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Biology

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

포유 동물에서 세포주기의 진행은 cyclins과 cyclin-dependent kinases (Cdks) 1에 의해 제어 높은 순서 이벤트에 따라 달라집니다. 그 세포질, 핵 및 centrosomal 지역화를 통해 CyclinB1 /는 Cdk1는 핵 봉투 고장 및 중심체 분리 2와 유사 분열에서 다양한 이벤트를 동기화 할 수 있습니다. CyclinB1 /는 Cdk1는 세포 사멸 (3)에 대해 유사 분열 세포를 보호하고 미토콘드리아 분열, 새로 형성된 딸 세포 4 미토콘드리아의 평등 한 분배를위한 중요한 단계를 촉진한다.

포유류 세포 증식에​​서 미토콘드리아 ATP 5 멀티 소단위 복합체로 구성되어 산화 적 인산화 (OXPHOS) 기계 (전자 전달계)를 통해 생성된다; 복잡한 I - 복잡한 V (CI-CV). 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH) : 유비 퀴논 산화 환원 효소 복잡한 I (CI)는 다섯 단지 (5)의 이해 최대 규모 이상이다. 복잡한 C45 서브 유닛의 14 onsists는 촉매 코어를 형성한다. 일단 복합 한 팔이 매트릭스 내부의 막에 매립 -6,7- 다른 아암에 돌출하여 L 자형 구조를 가정 조립. CI 단위체의 돌연변이는 미토콘드리아 장애 8의 다양한 원인이다. OXPHOS에서 기능적으로 효율적 CI는 전체 미토콘드리아 호흡 9, 또한 성공적인 세포주기 진행 10뿐만 아니라 필요합니다. 건강과 질병이 막 결합 효소 복합체의 기능을 기본 메커니즘을 해결했습니다 것은 소설 진단 절차 및 고급 치료 전략의 개발을 가능하게 할 수있다. 최근 연구에서는 CyclinB1 /는 Cdk1 착체 셀 중 셀 증가 에너지 요구를 상쇄하기 위해 GAP (2) G2 / (유사 분열) M 단계에서 미토콘드리아에 전위 시키며 잠재적으로, 미토콘드리아의 에너지 생산을 향상 CI 소단위 인산화 것을 발견 사이클 11. 여기에서 우리는 쇼실험 절차와 달리 핵 / 세포질 키나제의 미토콘드리아 전위을 연구하는데 사용될 수있는 전략들은 미토콘드리아 기질뿐만 아니라 예를 들어 CyclinB1 /는 Cdk1을 사용하여 미토콘드리아 지역화 기능적 결과 wcase.

필요한 미토콘드리아 고유의 과발현이 단지의 최저의 연구를 묻는 메시지가 나타나면 CyclinB1 /는 Cdk1 단지가 미토콘드리아로으로 전위 것을 발견. 단백질의 미토콘드리아 - 특이 적 발현을 달성하기 위하여, 하나는 관심있는 단백질의 N 말단에 미토콘드리아 타겟팅 서열 (MTS)을 추가 할 수있다. 시퀀스를 대상으로 미토콘드리아는 일반적으로 12있는 미토콘드리아에 미토콘드리아 단백질의 정렬을 할 수 있습니다. 우리는 CyclinB1 또는 적색 형광을 -tagged 인간 시토크롬 C 산화 효소 서브 유닛 8A (COX8)의 전구체에서 파생 된 87베이스 미토콘드리아 대상 시퀀스를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)로 그것을 복제 한단백질 (RFP)는는 Cdk1 프레임에 플라스미드를 포함 -tagged. 이 방법은 특히 핵 풀에 영향을주지 않고 이들 단백질의 미토콘드리아 표현을 변경, 우리가 미토콘드리아에 CyclinB1과는 Cdk1를 대상으로 할 수있었습니다. 형광이 단백질에 태그를 추가함으로써, 우리는 실시간으로 자신의 위치 파악을 모니터링 할 수 있었다. 마찬가지로, 우리는 우리가 구체적으로는 Cdk1의 미토콘드리아 표현과 기능을 노크 할 수 RFP 태그가 지배적 인 부정적인는 Cdk1 포함하는 플라스미드로 MTS를 도입했습니다. 는 Cdk1 같은 듀얼 현지화를 키나제의 미토콘드리아 및 핵 기능을 구별하는 것이 필수적이다. 이러한 이중 기능성 키나제의 N 말단에 MTS 공학이 사용될 쉽고 효과적인 다양한 전략을 제공한다.

는 Cdk1은 세포주기 키나제이므로,는 Cdk1은 미토콘드리아에 국소 때 세포주기 진행을 결정하는 기본이다. 이를 위해, 우리는 새로운 운전 방식을 이용했다D는 세포의 DNA 함량을 모니터한다. 전통적인 방법은 티미 딘으로 대체하는 세포주기의 S 단계에서 새로 합성 된 DNA 내로 통합 BrdU (브로 모데 옥시 우리 딘), 티미 딘의 합성 유사체를 포함하여. 이어서 적극적으로 DNA를 복제 세포는 항 BrdU의 항체를 이용하여 검출 될 수있다. 이 방법의 하나의 단점은, 결과 (13, 14) 사이의 불일치가 발생할 수 산 또는 열처리 등 열악한 방법에 의해 BrdU의 항체에 대한 액세스를 제공하는 DNA의 변성이 필요하다는 것이다. 대안 적으로, 우리는 다른 티미 딘 유사체, 듀와 적극적 분할 셀을 모니터링하는 유사한 방법을 이용했다. 중성 세제를 처리 새로 합성 된 DNA에 EDU에 액세스 할 수있는 검출 시약을 가능으로 에듀 검출 거친 DNA 변성을 필요로하지 않습니다. 듀 방법보다 신뢰성 일관된 높은 처리량 분석 15 가능성이 입증되었다.

마지막으로, tO는 Cdk1의 미토콘드리아 기질을 결정, 우리는 고전 이차원 전기 영동의 향상된 버전 2D-DIGE라는 프로테오믹스 도구를 사용했다. 두 차원 전기 영동은 두 번째의 첫 번째 차원과 분자량에서의 등전점에 따라 단백질을 분리한다. 이러한 인산화와 같은 번역 후 변형은 단백질의 등전점과 분자량을 결정하므로, 2D 겔 상이한 샘플 내 단백질의 인산화 상태의 차이를 검출 할 수있다. 단백질의 크기 (면적 강도)는 다수의 샘플들 사이의 양적 비교를 허용하는 단백질의 발현 수준의 변화 스폿. 이 방법을 사용하여, 우리는 돌연변이 미토콘드리아 타겟팅는 Cdk1 발현 세포에 비해 야생형에서 인산화 단백질을 구별 할 수 있었다. 야생형에 보여하지만 미토콘드리아 타겟 돌연변이는 Cdk1 준비에 누락 된 특정 단백질 관광 명소 격리하고,질량 분석을 통해 확인 하였다.

전통적인 2D 젤에서 트리 페닐 메탄 염료 겔 단백질을 가시화하기 위해 사용된다. 2D-DIGE 단백질 전기 영동 이동성에 최소한의 효과 형광 단백질 라벨을 사용합니다. 다른 단백질 시료는 다른 형광 염료를 함께 혼합 한 겔 (16)상의 복수의 샘플 공동 전기 있도록, 동일한 겔에 의해 분리로 표지 될 수있다. 이 겔 기반 프로테오믹스 연구에서 중요한 문제이다 겔을 겔 변형을 최소화한다.

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Protocol

배양 된 세포에서 미토콘드리아의 1. 분리

  1. 세포 (IBC) 버퍼 단열 버퍼의 준비
    1. 준비 0.1 M 트리스 / MOPS (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 / 3- (N의 -morpholino) 프로판 술폰산) : 총 증류수를 추가 MOPS 분말을 사용하여 7.4의 pH를 조정 한 증류수 800 ㎖에 트리스 12.1 g을 녹이고 4 ℃에서 1 L 및 저장소의 볼륨
    2. 0.1 M EGTA (에틸렌 글리콜 비스 (2- 아미노 에틸 에테르) 테트라 아세트산)를 준비 / 트리스 : 1 L의 총 부피의 증류수를 추가 트리스 분말을 사용하여 7.4의 pH를 조정 한 증류수 800 ㎖에 EGTA 38.1 g을 녹이고 4 ℃에서 저장
    3. 1 M 자당 준비 : 100 ml의 증류수에 자당의 34.23 g을 녹이고, C. O를 -20에서 20 ㎖ 분취, 저장을
    4. 버퍼 C 0.1 M 트리스 / MOPS 10 ㎖, 20 ㎖의 0.1 M EGTA / 트리스 1 ㎖를 첨가하여 100 ml의 IB 준비 : IB C 형 버퍼를 준비1 M 자당의. 100 ml의 총 부피의 증류수를 추가한다. 7.4으로 산도를 조정합니다.
  2. 세포 용해 버퍼의 준비
    1. 20 mM 트리스 - 염산 (PH 7.5), 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA (에틸렌 디아 미노 테트라 아세트산), 1mM의 EGTA를 함유하는 용해 버퍼를 준비, 1 % 트리톤 X-100, 1 mM의 β- 2.5 mM의 나트륨 피로 포스페이트, 글리세로 포스페이트, 1 mM의 나트륨 오르토 바나 데이트. 바로 사용하기 전에 단백질 분해 효소 억제제 1 μg의 / ㎖ 류 펩틴 및 1mM의 PMSF (페닐 메틸 불화)를 추가합니다.
  3. 미토콘드리아의 분리
    1. 수확 3 얼음처럼 차가운 1X PBS (인산염 완충 식염수)와 × 10 7 세포, pH 7.4의 원심 분리기 세포를 10 분 동안 600 XG에 4 O C.에서 뜨는을 취소하고 5 ml의 얼음처럼 차가운 IB의 C 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    2. 약 10 분 동안 유리 / 유리 조직 분쇄기를 사용하여 세포를 균질화시킨다. 10 마일 600 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 균질 이동4 ℃에서 N 이 유리 / 유리 조직 분쇄기보다 미토콘드리아에 덜 손상 그대로 기능 미토콘드리아를 들어, 유리 / 테플론 커플 링을 사용합니다.
    3. 4 ℃에서 10 분 동안 7,000 XG에 1.5 ml의 튜브에 뜨는 원심 분리기를 수집 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하고 세포질 단백질로 저장합니다.
    4. 4 ℃에서 10 분 동안 7,000 XG에 200 ㎕의 얼음처럼 차가운 IB의 C 버퍼와 원심 분리기에 두 번 펠렛 (미토콘드리아)를 세척
    5. 뜨는을 취소하고 세포 용해 버퍼에 펠렛을 다시 중단하고 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80 ℃로 저장합니다. 미토콘드리아의 기능이 필요한 경우에는 상청액을 폐기 한 후 남아있는 버퍼에 펠렛을 재 중단. 미토콘드리아 분획 더 희석하여 미토콘드리아의 기능의 손실이 발생할 수 있습니다. 얼음에 저장하고 1의 준비를 사용 - 최상의 결과를 위해 3 시간.
    6. 에서 서른 3 초 버스트에 대한 재현 탁 펠렛을 초음파 처리얼음 목욕, 5 분 10,000 XG에 원심 분리기 및 미토콘드리아 분획으로 뜨는을 저장합니다.

는 Cdk1, CyclinB1 및 COXIV, 미토콘드리아 주민 단백질 2. 공동 면역 염색

  1. 24 웰 플레이트의 O / N 또는 최대 70 %의 합류로 된 커버 5 × 10 4 세포를 성장. 매체를 대기음, 500 μl의 얼음처럼 차가운 1 × PBS, pH를 7.4로 두 번 세포를 씻으십시오.
  2. 10 분 동안 실온에서 500 ㎕의 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. 고정 솔루션을 대기음 500 ㎕의 1 × PBS 3 회, 5 분 실온에서 진탕 부드러운 각으로 세포를 씻는다.
  3. RT에서 5 분 동안 PBS 중 500 ㎕의 0.2 % 트리톤 X-100 세포 Permeabilize 하시려면. 솔루션을 대기음, 500 μl의 PBS로 세포를 3 회, 5 분마다 씻는다. 블로킹 용액을 첨가 (500 μL, PBS 1 % 트윈 20을 함유하는 1 % BSA (소 혈청 알부민)) RT에서 30 분 동안.
  4. 250 : 차 항체 1 희석 (절 : V) 5001; 크로스 신호를 피하기 위해 다른 종에서 제기 원하는 차 항체와 세포를 차단 솔루션과 부화의 리터 (CyclinB1 (마우스)와 30 실온에서 COXIV (토끼) 또는는 Cdk1 (마우스)와 COXIV (토끼) - 60 분 또는 O / N 4 O C.에서
  5. 1 × PBS 3 회 500 μL, 5 분 각각 된 커버를 세척 한 후 1 희석 차 항체와 함께 품어 : PBS 500 μL로 3 회, 5 분마다 세척 한 다음 1 시간 동안 실온에서 차단 솔루션 500 μL에 1,000.
  6. 안티 - 페이드 장착 용액 20 μL로 된 커버를 탑재하고 매니큐어와 슬라이드를 밀봉. 2 주 - 즉시 또는 형광 현미경을 사용하여 슬라이드 1 4 ℃로 어둠 속에서 계속 이미지.

본래 미토콘드리아 3. 나트륨 탄산 추출

  1. 섹션 1. 나누기 미토콘드리아에 설명 된대로 수확, PBS로 한번 씻어 미토콘드리아를 분리, 약 20 × 10 7 세포를 성장 두 파에 분리(단계 1.3.4 이전) 미토콘드리아 펠렛 마지막 원심 분리 전에 TS; 반 전체 미토콘드리아 (단계 3.2)로서 사용되는 저장 용해성 막 결합 단백질을 분리하는 (3.3-3.6 단계에 따라) 탄산나트륨 추출 나머지 절반을 사용한다.
  2. 를 Lyse 총 미토콘드리아는 세포 용해 완충액 30 μL로 펠릿 면역에 사용 전까지 -80 ℃로 파쇄물을 저장한다.
  3. 미토콘드리아 펠릿의 나머지 절반에 0.1 M 나트륨 2 CO 3 (소듐 카보네이트), pH가 11.0 250 μl를 첨가하고 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
  4. 20 분 동안 100,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 3.5 단계로 진행합니다. 를 Lyse 단계 1.3.6에서와 같이 세포 용균 및 초음파 처리 완충액 30 μl를 이용하여 펠렛. 면역에 사용 때까지 -80 ℃로 저장합니다.
  5. 침전 된 단백질을 30 분 동안 얼음 위에 유지 상청액에 20 %의 갓 트리클로로 아세트산 (TCA)의 동일 부피를 추가한다.
  6. Centrif10 분 동안 15,000 XG에 UGE. , 상층 액을 버린다 면역에 사용되는 때까지 -80 ℃로 세포 용해 버퍼와 저장소의 80 μL에 펠렛을 녹인다.

미토콘드리아의 내부 및 외부 막 (Mitoplasts의 분리) 4. 분리

  1. 약 20 × 10 7 세포, 수확 성장 PBS로 한번 씻어 (단계 1.3.4 이전) 미토콘드리아 펠렛 마지막 원심 분리 전에 10 등분으로 섹션 1에 별도의 미토콘드리아 분수를 설명한 바와 같이 미토콘드리아를 분리.
  2. 저장성 자당 버퍼의 지정된 농도의 30 μL의 각 펠렛 용해 (1 mM의 EDTA, 10 mM의 MOPS / KOH (수산화 칼륨), pH가 7.2, 자당 농도가 25에 이르기까지 - 음 200) 또는 (/ ㎖ 트립신 50 μg의없이 표 1 참조) 및 얼음에 30 분 동안 배양한다.
  3. t 정지 튜브를 함유하는 트립신 (1 mM의 PMSF를 최종 농도에 도달하는) 10 mM의 PMSF 3 μl를 추가그 트립신 분해하고 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
  4. 10 분 동안 4 ℃로 14,000 XG에 원심 분리기. C. O를 -80 새 튜브에 상청을 전송 단계 1.3.6에서와 같이 세포 용해 완충액 30 ㎕를 초음파 처리에 펠렛을 용균 및 저장

5. 건설 미토콘드리아 타겟 GFP / RFP-태그 CyclinB1 /는 Cdk1 벡터와 그들의 미토콘드리아 현지화의 확인

  1. 및 pEGFP-N1 또는 pER​​FP의 된 NheI과의 BamHI 사이트에서 GFP의 N 말단 또는 RFP에 프레임 - (161 뉴클레오티드 사이의 인간 시토크롬 C 산화 효소 서브 유닛 8A (COX8의 전구체에서 파생 된) 76 MTS) 시퀀스를 대상으로 미토콘드리아를 복제 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 -N1 벡터.
  2. CyclinB1는 Cdk1 및 유전자 PCR 프라이머를 설계 할 때, PCR 프라이머의 5 '(굵게)의 BamHI 제한 효소 인식 부위를 추가한다.
    앞으로는 Cdk1를 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    는 Cdk1를 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG의 CAT CTT CTT AAT CTG ATT 역
    앞으로 CyclinB1를 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    CyclinB1를 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG C​​AC CTT TGC CAC AGC C 역
  3. 표준 기술에 따라 이들 프라이머를 사용 CyclinB1는 Cdk1 및 유전자 증폭. 2 시간 동안 37 ° C에서의 BamHI 제한 효소 1 ㎕를 가진 PCR 산물 다이제스트. 1 % 아가 로스 겔에 소화 제품을 실행합니다. 면도날을 사용하여, 올바른 2N 크기의 DNA 단편을 잘라내어 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 DNA를 정제.
  4. 2 시간 동안 37 ° C에서 MTS-및 pEGFP-N1을 BamHI 및 효소 1 μL와 MTS-pERFP-N1 플라스미드를 1 μg의 다이제스트. 송아지-INTES 1 μl를 추가37 ° C에서 30 분 동안 tinal 알칼리성 포스파타제 (CIP). 1 % 아가 로스 겔상에서 분해 제품을 실행하고 단계 5.3에서와 같이 겔로부터 선형 플라스미드를 정제.
  5. 단계 5.4 단계로부터는 Cdk1 또는 CyclinB1 5 μL에서 리가 아제 완충액 5.3-3 μL, T4 리가 0.5 μL 및 DH 2 O. 20.5 μl를 플라스미드 1 μl를 첨가하여 연결 반응을 설정 4 ° C에서 O / N을 품어.
  6. 10 mg의에 박테리아를 표준 기술에 따라 라이 게이션 혼합물을 10 μL로 대장균 DH5α 적격 세포를 변형 성장 / ㎖ 카나마이신을 함유하는 콜로니를 얻었다 37 ℃에서 LB 아가 플레이트 O / N을.
  7. O에서 식민지를 선택 / 멸균 피펫 팁을 사용하여 N 성장 플레이트, 카나마이신-LB 함유 관의 5 ㎖로 끝을 삽입하고 / N을 O를 품어. 제조사의 프로토콜에 따라 미니 프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 분리하고, 표준 기술을 이용하여 플라스미드를 시퀀싱.
  8. 기하 급수적으로 증가 MCF1를 형질2 (w : V 100 NG (1)의 플라스미드 / 형질 전환 시약 비를 제조함으로써 단계 5.7에서 MTS-는 Cdk1-RFP 또는 MTS-CyclinB1-GFP 플라스미드 0A 세포 (1.5 × 104 세포를 96 웰 플레이트에 시딩) 100 μL의 무 혈청과 항생제가없는 배지에서 0.2 μL).
  9. 조습 (5 % CO 2, 95 % 상대 습도)를 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 48 시간 동안 플라스미드 / 시약 혼합물의 세포를 인큐베이션.
  10. DMSO 100 ㎕에 50 μg의 분말을 용해시켜 미토콘드리아 적색 및 녹색 형광 염료의 1 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. 원액을 희석 1 : 400을 1X PBS 용액으로 2.5 μM 작업을 얻었다. 스톡 용액 년 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  11. 50 nM의 최종 농도를 제조하는 배지 98 μL와 적색 색소의 2.5 μM의 2 μL를 혼합한다.
  12. 적색 염료는 2 분 동안 배지를 함유한다 (단계 5.8에서 생성) MCF10A 세포 담지 CyclinB1-GFP의 세포 배양 배지를 교체. 반복는 Cdk1-RFP 베어링 MCF10A 셀에 대한 녹색 염료와 동일한 절차.
  13. 과잉 염색 액을 없애 96 웰 플레이트에 PBS 1X 100 μl를 추가 100 ㎕를 1 × PBS로 두 번 씻는다.
  14. 그리고는 Cdk1-RFP (565에서 560 nm의 방출에 의해 여기 - 620 ㎚) 40 배 배율에서 형광 현미경으로 96 웰 플레이트에 - 미토콘드리아와 CyclinB1-GFP (536 내지 488 nm의 및 배출 (494)에 의해 여기)를 시각화합니다.

2D-DIGE을 통해 된 유의 인산화 단백질 6. 확인

  1. 샘플 준비
    1. 미토콘드리아를 분리하고 단계 1.3에서와 같이 미토콘드리아 분수를 용균. 15 초 동안 각각의 샘플과 소용돌이에 20 % TCA (물에 트리클로로 산)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 단백질이 용액으로부터 침전으로 30 분 동안 얼음에 샘플을 품어.
    2. 원심 분리기 샘플 다음 5 분 동안 4 ° C에서 9,300 XG, 상층 액을 제거하고 60 μL에게 차가운 아세톤 (100 %)를 추가로5 분 동안 4 ° C에서 9,300 XG에 원심 분리.
    3. 상기 아세톤 세척 단계 (단계 6.1.2)를 한 번 더 반복하여 상층 액을 제거하고 50 ㎕의 DIGE 표식 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % CHAPS, 30 mM 트리스, pH를 8.5)에서 시료를 다시 일시.
  2. 형광 염료를 준비
    1. 주식 솔루션을 준비 : 1 nmol의 / μL의 최종 농도에 신선한 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 5 μL에서 염료 (5 nmol의)를 용해. 몇 달 동안 사용할 때까지 -20 ℃로 주식 염료 용액을 저장합니다.
    2. 작업 솔루션을 준비 : 염료가 5 분 동안 실온에서 설정할 수 있습니다. 200 pmol의 / μL의 최종 농도 DMF의 4 μL와 염료의 1 μl를 희석. 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. 주 : 작업 용액 3 주 동안 -20 ℃로 유지 될 수있다.
  3. 라벨 단백질
    1. 12.5 μg의 단백질 당 염료 용액을 작업의 1 μl를 섞는다. 필요에 따라 확장. 풀링 된 표준의 경우, 6 추가1 단백질을 풀링 300 μg의에 CY2 작업 용액의 리​​터.
    2. 12,000 × g으로 30 초 동안 4 ° C에서 30 초 원심 분리기를위한 소용돌이. 30 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 얼음. 사용 작업 용액 1 μL 당 10 mM의 라이신의 1 μl를 추가하여 표시를 중지합니다. 잘 섞어서 10 분 동안 어둠 속에서 얼음에 품어.
    3. 풀 개별적 샘플을 표지 및 재수 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % CHAPS 1.2 %의 destreak 1 % pharmalytes, 브로 모 페놀 블루)과 혼합한다. 총 부피는 125 μL 될 것입니다.
    4. 소용돌이 30 초 동안 샘플은 샘플을 30 분 동안 RT에서 설정 할 수있다. 로드 7cm의 pH를 4 위에 시료 125 μL - 9 등전 초점 (IEF)을 제거합니다.
  4. 첫 번째 차원 전기 영동
    1. 스트립 홀더가 완전히 깨끗하고 건조 확인하고, 전극 판에 스트립 홀더 (관)을 놓습니다. 전체 관에 걸쳐 균일하게 확산 관에 125 μl의 샘플을 피펫.
    2. tweeze 사용rs는 신중하게, IEF 스트립을 집어 플라스틱 보호 커버를 제거하고 관 / 재수 버퍼로 (아래 겔 쪽)을 배치합니다. 공기 방울을 트래핑하지 마십시오. 천천히 관 채우기 - 미네랄 오일 (1 1.5 ㎖)과 관이 관에 포함 놓습니다.
    3. 표 2의 프로토콜 다음 초점 등전위 시작 :
      주 : 실행이 완료되면, 스트립은 -80 ℃로 플라스틱 튜브에 저장하거나 직접 평형 및 제 치수로 이동 될 수있다.
  5. 두 번째 치수 - 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)
    1. 평형
      1. SDS 평형 완충액 (스트립 당 8 ㎖, 6 M 요소, 30 % 글리세롤, 2 % SDS)를 해동. 디티 오 트레이 톨을 무게 (DTT를, SDS의 평형 완충액 1 ㎖ 당 10 mg을 DTT). 4 ML의 SDS의 평형 버퍼에 DTT를 녹여.
      2. IAA (요오도 아세트 아미드, SDS의 평형 완충액 1 ㎖ 당 25 mg을 IAA)를 달다.4 ML의 SDS의 평형 버퍼에 IAA를 녹여.
      3. 나중에 사용 수욕 오스 용액 1ml를 밀봉 용융.
      4. 스트립이 동결 된 경우, 그들이 완전히 해동 할 수 있습니다. 장소는 reswelling 트레이로 헤어 젤 측면을 제거합니다. 각 스트립에 DTT와 SDS의 평형 버퍼의 4 ML을 추가하고 부드러운 흔들림과 함께 15 분 동안 품어.
      5. DTT 모든 SDS의 평형 버퍼를 따르십시오. 각 스트립에 IAA와 SDS의 평형 버퍼의 4 ML을 추가하고 부드러운 흔들림 또 다른 15 분 동안 품어. IAA 완충액으로 평형화 한 후 SDS 평형 완충액 붓는다.
    2. SDS-PAGE
      1. 미니 젤을 푸는 빗를 제거하고 젤 DDH 2 O와 우물을 씻어 실행하기 전에 젤의 하단에있는 흰색 테이프를 제거합니다. 제대로 겔 스트립의 방향, 젤 방향이 자리 절단 중요합니다.
      2. 최대 작은 접시와 젤 상단에 직면 전자와 카운터에 겔 평면 배치xperimenter. 양극 쪽이 키가 큰 접시에 스트립을 마련 겔의 왼쪽을 향하도록 (++ 바코드로 끝). 자를 사용하여 천천히 겔 표면에 내려 스트립을 밀어 넣습니다. 스트립 겔 사이에 기포를 포착 피한다. 유리 접시 스탠드에서 겔을 세워.
      3. 카세트의 개구에 열 밀봉 아가 액 1ml를 추가한다. 모든 기포가 평평한자를 사용하여 누를되어 있는지 확인합니다. 장치를 조립하고 90 분 동안 일정한 125 V에서 젤을 실행합니다.
      4. 겔 실행이 완료되면,이 용액의 DDH 2 O와 생체 분자 이미 저에 겔을 넣고 635 nm의 여기 레이저 및 665 nm의 방출 필터와 형광 획득 모드에서 겔을 검사한다.
    3. 인 단백질 염색
      1. 회 30 분 동안 50 % 메탄올, 10 % 아세트산의 혼합물 (10 mL)로 겔을 고정한다. 이어서, 90 분 - 10 ml의 60 얼룩 인 단백질로 10 분 동안 물 10 ㎖로 세 번 세척하고 얼룩30 분간 3 회 destain 용액 10 ㎖로 탈색.
      2. 532 나노 미터 / 560 nm의 여기 / 방출에 레이저 젤 스캐너와 함께 젤을 5 분 두 번 10 ml의 물로 세척하고 이미지입니다.
    4. 단백질 소화 및 확인
      1. 소비세 차분 모든 제조 회사의 사양에 따라 로봇 스폿 선택기를 사용하는 마이크로 플레이트 웰에 겔로부터 단백질 스폿을 표현하고, 겔 조각 destain 위해 RT에서 1 시간 동안 100 mM의 중탄산 암모늄 (2 ㎖)을 추가한다. 30 분 동안 진공 농축기에서 두번 세척하고 건조한 2 ml의 100 % 아세토 니트릴로 탈수.
      2. 37 ° C에서 16 시간 동안 50mM의 중탄산 암모늄 13 NG / μL 변성 돼지 트립신 100 ㎕와 겔 조각을 재수. 상층 액을 수집하고 추가로 30 분 동안 50 % 아세토 니트릴 5 % 트리 플루오로 아세트산 100 ㎕로 단백질을 추출합니다.
      3. 진공 원심 분리기의 승낙에 의해 아래로 5 μL에 펩티드를 집중rator 및 레이저 탈착 이온화 보조 매트릭스와 분석 - 비행 시간 - 탠덤 질량 분석 분석 (MALDI TOF-MS / MS) 17.

체외 키나제 분석 7.

  1. 기판의 제조
    1. 유전자 pGEX-5X-1 벡터에 차등 인산화는 Cdk1 대상으로 식별 된 서브 클론 단지 I (CI) 서브 유닛 (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 및 NDUFA12)는, 글루타티온-S-전이 (GST) -tagged를 생성하는 세균의 발현은 11 플라스미드. 아래의 프로토콜 다음 선호도가 높은 글루타치온 열을 사용하여 CI 서브 유닛을 정화.
      1. 문화 0.6에 도달 할 때의 광학 밀도 (OD)까지 루리아 - 베르 타니 (LB) 37 ℃로 셰이커 암피실린 50 ㎍ / ㎖의와 국물에 대장균 균주 BL-21를 포함하는 CI 서브 유닛을 GST는 태그가. 숭배에 이소 프로필 BD-티오 갈 락토 (IPTG)를 추가0.1 mM의 최종 농도 URE하고 추가 3 시간 동안 배양한다.
      2. 박테리아를 수집하고 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 5 DTT 5 밀리미터, 1 개 단백질 분해 효소 억제제 칵테일을 포함하는 1 × PBS 버퍼 ml의 0.1 %의 리소자임을 다시는 일시 중지합니다. 를 Lyse는 스물 다섯 버스트의 초음파에 의한 세포 및 10 분 동안 600 × g으로 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다.
      3. 상등액을 모아서 4 부피비 글루타티온 아가 4B 비드 부화 : RT에서 1 시간 동안 (비드 상등액 1).
      4. 글루타티온 용출 완충제 3 mL로 비드로부터 GST 융합 단백질을 용출 (분자량 컷 - 오프 (12)의 분자 다공성 멤브레인 튜브로 투석 용출 된 단백질 (10 밀리에 50 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 환원 된 글루타티온) 및 제목 1 × PBS / 1 mM의 EDTA와 -14 킬로 달톤). 80 C. -에서 정제 된 단백질을 저장
  2. CDK1 키나제 분석
    1. 키나제 엉덩이를 시작하기 전에AY, 30 ° C, 100 ° C까지 가열 블록을 설정한다. 해동 상업 CyclinB1 /는 Cdk1 효소 복잡하고 얼음에 기판.
    2. 얼음에 반응 믹스를 준비합니다. 32 P ATP 동위 원소가 포함되어 있기 때문에, 방사능의 확산을 방지하는 O 링을 포함하는 스크류 캡을 1.5 mL의 샘플 튜브에있는 모든 반응 혼합물을 준비한다.
      주의 : 방사성 물질 보호 규칙을 따르십시오. 적어도 팔의 길이에 8 mm 두께의 차폐 플렉시 글라스 작업을 사용합니다. 물에있는 오염 된 지역을 닦습니다.
    3. 1 X는 Cdk1 완충액 (50 mM Tris-HCl, 10 mM의 MgCl2를, 2 mM의 DTT, 1mM의 EGTA, 0.01 % 브리지 (Brij) 35의 pH 7.5), 0.6 mM의 콜드 ATP, 0.1 μCi를 32 P의 ATP를 함유하는 30 ㎕의 반응 완충액을 준비 이 CyclinB1 / 단위는 Cdk1 및 기판 (6) μg의 단백질. DDH 2 O 30 μL에 볼륨을 조절 양성 대조군 반응 0.01 mM의 히스톤 H1, 공지 CyclinB1 /는 Cdk1 기판과 기판을 교체한다.
      1. 부정적인 contro에 대한(L)의 반응은, (1)의 GST 단백질 만 (2) + 0.5 μM의 RO-3306 0.01 mM의 히스톤 H1, 선택적 억제제는 Cdk1 기판을 대체하여 기판을 대체.
    4. 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 모든 액체를 가지고 피펫과 원심 분리기와 잘 섞는다. 60 분 동안 30 ° C에서 품어.
    5. 반응을 중지하고 10 분 동안 100 ℃로 변성 5 배 SDS 샘플 버퍼 6 μl를 추가합니다. 2 시간, 160 V에서 10 % SDS-PAGE 겔상에서 샘플을 실행하거나 염료 앞까지 겔의 끝에 도달한다. 크로마토 그래피 용지에 젤을 전송하고 플라스틱 포장으로 포장.
      주의 : 방사성 동위 원소와 접촉의 모든 액체 방사성 폐기물로 처리 제도적 지침에 따라 환경 보건 및 안전 서비스를 제공하는 5 갤런 폴리 상자 속에 든 대형 유리 병에 폐기해야합니다.
    6. 1 일 X 선 필름에 젤을 노출 또는 방사성 동위 원소의 특정 활동에 따라 일주까지 -20 O를 C 사용효소.

8. 부위 특이 적 변이는 지배적 인 부정적인는 Cdk1 (D146N)를 생성하는

  1. 설계 돌연변이 유발 프라이머; 서로 상보적인 두 프라이머는 돌연변이 위치를 포함하는 각면 (11)에베이스 (20)에 의해 측면 (G는 N 대신 D 아미노산을 위해 코딩 핵산으로 대체 될 것이다).
  2. 50 μl를 중합 효소 연쇄 반응 1X 반응 버퍼를 포함 (PCR) 혼합물, 2.5 밀리미터의 dNTPs, 10 프라이머 μM (순방향 및 역방향), 템플릿 (40) NG, 그리고 DDH 2 O. 준비 반응으로 DNA 중합 효소의 2.5 U를 추가합니다.
  3. 다음 PCR 프로그램 실행 : 95 ° C 3 분, 95 ° C 30 초, 55 ℃ 30 분, 68 ° C 6 분; 16 사이클 (주 : 68 ° C 배양 시간은 DNA의 크기에 의해 결정되는 1 분 / KB 10 KB ≤ DNA에 필요한 큰 DNA 2 분 / KB 플러스 사이클 당 10 초..). 68 ° C 7 분에 의해 따라 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 개최합니다.
  4. 더하다내가 버퍼 DPN I 제한 효소 (10 U / μL) 5.7 ㎕를 DPN의 2 μL는 손가락으로 부드러운 탭과 ​​잘 혼합하고 1 시간 동안 37 ℃로 반응을 품어.
  5. 이전 10 μL DPN 변혁 DH5α 적격 세포를 50 ㎕의 PCR에 제품 I는 처리. 42 O C에서 45 초 열 충격에 의해 다음에 30 분, 그리고 얼음에 5 분간 얼음에 품어. LB 500 μl를 추가하고 LB 한천 플레이트에 도금하기 전에 1 시간 동안 37 O C에서 흔들. 37 ℃에서 O / N을 품어
  6. O에서 식민지를 선택 / N은 멸균 노란색 피펫 팁을 사용하여 한천 플레이트 성장, LB 5 ㎖를 포함하는 튜브에 팁을 삭제하고 37 O를 C 통에 O / N을 성장. 미니 프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 분리하여 제조사의 프로토콜에 따라 변이를 확인하기 위해, 플라스미드를 시퀀싱.

에듀 설립 분석과 세포주기 단계 길이 9. 결정

  1. 셀 정렬
    1. TRansfect 지정된 벡터와 2 × 10 5 세포 (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP /는 Cdk1 - 중량 - RFP 또는 MTS-는 Cdk1-DN-RFP) 1를 사용하여 6 웰 플레이트 : 2 (W : V 2.5 μg의 : DNA의 5 μL) 비율 : 형질 시약 48 시간 동안 2.5 ml의 무 혈청과 항생제없는 배지에 혼합 준비했다. 라이브 종류의 세포는 안정적으로 사이토의 흐름을 통해 GFP - 태그는 Cdk1 및 RFP-태그 CyclinB1 단백질을 표현.
      1. , 1 × PBS로 세포를 씻어 접시에 트립신의 100 μl를 추가하고 5 분 동안 37 ℃로 배양한다. 세포를 수집하여 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 70 ㎛의 필터를 통해 통과하는 배양액 2 ㎖를 추가한다. 사이토의 흐름에 그들을로드하기 전에 PBS (FCS / PBS)을 1 % 태아 송아지 혈청 500 μL와 단일 세포 현탁액을 씻으십시오.
      2. 설립 프로토콜을 GFP 및 RFP 모두 염색 더블 양성 세포 18 게이팅을 다음 정렬 매개 변수를 설정합니다. 정렬 된 세포는 튜브 contai에 사이토 나오는 수집합니다닝 세포 배양 배지 및 프로토콜과 9.2 듀 펄스 - 체이스 라벨링 세포주기 진행의 분석을위한 이들 세포를 사용한다.
  2. 에듀 라벨 유동 세포 계측법의 분석을 사용하여 세포주기 길이의 측정
    1. CO 2 배양기에서 37 ℃로 잘 문화 O / N 당 2.5 × 10 5 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에서 씨앗 정렬 세포. 25 μM의 최종 농도로 배양 배지에 추가 듀. 1 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 O C에서 품어.
    2. 500 ㎕의 PBS에 1 % BSA와 세포를 씻으 10 총 2 시간 간격으로 1.5 ML 튜브에서 그들을 수집 - 12 시간.
    3. 원심 분리기 세포는 5 분 동안 350 XG에서, 상층 액을 버린다. RT에서 15 분 동안 (EDU 라벨링 키트 내에 제조업체에서 제공) 정착 용액 100 μL를 첨가하여 펠렛을 제거하고 잘 혼합한다.
    4. PBS 세 번에 1 % BSA 1 ml의 세포를 씻으십시오. 수정세포를 다시 4 O C. 70 % 에탄올의 O / N 0.5 mL를
      참고 : 에탄올 고정 인해 재조합 태그가 단백질 발현에 내부 GFP / RFP 형광을 해소하는 것이 중요합니다.
    5. 5 분 350 XG에 다시 세포를 원심 분리기 번 PBS 1 ml의 1 %의 BSA와 펠렛을 씻는다. RT에서 20 분 동안 permeabilization 완충액 (PBS 중 0.1 % 트리톤 X-100, 1 % BSA, 0.2 ㎎ / ㎖의 RNase A) 1 ㎖에 세포를 다시 일시.
    6. 한 번 PBS에 1 % BSA 1 ml의 세포를 씻으십시오. 각각의 튜브에 반응 칵테일 0.5 mL를 넣고 잘 섞는다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
    7. PBS 1 ml의 1 %의 BSA 50 μg의 / ㎖ 프로피 디움 요오드 (PI) 1 번 PBS에 1 % BSA ㎖의 얼룩 DNA로 씻으십시오.
    8. 에듀 양성 인구를 따라 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. DNA 콘텐츠를 염색 에듀 표지 세포 (PI 염색, X 축)와 EDU (알렉사 647 염색, Y 축)의 현재 분산 도트 플롯.
      1. 알렉스을위한 APC 채널을 사용하여모든 빛 현재와 해당 필터 타격 미만 685 nm의 30분의 670 대역 통과 필터를 이용 a647-EDU; 모든 빛을 본 그 필터를 타격 미만 600 nm의와 그것의 앞에 15분의 581 대역 통과 필터와 PI 및 피코 에리 트린 (PE) 채널.
      2. 유동 세포 계측법에 제 1 튜브 포함하는 셀을 삽입하고 취득을위한 표준 게이트 전략을 사용 : 세포 얼룩에 대한 PI (PE 채널) 다음 형태 X Alexa647-EDU (APC 채널)에 대한 플롯 FSC-지역 X SSC-지역. 모든 튜브 샘플 10,000 이벤트를 취득 하나 하나 녹음 데이터.
      3. 확립 프로토콜 11,30 다음 데이터 분석 소프트웨어 유세포를 사용 세포 상 길이의 세포주기 위상 분포를 결정한다.

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Representative Results

CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화

탄산나트륨 추출 단백질이 미토콘드리아의 내부 또는 외부 표면, 즉, 외막에 위치하는지 여부를 결정하는데 사용된다. 단백질이 미토콘드리아 안에 지역화 도시되면 서브 미토콘드리아 지역화 상기 판정 프로테아제 소화 결합 mitoplasting 통해 이루어질 수있다. CyclinB1 또는는 Cdk1의 서브 미토콘드리아 현지화를 지정하려면 mitoplasts 25 밀리미터에 200 밀리미터의 삼투압 자당의 농도를 감소와 저장성 버퍼의 미토콘드리아를 희석하여 분리 하였다. 내막은 자당의 25 mM의 (그림 1A)의 최종 농도가 될 때까지 그대로 유지하면서 외막은 자당 150 밀리미터에서 파열하기 시작합니다. mitoplasting와 조합 프로테아제 보호 tryps 분석법을 사용하여 수행 될 수있다의 외부 막 파열 다음 노출 된 단백질을 소화한다. 이 막간 공간 단백질의 소화가 발생합니다. 관심의 단백질을 트립신 소화로부터 보호되는 경우,이 단백질의 미토콘드리아 매트릭스 현지화를 나타낸다. 이 도면에서 대표적인 미토콘드리아 매트릭스 단백질 Hsp60에 한 막간 공간 단백질 Timm13는 서브 미토콘드리아 파악 마커로서 사용 하였다. Hsp60에와 있지만 Timm13, CyclinB1과는 Cdk1 달리 유사은 자신의 미토콘드리아 매트릭스 현지화 (그림 1B)를 나타내는, 트립신 소화으로부터 보호 하였다.

MTS- 및 GFP - 태그 CyclinB1과는 Cdk1 단백질의 미토콘드리아 식

MTS는 C 말단에 GFP 또는 RFP 태그가 CyclinB1는 Cdk1 또는 유전자의 N 말단에서 프레임 클로닝된다. 생성 된 재조합 단백질은 GFP- 또는 RFP-태그 사이 영상 미토콘드리아 타겟이다clinB1 또는는 Cdk1. 생성 본 연구에 사용 된 구문 목록이 도시​​되어있다. 이러한 구조 달성 된 미토콘드리아에서 CyclinB1 및 / 또는는 Cdk1의 과잉 발현, 분리 된 미토콘드리아 분획의 서쪽 블로 팅에 의해 여기에 표시된 (그림 2)를 사용.

2D-DIGE에 의해 결정 CyclinB1 /는 Cdk1의 잠재적 인 미토콘드리아 대상

CDK1은 (P)를 프롤린하는 ATP에서 인산의 이동을 촉진 키나제 가족이 S 또는 T 잔류 물을 배향 세린 / 트레오닌 (S / T)에 속한다. 는 Cdk1 (D146N)의 위치 (146)에 아스파라긴 (N)와 아스 파르 테이트 (D) 잔류 물을 대체하는 점 돌연변이는 지배적 인 부정 (DN)는 Cdk1 돌연변이 (19)를 생성한다. 미토콘드리아는 Cdk1의 기능을 연구하기 위해 미토콘드리아 타겟팅는 Cdk1-DN 단백질은 플라스미드 구축에 의해 생성 된 (pERFP-N1-MTS-는 Cdk1-DN) 29 아미노산 경도를 포함RFP-태그 DN-는 Cdk1에 연결된 인간 사이토 크롬 C 산화 효소의 보조 유닛 VIII로부터 유도 g의 미토콘드리아 타겟팅 서열 (MTS). 미토콘드리아 타겟팅 ERFP 단백질 생산 pERFP-N1-MTS는 빈 벡터 대조군으로 사용 하였다. G2의 미토콘드리아 phosphoproteins은 / 모두 제물로 형질 M 세포의 pH 4-10 겔 스트립 2D 젤 분석을 프로파일 하였다. 빈 벡터 형질 (그림 3, 상단 패널)에 비해 미토콘드리아 phosphoproteins의 그룹은 분명히 결석 또는는 Cdk1-DN 형질 (그림 3, 낮은 패널) 감소 하였다. 검출 된 스폿의 질량 분석 분석 미토콘드리아는 Cdk1 의해 인산화 단백질의 아이덴티티를 결정.

듀 펄스 체이스 분석과 상 길이의 세포주기 진행과 결정

세포주기 갔지의 진행을 알아보고자N 미토콘드리아 CyclinB1은 /는 Cdk1 수준 증가, 티미 딘 유사체를 사용하여 펄스 - 체이스 표지 실험은,에 티닐 우리 딘 (EDU)은 DNA 합성 (20)을받는 세포 집단 라벨을 수행 하였다. 이 방법은 세포가 S 및 G2 / M 단계를 통해 진행하고 G1 단계에서 축적 할 때 에듀 양성 인구를 추적하여 22 시간 창을 통해 촬영 된 세포주기의 시각화 할 수 있습니다. 결과는 벡터 제어 돌연변이 CyclinB1 / 형질 세포에서 6 시간에 비해 표시된 S 상 세포, G2 / M 단계를 통해 진행하고 야생형 미토콘드리아 CyclinB1 /는 Cdk1를 발현하는 세포에 4 시간만큼 빠르게 G1 단계에서 나타난 보여 CDK1 (도 4a), 미토콘드리아 CyclinB1의 향상을 나타내는 /는 Cdk1 세포주기 진행을 가속화.

그림 1
그림 1. 미토콘드리아 CyclinB1 / mitoplasting 및 단백질 분해 효소 보호 분석법에 의해 검출 된 매트릭스. (AB) CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화에는 Cdk1 지역화는 그림은 왕 외. 201411에서 수정되었습니다. 합계 (T), 펠릿 (P) 및 상청액 (S) 분획을 나타낸 항체 웨스턴 블롯 분석을 실시 하였다. TIMM13 (간 공간 단백질), 및 HSP60 (매트릭스 단백질). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
미토콘드리아는 Cdk1를 구축 그림 2. 식입니다. 미토콘드리아 타겟 CyclinB1 및 / 또는 야생형 또는 지배적 인 부정적인 돌연변이는 Cdk1로 형질 세포에서 분리 된 미토콘드리아 분획의 웨스턴 블로 팅은 (플라스미드가 표시됩니다 하단 11. 및 pEGFP-N1-MTS와 pERFP-N1-MTS 벡터가 각각 MTS-CyclinB1 및 MTS-는 Cdk1) 빈 벡터 제어했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3.는 Cdk1의 잠재적 인 미토콘드리아 기질. 미토콘드리아 타겟 빈 벡터 (pERFP-N1-MTS, 상단 패널) 또는 돌연변이는 Cdk1 (pERFP-N1-MTS-는 Cdk1-DN로 형질 G2 / M-정점 세포에서 추출한 미토콘드리아 단백질, 하부 패널)의 2-D 겔에 의해 분리하고 인산화 단백질 인 단백질 색소 (적색)로 염색하고, Cy5에 (녹색)로 표지 하였다. 이 수치는 왕 외. 2014 11에서 수정되었습니다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 미토콘드리아는 Cdk1 강화합니다의 G2 / M 전환 및 전체 사이클 진행.
듀 펄스 추적 라벨과 세포주기 분석. 에듀 표지 세포의 분산 형 플롯 히스토그램은 DNA 함량 (X 축)와 EDU (Y 축)에 대해 그려졌다. 각 패널의 낮은 수치는 EDU의 평균 형광 강도가 핵을 표시 보여줍니다. 시점은 에듀 펄스 (11) 후 시간에 표시했다. 모든 시점 들어, 다음 인구를 표시 게이트 그려진 : G0 / G1, S, 및 G2 / M을. 6, 8, 및 10 시간 시점 들어 EDU-는 G1 *를 S / G2에 * 및 G2 / M *의 인구가 도시되어 표지. 이 수치는 왕 등의 알에서 수정되었습니다. 2014 년 11. 를 클릭하십시오여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

사용 자당 농도
어떤 트립신 없습니다 25 mM의 50 mM의 100 밀리미터 150 밀리미터 200 밀리미터
+ 트립신 25 mM의 50 mM의 100 밀리미터 150 밀리미터 200 밀리미터

단계 4.2에 사용되는 표 1. 저압 성 자당 버퍼

1 단계 30 V 12 시간 단계 및 보류
2 단계 300 V 0.5 시간 단계 및 보류
3 단계 1000 V 0.5 시간 구배
5000 V 1.33 시간 구배
5 단계 5000 V 20,000 V의 시간 단계 및 보류

표 2 등전 프로토콜 단계 6.4.5에 사용

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Discussion

다른 세포 내 소기관으로 향하는 단백질 마찬가지로 미토콘드리아 표적 단백질은 정교한 단백질 전좌 접지기 (21, 22)의 도움 소기관에 직접 일차 또는 이차 구조 내의 표적 신호를 갖는다. 이러한 COX8 같은 독점적으로 미토콘드리아 상주 단백질에서 얻은 시퀀스 (MTS)을 대상으로 미토콘드리아는 미토콘드리아 11,23,24에 특정 단백질을 대상으로하는 유전자 서열의 N 말단에 추가 할 수 있습니다. 여기에, CyclinB1과는 Cdk1 유전자 벡터를 포함 COX8의 MTS에 표현에 복제하고, 재조합 CyclinB1과는 Cdk1는 미토콘드리아로 현지화되었다. 이 방법의 장점은 전체 유전자의 발현을 변경하지 않고,이 경우 미토콘드리아에, 특정 서브 - 세포 구획에서 유전자 발현의 변형을 가능하게한다는 것이다. 이 전략으로, 미토콘드리아 특정 핵 키나제의 기능은는 Cdk1는 해제되었다termined. 마찬가지로 우성 네가티브는 Cdk1에 MTS를 추가하여, 아래는 Cdk1의 미토콘드리아 특정 기능 노크 미토콘드리아는 Cdk1 특정 대상의 식별을 허용하고는 Cdk1 기능 미토콘드리아 부재 기능적 결과의 분석을 가능하게하는, 달성 하였다. 따라서 미토콘드리아 및 핵 모두는 Cdk1의 강화 된 표현의 MTS 태그 결과를하지 않고는 Cdk1의 과발현, 그리고는 Cdk1의 미토콘드리아 특정 행동의 결과의 추가 조사를 복잡하게한다.

우리는 MTS 태그의 첨가를 통하여 미토콘드리아에 약간의 키나제 색에 몇 시도 실패를 경험하지만,이 방법은 모든 유전자 산물에 적합하지 않을 수있다. 일부 세포주에 형질 매우 저항성 일 수 있고, 최적의 프로토콜을 찾는 것은 시간 소모적 일 수있다. 세포가 건강하고, 형질 전환 형광 태그 단백질과 협력, 성공적인 경우에도 몇 가지 문제 SUC 전시집계, 잘못된 현지화, 비 기능 융합, 약한 신호와 같은 시간.

미토콘드리아와 mitoplasts의 분리의 주요 제한은 다른 세포 또는 하위 미토콘드리아 구획의 낮은 수율 및 오염 가능성을 포함한다. 이 부착 세포가 어려운 접착 세포 배양에서 미토콘드리아 높은 수량을 얻을 수있다, 따라서, 종래의 화학적 또는 기계적 방법에 의해 효율적으로 파열되지 않는 것을 제안한다. 여기, 우리는 MCF10A 세포의 부착 문화를 활용. 수득 약 30 - 50 μg의 미토콘드리아 단백질, (3)의 출발 량 - 5 X 107 세포를 사용 하였다. 균질화 단계는 미토콘드리아 준비의 최종 수율에 대한 또 다른 중요한 포인트입니다. 사용되는 세포주에 따라 스트로크 및 / 또는 균질화 시간의 수는 달라질 수있다. MCF10A 세포, 우리는 유리 / 유리 호모 게 나이저에 의해 균질의 10 분간이 필요한 것으로 관찰하면서 마우스 배아 fibrobla균질화의 5 분 - STS (MEF)는 만 3 필요합니다. 과도한 균질화가 미토콘드리아 막에 손상을 줄 수 있으며 미토콘드리아 성분의 방출을 유발할 수 있기 때문에, 각각의 세포주에 대한 표준 조건은 경험에 의해 결정되어야한다. 유리 - 유리 균질화 기의 사용은 유리 / 테플론 균질 비교 미토콘드리아 제제의 수율을 증가시킨다. 시작 세포의 양뿐만 아니라 세포의 동결 / 해동 오픈 세포를 파괴하는 데 필요한 스트로크의 수를 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질의 변성과 응집 인해 균질화 동안 샘플의 국부 가열에 발생할 수있다. 그것은 조직 분쇄기를 미리 진정이 절차를 수행하는 동안 얼음에 샘플을 유지에 따라서 필수적이다.

이 문서에서 제시하는 다른 방법은 실시간으로 세포주기를 모니터링 듀 라벨의 사용이다. EDU는 형광 밝은, 광 안정성 알렉사 플 루어 염료로 표지 된 수정 티미 딘 아날로그입니다. EDU는 effi입니다ciently 새로 합성 된 DNA에 통합. 이 방법은 뉴 클레오 시드 유사체, 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 세포 증식의 전통적인 표지의 사용에 더 나은 대안이다. BrdU의 활성 DNA 합성 동안 DNA에 포함된다. BrdU의 표지 DNA의 정량은 BrdU의 항체 결합에 대한 BrdU의 분자를 노출하는 높은 열 또는 높은 산도 상대적으로 가혹한 방법으로 DNA 변성이 필요합니다. DNA 변성의 가혹 샘플의 품질에 영향을주는 시간이 걸리고있다. 듀으로 세제 permeabilization는 DNA에 액세스하는 듀 검출 시약 일반적으로 충분하다. DNA 액세스 가혹한 화학 또는 열을 사용하지 않고도, 듀있어서 사용하기 쉽고보다 정확하게 일치한다. 그렇다 EDU 제공 이점에서 증식 공부 듀의 사용과 관련된 몇 가지 문제가 있었다. 듀 negl로 감소 될 수 72 시간 이상의 치료에서 약간의 항 증식 활성을 보였다igible 레벨 듀 펄스는 1 시간 25 ℃로 유지했을 때.

에듀 라벨로 사용 하나 수정은 고정 시간과 방법이다. 이 키트는 제공하는 고정 솔루션으로 15 분 고정을 제안했다. 그러나, 70 % 에탄올로 추가 고정은이 실험에 이용 하였다. 셀마다 2 시간을 수집하고, 시간 점 실험을 수행 하였다 1) 시간에 따른 세포주기 진행을 따르는 에탄올의 이용에는 두 가지 이유가있다. 세포 실험 시점이 모두 완료 될 때까지 4 O C에서 70 % 에탄올에 보관 하였다. 필요하다면, 실제로 세포 (개월 몇 주) 이상 70 % 에탄올로 유지 될 수있다. 2) 실험에 사용 된 세포는 안정적 GFP-태그는 Cdk1 및 / 또는 RFP-태그 CyclinB1로 형질 감염시켰다. GFP / RFP 형광로부터 EDU와 PI 신호를 분리하기 위해, 에탄올 고정는 GFP 및 RFP 단백질 변성, 따라서 듀를 수행하기 전에 자신의 형광을 소멸하기 위해 이용 된D PI 염색. 변성 GFP / RFP 단백질 본질적 완전히 비 - 형광 발색단 (26, 27)이 더 이상 담금질로부터 보호 아마도 때문이다.

미토콘드리아는 Cdk1의 타겟을 식별하기 위해 다양한 방식으로 기존의 2 차원 겔에 우수한 2D-DIGE 방법을 사용 하였다. 예를 들면, 2D-DIGE 뚜렷한 형광 염료, 사이클 3, 5, 2에서는, 한 겔 3 샘플까지 실행 표준 2D 겔처럼 복제를 실행할 필요없이 변동을 감소 허용 라벨 샘플로 사용된다. 2D-DIGE에 사용되는 형광 염료는 높은 자리 해상도와 함께, 2D-DIGE 겔 실행 단백질의 적은 양이 필요 따라서 100 NG / 자리에서 트리 페닐 메탄 염료에 비해 0.2 NG / 스팟의 매우 높은 감도를 가지고 출판 품질 겔 검색합니다. 자동화 된 소프트웨어가 감지 정량화 및 차등 발현 된 단백질을 정의하는 데 사용됩니다. 때문에 높은 자리 해상도, 샘플의 단백질 발현을 차등 캘리포니아n은 소프트웨어를 이용한 현장 정량을 사용하여 정확하게 비교; 10 %의 낮은 차이가 쉽게 번역 후 변형의 시각화를 가능하게 2D-DIGE 통해 검출 될 수있다. 의 사용 - 겔 분석은 또한 데이터의 빠른 수집을 가능하게 소프트웨어를 주었. 그러나, 장비 있기 때문에, 형광 스캐너로, 이미지 수집에 필요한이 방법의 사용은 추가 비용을 포함한다. 2D-DIGE의 다른 제한은 극단적 인 등전점 큰 분자량 28, 29와 가난한 소수성 단백질의 표현뿐만 아니라 단백질을 포함한다. 이러한 면역 세포 화학 또는 웨스턴 블롯과 같은 대체 기술을 사용하여 2 차원 DIGE 얻어진 결과의 추가 확인은 신규 발견을 확인하기 위해 필요하다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

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References

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실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는
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Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

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