombinant proteïne-mitochondriën gerichte GFP of RFP-gelabeld CyclinB1 of Cdk1. De lijst van de constructen gegenereerd en gebruikt in deze studie is weergegeven in de figuur. Met deze constructen overexpressie van CyclinB1 en / of Cdk1 in de mitochondria werd bereikt, hier getoond door Western blotting van de geïsoleerde mitochondriële fracties (Figuur 2).

Potentiële Mitochondriale Doelen van CyclinB1 / Cdk1 bepaald door 2D-DIGE

Cdk1 behoort tot de serine / threonine (S / T) kinasefamilie katalyseren de overdracht van een fosfaatgroep van ATP naar proline (P) -georiënteerde S of T residuen. Een punt mutatie die een aspartaat (D) residu met asparagine (N) op positie 146 van Cdk1 (D146N) vervangt genereert een dominant negatieve (dn) Cdk1 mutant 19. Om de functie van mitochondriale Cdk1 bestuderen, werd een mitochondriën gerichte Cdk1 dn-eiwit gegenereerd door het construeren van een plasmide (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn) die een 29 aminozuur-long mitochondriaal (MTS) afgeleid van de subeenheid VIII van het humane cytochroom C oxidase gekoppeld aan RFP gemerkte dn-Cdk1. pERFP-N1-MTS-producerende mitochondriën gerichte ERFP eiwit werd gebruikt als een lege vectorcontrole. Mitochondriale fosfoproteïnen in G2 / M-cellen getransfecteerd met beide constructen werden geprofileerd door 2D-gel analyse bij pH 4-10 gelstroken. Vergeleken met lege vector transfectanten (Figuur 3, bovenste paneel), een groep mitochondriale fosfoproteïnen kennelijk afwezig of verlaagd in de Cdk1 dn-transfectanten (Figuur 3, onderste paneel). Massaspectrometrie analyse van de gedetecteerde vlekken bepaalde de identiteit van de eiwitten gefosforyleerd door Cdk1 in de mitochondriën.

Voortgang van de celcyclus en Bepaling van Fase Lengths met Edu Pulse-chase Assay

Om de progressie van celcyclus whe onderzoekenn mitochondriale CyclinB1 / Cdk1 niveaus worden verhoogd, een puls-chase labeling experiment met behulp van een thymidine analoog, ethynyl deoxyuridine (EDE) werd uitgevoerd om de populatie van cellen ondergaan DNA-synthese 20 labelen. Deze methode maakt de visualisatie van de celcyclus gevangen over een 22 uur raam door het bijhouden van de EDU-positieve populatie wanneer de cellen de voortgang door S en G2 / M fasen en zich ophopen in G1-fase. De resultaten laten zien dat gelabelde S cellen fase doorliep G2 / M fase en verscheen in G1 fase zo snel als 4 h in cellen die wildtype mitochondriale CyclinB1 / Cdk1, vergeleken met 6 uur in cellen getransfecteerd met een vector control of mutant CyclinB1 / Cdk1 (Figuur 4A), wat aangeeft dat verhoging van mitochondriale CyclinB1 / Cdk1 versnelt celcyclus.

Figuur 1
Figuur 1. Mitochondriale cycline1 / Cdk1 lokaliseert in de Matrix. (AB) Sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 en Cdk1 gedetecteerd door mitoplasting en bescherming protease assay cijfer is gewijzigd ten opzichte van Wang et al., 2014 11. Het totale (T), pellet (P) en supernatans (S) fracties werden onderworpen aan Western-blotanalyse met aangegeven antilichamen. TIMM13 (een inter-ruimte eiwit), en HSP60 (een matrix eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Expressie van mitochondriaal Cdk1 constructen. Western blotting van mitochondriale fracties geïsoleerd uit cellen die met-mitochondriën gerichte CyclinB1 en / of wilde type of dominant negatieve mutant Cdk1 (plasmiden worden aangeduid op de bodem 11. pEGFP-N1-MTS en de pERFP-N1-MTS vectoren waren lege vector knoppen voor MTS-CyclinB1 en MTS-Cdk1 respectievelijk). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Potentiële mitochondriale substraten van Cdk1. Mitochondriaal eiwitten geëxtraheerd uit G2 / M-piekte cellen die met-mitochondriën gerichte lege vector (pERFP-N1-MTS, bovenste paneel) of mutant Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, onderste paneel) werden gemerkt met Cy5 (groen), gescheiden door 2-D gel en gefosforyleerde eiwitten werden gekleurd met kleurstof fosfoproteïne (rood). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Wang et al. 2014 11."> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Mitochondriale Cdk1 Verbetert G2 / M transitie en Overall Cycle Progression.
Celcyclus-analyse met Edu pulse-chase labeling. Scatter plot histogrammen van EDU-gelabelde cellen werden getrokken voor DNA-gehalte (X-as) en Edu (Y-as). De lagere cijfers in elk paneel tonen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de EDU gelabelde kernen. De tijdstippen werden in h aangegeven na de EDE puls 11. Voor alle tijdstippen poorten waarin de volgende populaties werden getrokken: G0 / G1, S en G2 / M. 6, 8 en 10 uur tijdstippen, onderwijs gelabeld G1 *, S / G2 * en G2 / M populaties * getoond. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Wang et al., 2014 11. Klikhier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Sucrose gebruikte concentraties
geen trypsine 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ trypsine 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabel 1. Hypotone sucrose Buffers Gebruikt voor stap 4.2

Stap 1 30 V 12 hr Step en Hold
Stap 2 300 V 0,5 hr Step en Hold
stap 3 1000 V 0,5 hr helling
5000 V 1.33 hr helling
stap 5 5000 V 20.000 V hr Step en Hold

Tabel 2. Isoelectric protocol voor stap 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zoals de eiwitten die bestemd zijn voor andere subcellulaire organellen, de beoogde mitochondriale eiwitten bezitten targeting signalen in de primaire of secundaire structuur die hen direct naar het organel met behulp van uitgebreide eiwit translocatie en vouwmachines 21,22. Mitochondriën targeting sequenties (MTS) uitsluitend verkregen van mitochondriale resident eiwitten zoals COX8 kan worden toegevoegd aan N-terminus van elke gensequentie specifieke eiwitten in de mitochondriën richten 11,23,24. Hier werden CyclinB1 en Cdk1 genen gekloond in COX8 MTS met vectoren en na expressie, de recombinant CyclinB1 en Cdk1 werden gelokaliseerd in de mitochondriën. Het voordeel van deze aanpak is dat daardoor de modificatie van genexpressie in een specifieke subcellulaire compartimenten, in casu mitochondria, zonder dat de totale genexpressie. Met deze strategie mitochondriën specifieke functies van een nucleaire kinase, onder de de Cdk1paald. Op dezelfde manier, door het toevoegen van MTS een dominante negatieve Cdk1, knock down van de mitochondriën-specifieke functies van Cdk1 werd bereikt, dat de identificatie van de mitochondriën specifieke doelstellingen van Cdk1 toegestaan ​​en kon de analyse van de functionele gevolgen van mitochondriale afwezigheid van Cdk1 functie. Overexpressie van Cdk1 zonder de MTS tag resulteert in een verhoogde expressie van Cdk1 in zowel mitochondria en kern, en dus compliceert de verdere onderzoeken van de gevolgen van de mitochondriën-specifieke acties van Cdk1.

Echter, deze benadering niet geschikt voor alle genproducten zijn als we een paar mislukte pogingen hebben ervaren bij verhuizing een aantal kinases in de mitochondria via de toevoeging van MTS tag. Sommige cellijnen kunnen goed bestand tegen transfectie, en om de optimale protocol kan tijdrovend zijn. Zelfs wanneer de cellen gezond en transfectie succesvol werken met fluorescent gelabelde eiwitten vertoont enkele problemen such als aggregatie, onjuiste lokalisatie, niet-functionele fusies en zwakke signalen.

Belangrijke beperkingen van de isolatie van de mitochondriën en mitoplasts onder meer de lage opbrengst en de mogelijke besmetting van andere cellulaire of sub-mitochondriale compartimenten. Gesuggereerd wordt dat hechtende cellen niet efficiënt worden verbroken door gebruikelijke chemische of mechanische methoden, dus waardoor het moeilijk om grote hoeveelheden mitochondria verkrijgen uit gekweekte hechtende cellen. Hier hebben we benut hechtende culturen van MCF10A cellen. Tot ongeveer 30 opleveren - 50 ug mitochondriaal eiwit, een beginnende hoeveelheid van 3-5 x 10 7 cellen werden gebruikt. De homogenisering stap is een ander kritisch punt voor de uiteindelijke opbrengst van mitochondriale preparaten. Afhankelijk van de gebruikte cellijnen, kan het aantal slagen en / of tijd van homogenisering variëren. Voor MCF10A cellen, we hebben geconstateerd dat 10 min van homogenisatie door glas / glas homogenisator nodig is, terwijl de muis embryonale fibroblast (MEF) vereist slechts 3-5 min van homogenisering. Omdat overmatige homogenisatie schade aan het mitochondriale membraan kan veroorzaken en leiden tot het vrijkomen van mitochondriale componenten, dient de standaardvoorwaarden voor elke cellijn bepaald worden door ervaring. Het gebruik van een glas-glas homogenisator verhoogt de opbrengst van mitochondriale preparaten vergeleken met glas / teflon homogenisatoren. Het starten hoeveelheid cellen en invriezen / ontdooien van cellen kunnen het aantal slagen nodig openbreken van de cellen te veranderen. Tenslotte kan eiwit denaturatie en aggregatie door een plaatselijke verhitting van het monster tijdens homogenisering. Het is daarom van essentieel belang voor een pre-chill het weefsel molen en monsters op ijs te houden tijdens deze procedure.

Een andere methode die in dit artikel is het gebruik van Edu etikettering celcyclus in real time te volgen. Edu is een gemodificeerde thymidine analoge die fluorescent is gemerkt met een heldere, fotostabiele Alexa Fluor kleurstof. EDU is effidoende geïncorporeerd in nieuw gesynthetiseerde DNA. Deze methode is een beter alternatief voor het gebruik van traditionele labeling van prolifererende cellen met de nucleoside analoog, broomdeoxyuridine (BrdU). BrdU wordt opgenomen in DNA tijdens actieve DNA-synthese. De kwantificering van BrdU-gemerkte DNA vereist DNA denaturatie door relatief agressieve methoden zoals hoge temperatuur of hoge zuurgraad de BrdU moleculen BrdU antilichaambinding bloot. De harde behandeling van DNA denaturatie kan het monster kwaliteit beïnvloeden en is tijdrovend. Met edu, detergens permeabilisatie in het algemeen voldoende voor de EDE detectiereagens toegang tot de DNA krijgen. Zonder dat agressieve chemicaliën of warmte te gebruiken voor DNA toegang, de EDU methode is gemakkelijker te gebruiken, nauwkeuriger en consistenter. Afgezien van de voordelen EDU biedt, is er enige bezorgdheid over het gebruik van Edu om proliferatie te bestuderen. Edu een lichte anti-proliferatieve activiteit op behandelingen over 72 uur, die kan worden teruggebracht tot Verwaarloosbaarigible niveaus toen Edu puls op 1 uur 25 werd gehouden.

Een wijziging in dienst met Edu labeling is de vaststelling tijd en methode. De kit suggereerde een 15 min fixatie met de meegeleverde bevestiging oplossing. Echter, een extra fixatie met 70% ethanol werd gebruikt in dit experiment. Er zijn twee redenen voor het gebruik van ethanol: 1) om de celcyclus in de tijd te volgen, een tijdpunt experiment uitgevoerd, waarbij cellen werden verzameld om de 2 uur. De cellen werden in 70% ethanol bewaard bij 4 ° C totdat al het experimentele tijdstippen zijn voltooid. Eigenlijk kan cellen in 70% ethanol langer bewaard (enkele weken tot maanden) indien nodig. 2) De cellen die voor het experiment werden stabiel getransfecteerd met GFP-gelabeld Cdk1 en / of RFP-gemerkte CyclinB1. Om Edu en PI signalen te scheiden van GFP / RFP fluorescentie, werd ethanol fixatie gebruikt om de GFP en RFP eiwitten denatureren en dus breken er hun fluorescentie voor het uitvoeren van de EDU eend PI kleuring. Gedenatureerde GFP / RFP eiwitten hoofdzaak volledig niet-fluorescerend, waarschijnlijk omdat de chromofoor niet langer beschermd tegen quenching 26,27.

Mitochondriale doelwitten van Cdk1 identificeren 2D-DIGE methode, die superieur is aan traditionele 2D gels op vele manieren gebruikt. In 2D-DIGE onderscheiden fluorescente kleurstoffen, bijvoorbeeld Cy 3, 5 en 2, worden gebruikt om etiket monsters, die kunnen maximaal lopen aan 3 monsters per gel, waardoor de variabiliteit zonder dat herhalingen lopen als in standaard 2D gel. De fluorescerende kleurstoffen in 2D-DIGE hebben een zeer hoge gevoeligheid van 0,2 ng / spot vergeleken met die van trifenylmethaankleurstoffen bij 100 ng / spot dus die kleinere hoeveelheid eiwitten uitgevoerd op de 2D-DIGE gels met hoge plek resolutie en vereist publicatie kwaliteit gel scans. Een geautomatiseerde software wordt gebruikt voor het detecteren, kwantificeren en vast differentieel tot expressie gebrachte eiwitten. Vanwege de hoge plek resolutie, differentiële eiwitexpressie in monsters can nauwkeurig worden vergeleken met de software-aided ter kwantificering; een verschil van slechts 10% kan worden gedetecteerd via 2D-DIGE, waardoor visualisatie van posttranslationele modificaties gemakkelijk. Het gebruik van software-aided in-gel-analyse maakt ook een snellere verwerving van data. Aangezien apparatuur, zoals fluorescerende scanners, vereist voor het verkrijgen, het gebruik van deze werkwijze leiden tot extra kosten. Andere beperkingen van 2D-DIGE onder meer de slechte representatie van hydrofobe eiwitten, alsmede eiwitten met extreme iso-elektrische punten en grote moleculaire gewichten 28,29. Validatie van de resultaten verkregen met 2D-DIGE toepassing van alternatieve technieken, zoals immunocytochemie en Western blot nodig op nieuwe bevindingen te bevestigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter