Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

У млекопитающих, прогрессию клеточного цикла зависит от высокоупорядоченных событий , контролируемых циклинов и циклин-зависимых киназ (CDKS) 1. Благодаря его цитоплазматическом, ядерной и центросомной локализации, CyclinB1 / Cdk1 способен синхронизировать различные события в митозе , таких как пробой ядерной оболочки и центросом разделения 2. CyclinB1 / Cdk1 защищает митотических клеток от апоптоза 3 и способствует митохондриальной деления, критический шаг для равномерного распределения митохондрий вновь образованных клеток дочь 4.

В пролиферирующих клетках млекопитающих митохондриальной АТФ генерируется с помощью окислительного фосфорилирования (OXPHOS) машины (цепи переноса электронов), который состоит из 5 из множества субъединиц комплексов; Комплекс I - комплекс V (CI-CV). Никотинамидадениндинуклеотид (NADH): убихинон оксидоредуктазы или комплекс I (CI) является самым крупным и наименее изученной из пяти комплексов 5. Комплекс сonsists из 45 субъединиц, 14 из которых образуют каталитическую сердцевину. После сборки, комплекс предполагает L-образную конструкцию с одной рукой , выступающая в матрице , а другой рукой внедренного во внутреннюю 6,7 мембраны. Мутации в CI субъединиц являются причиной множества митохондриальных нарушений 8. Функционально эффективность CI в OXPHOS требуется не только для общего митохондриального дыхания 9, но и для прогрессии цикла успешно клеток 10. Unravelling механизмы, лежащие в основе функционирования этой мембраносвязанного ферментного комплекса в отношении здоровья и болезни может способствовать разработке новых диагностических процедур и передовых терапевтических стратегий. В недавнем исследовании мы обнаружили, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии в G2 (митоза) M фазы (Gap 2) / и фосфорилирует CI субъединиц для расширения производства митохондриальной энергии, потенциально, чтобы компенсировать повышенные энергетические потребности клеток во время клеточного цикл 11. Здесь мы шоwcase экспериментальных процедур и стратегий, которые могут быть использованы для изучения митохондриальной транслокацию в противном случае ядерных / цитоплазматические киназ, их митохондриальных субстратов, а также функциональные последствия их митохондриальной локализации с использованием CyclinB1 / Cdk1 в качестве примера.

К выводу, что CyclinB1 / комплекс Cdk1 транслоцируется в митохондрии при необходимости побудила исследования митохондриальной специфических оверэкспрессии и нокдаун этого комплекса. Для достижения митохондрии специфических экспрессию белков, можно добавить последовательность митохондрии ориентации (MTS) в N-конце белка, представляющего интерес. Митохондрии таргетингом последовательности позволяют сортировку митохондриальных белков в митохондрии , где они обычно проживают 12. Мы использовали таргетирования последовательность 87 оснований митохондрии, полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидазы субъединиц 8А (COX8) и клонируют его в зеленый флуоресцентный белок (GFP) -tagged CyclinB1 или красный флуоресцентныйПротеин (ЗП) -tagged Cdk1, содержащих плазмид в кадре. Этот метод позволил нам целевой CyclinB1 и Cdk1 в митохондрии, в частности, изменение митохондриальной экспрессии этих белков, не затрагивая их ядерный пул. По флуоресцентно мечения эти белки, мы были в состоянии контролировать их локализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы ввели MTS в плазмиду, содержащую RFP-меченый доминирующим отрицательным Cdk1, что позволило нам конкретно сбить митохондриальную экспрессию и функции Cdk1. Важно различать митохондриальных и ядерных функций киназ, которые имеют двойное локализаций как Cdk1. Инжиниринг МТС в N-терминала этих двойных функциональных киназ предлагает большую стратегию, которая легко использоваться и эффективно.

Поскольку Cdk1 является клеточного цикла киназы, она имеет фундаментальное значение для определения прогрессии клеточного цикла, когда Cdk1 локализована в митохондриях. Для достижения этой цели мы использовали новую метоd контролировать содержание ДНК в клетках. Традиционные методы включают использование BrdU (бромдеоксиуридина), синтетический аналог тимидина, который встраивается в вновь синтезированной ДНК в фазе S клеточного цикла, чтобы заменить тимидина. Затем клетки, которые активно дублирующие их ДНК могут быть обнаружены с помощью анти-BrdU антителами. Одним из недостатков этого способа состоит в том , что она требует денатурации ДНК , чтобы обеспечить доступ к антителу BrdU с помощью жестких методов , таких как кислоты или термической обработки, что может привести к несоответствию между результатами 13,14. В качестве альтернативы, мы использовали аналогичный подход для наблюдения за активно делящиеся клетки с различным аналоговым тимидина, Эду. Обнаружение Эду не требует резкой денатурации ДНК, как мягкая обработка моющее средство позволяет реагент обнаружения для доступа к Эду во вновь синтезированной ДНК. Метод Эду оказался более надежным, последовательным и с потенциалом для анализа с высокой пропускной способностью 15.

И, наконец, тO определяют митохондриальных субстратов Cdk1, мы использовали инструмент под названием протеомики 2D-ПГЛП, который является продвинутой версией классического двухмерным электрофорезом в геле. Двумерный электрофорез разделяет белки по их изоэлектрической точке в первом измерении и молекулярной массой во второй. Так как пост-трансляционной модификации, такие как фосфорилирование влияет на изоэлектрической точки и молекулярную массу белков, 2D гели могут обнаружить разницу между фосфорилирования статусов белков в составе различных образцов. Размер (площадь и интенсивность) белка видит изменения с уровнем экспрессии белков, что позволяет количественное сравнение между несколькими образцами. Используя этот метод, мы смогли дифференцировать фосфорилированные белки дикого типа в сравнении с мутантным митохондрии, ориентированных CDK1 экспрессирующих клеток. Специфические белковые пятна, которые показали в дикого типа, но отсутствовавшие в митохондриях таргетингом мутантного препарата CDK1 были выделены иидентифицировали с помощью масс-спектрометрии.

В традиционных 2D-гелей, Трифенилметановые красители используются для визуализации белков на геле. 2D-ПГЛП использует флуоресцентный белок этикетки с минимальным влиянием на электрофоретической подвижности белка. Различные образцы белка могут быть помечены различными флуоресцентными красителями, смешивались и разделенных одинаковыми гелями, что позволяет совместное электрофорез нескольких образцов на одном геле 16. Это минимизирует гель-на-гель вариаций, что является серьезной проблемой в гель на основе протеомики исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Выделение Митохондрии из культивируемых клеток

  1. Получение изоляции буфера для клеток (IBC) буфера
    1. Готовят 0,1 М Трис / МОПС (трис (гидроксиметил) / 3- (N -morpholino) пропансульфокислоты): Растворить 12,1 г Трис в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью MOPS порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объем 1 л и хранить при температуре 4 ° С
    2. Готовят 0,1 М EGTA (этиленгликоль-бис (2-аминоэтил эфир) этилендиаминтетрауксусной кислоты) / Трис: Растворить 38,1 г EGTA в 800 мл дистиллированной воды, довести рН до 7,4 с помощью Tris порошок, добавляют дистиллированную воду до общего объема 1 л и хранить при температуре 4 ° С.
    3. Готовят 1 М сахарозе: Растворить 34,23 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды, делают по 20 мл аликвоты и хранят при -20 ° С
    4. Подготовьте IB гр буфера: Приготовить 100 мл IB C буфер добавлением 10 мл 0,1 М Трис / MOPS и 1 мл 0,1 М EGTA / Трис до 20 мл; 1 М сахарозы. Добавить дистиллированную воду до общего объема 100 мл. Регулировка рН до 7,4.
  2. Подготовка буфера для лизиса клеток
    1. Подготовка буфера для лизиса, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (этилен диамино этилендиаминтетрауксусной кислоты), 1 мМ EGTA, 1% Тритон-Х-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β- глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия. Добавить ингибиторы протеиназы 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) непосредственно перед использованием.
  3. Выделение Митохондрии
    1. Урожай 3 х 10 7 клеток охлажденным льдом 1x PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), рН 7,4 и центрифугируют клетки при 600 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера И.Б. гр.
    2. Перемешать клеток с использованием измельчителя ткани стекло / стекло в течение примерно 10 мин. Передача гомогената в 15 мл пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мильп при 4 о С. Для функционального митохондриях, используйте стекло / тефлоновую муфту, как это менее вредно для митохондрий, чем мясорубки ткани стекла / стекла.
    3. Соберите супернатант в 1,5 мл пробирки и центрифуге при 7000 мкг в течение 10 мин при 4 о С. Передача супернатант в 1,5 мл пробирку и сохранить как цитозоле белка.
    4. Промывают осадок (митохондрии) дважды 200 мкл охлажденного льдом буфера IB гр и центрифуге при 7000 х г в течение 10 мин при 4 о С.
    5. Удалите супернатант и повторно приостанавливать осадок в буфере для лизиса клеток и использовать его сразу или хранить при температуре -80 ° С для дальнейшего использования. Если необходимы функциональные митохондрии, повторно приостанавливать осадок в оставшейся буфера после удаления надосадочной жидкости. Разбавление митохондриальной фракции далее может привести к потере функции митохондрий. Хранить на льду и использовать препарат в течение 1 - 3 ч для достижения наилучших результатов.
    6. Разрушать ультразвуком ресуспендировали осадок в течение тридцати-3 сек всплесков вледяная баня, центрифуге при 10000 мкг в течение 5 мин, и сохраните супернатант в качестве митохондриальной фракции.

2. Со-иммунное CDK1, CyclinB1 и COXIV, белок митохондриальной Resident

  1. Grow 5 х 10 4 клеток на покровные в 24-луночные планшеты O / N или до 70% слияния. Аспирируйте среды и промыть клетки дважды 500 мкл охлажденного льдом 1 х PBS, рН 7,4.
  2. Закрепить клетки с 500 мкл охлажденного на льду 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 мин. Аспирируйте фиксирующий раствор и промыть клетки с 500 мкл 1 х PBS 3 раза, 5 мин каждая при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  3. Клетки проницаемыми с 0,2% Тритона Х-100 в 500 мкл PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте раствор и промыть клетки 3 раза, 5 мин каждый с 500 мкл PBS. Добавить блокирующий раствор (500 мкл, 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в PBS, содержащем 1% Tween 20) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Развести первичных антител 1: 250 (по объему) в 5001; л блокирующего раствора и инкубировать клетки с желаемыми первичными антителами, индуцированными у разных видов, чтобы избежать перекрестной передачи сигналов (CyclinB1 (мышь) и COXIV (кролик) или Cdk1 (мышь) и COXIV (кролик) при комнатной температуре в течение 30 - 60 мин или O / N при 4 о С.
  5. Промыть покровные с помощью 500 мкл 1 х PBS, 3 раза, 5 мин каждый раз, а затем инкубируют с вторичным антителом, разбавленное 1: 1000 в 500 мкл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего промывали 500 мкл PBS 3 раза, 5 мин каждый.
  6. Установите покровные с 20 мкл анти-выцветанию решение для монтажа и герметизации слайдам с помощью лака для ногтей. Изображение слайды с помощью флуоресцентного микроскопа сразу же или держать в темноте при 4 ° С в течение 1 - 2 недель.

3. Карбонат натрия Извлечение неповрежденном Митохондрии

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, сбора урожая, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Разделите митохондриальной изолирует на два номиналаTS до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4); сохранить половину для использования в качестве общего митохондрий (этап 3.2), использовать другую половину для извлечения карбоната натрия (следующие шаги 3.3-3.6), чтобы отделить растворимых и мембраносвязанных белков.
  2. Лизировать Всего митохондрии гранул с 30 мкл буфера для лизиса клеток и хранить лизат при -80 о С до использования в иммуноблоттинга.
  3. Добавить 250 мкл 0,1 М Na 2 CO 3 (карбонат натрия), рН 11,0, к другой половине митохондриальной гранулы и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  4. Центрифуга при 100000 х г в течение 20 мин. Соберите супернатант и перейдите к шагу 3.5. Lyse осадок с помощью 30 мкл буфера для лизиса клеток и разрушать ультразвуком как на этапе 1.3.6. Хранить при температуре -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.
  5. Добавить равный объем 20% свежеприготовленного трихлоруксусной кислоты (ТСА) к надосадочной жидкости для осаждения белков и держать на льду в течение 30 мин.
  6. ЦентробежнаяУГЭ при 15000 мкг в течение 10 мин. Жидкость над осадком сливают, растворить осадок в 80 мкл буфера для лизиса клеток и хранят при -80 ° С до использования в иммуноблоттинга.

4. Разделение внутренней и внешней мембранах митохондрий (Выделение Mitoplasts)

  1. Растут примерно 20 х 10 7 клеток, урожай, мыть один раз PBS и изолировать митохондрии , как описано в разделе 1. Отделите митохондриальных фракций на 10 равных частей до последнего центрифугирования для осаждения митохондрии (до стадии 1.3.4).
  2. Растворить каждую гранулу в 30 мкл указанной концентрации гипотонического буфера сахарозы (1 мМ ЭДТА, 10 мМ MOPS / КОН (гидроокись калия), рН 7,2; концентрация сахарозы в пределах от 25 - 200 мм), с добавлением или без 50 мкг / мл трипсина ( Таблица 1) и инкубировать в течение 30 мин на льду.
  3. Добавить 3 мкл 10 мМ PMSF (до конечной концентрации 1 мМ PMSF) с помощью трипсина, содержащим ампул, чтобы остановить тон усвоением трипсина и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  4. Центрифуга при 14000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Перенести супернатант в новую пробирку, лизировать осадок в 30 мкл буфера для лизиса клеток, разрушать ультразвуком , как на этапе 1.3.6, и хранят при -80 о С.

5. Построение Митохондрии ориентированных на GFP / RFP-меченый CyclinB1 / Cdk1 векторы и подтверждение их митохондриальной локализации

  1. Клонирование митохондрии таргетингом последовательность (МТС; полученный из предшественника человеческого цитохром с оксидаза субъединица 8А (COX8) между нуклеотидами 76 - 161) в кадре в N-конце GFP или RFP на NheI и BamHI сайты pEGFP-N1 или pERFP -n1 векторы с использованием стандартных методик молекулярного клонирования.
  2. При разработке ПЦР-праймеров для генов CyclinB1 и Cdk1, добавлять сайты ферментов рестрикции BamHI распознавания (полужирным шрифтом) к 5'-праймеров ПЦР.
    Форвард Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Обратный CDK1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT СТТ СТТ ААТ CTG ATT
    Форвард CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG АТС CAA TGG CGC TCC GAG ТСА
    Обратный CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC СТТ ТГК CAC AGC C
  3. Амплификации генов Cdk1 и CyclinB1 с использованием этих праймеров в соответствии со стандартными методами. Переваривать продукты ПЦР с 1 мкл рестриктазы BamHI при 37 ° С в течение 2 часов. Запуск переваривания продуктов на 1% агарозном геле. С помощью лезвия бритвы, вырезать правильные фрагменты -sized ДНК, и очищают ДНК из геля с использованием набора для экстракции геля.
  4. Дайджест 1 мкг МТС-pEGFP-N1 и MTS-pERFP-N1 плазмид с 1 мкл BamHI фермента при 37 ° С в течение 2 ч. Добавить 1 мкл теленок-INTESкишечные щелочной фосфатазы (МЦК) в течение 30 мин при 37 ° С. Запуск продуктов расщепления на агарозном геле 1% и очищают линейные плазмиды из геля, как описано в шаге 5.3.
  5. Настройка реакции лигирования путем добавления 1 мкл плазмиды со стадии 5.4 и 5 мкл Cdk1 или CyclinB1 со стадии 5.3 до 3 мкл лигазы буфера, 0,5 мкл T4 лигазы и 20,5 мкл дН 2 O. Выдержите O / N при температуре 4 ° С.
  6. Transform кишечной палочки компетентных клеток DH5 & alpha ; с 10 мкл смеси лигировани с помощью стандартной методики и выращивать бактерии на 10 мг / мл канамицина , содержащих LB агаром O / N при температуре 37 ° С для получения колоний.
  7. Выбирают колонию из O / N выращенных пластин с помощью стерильной пипетки, вставьте наконечник в 5 мл канамицина-LB, содержащей трубки и инкубировать O / N. Изолировать плазмиды использованием минипрепаративную комплекты в соответствии с протоколом производителя, и последовательность плазмиды с использованием стандартных методик.
  8. Трансфекцию экспоненциально растущей MCF10A клетки (1,5 × 10 4 клеток высевали на 96-луночные планшеты) с МТС-Cdk1-ОПП или МТС-CyclinB1-GFP плазмид с шагом 5,7 путем приготовления / соотношение реагента плазмидной трансфекции 1: 2 (w: V, 100 нг : 0,2 мкл) в 100 мкл serum- и среды антибиотик бесплатно.
  9. Инкубируйте клетки в плазмиде смеси / реагента в течение 48 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор с контролем влажности (5% СО 2, 95% относительной влажности).
  10. Готовят 1 мМ маточного раствора митохондриальных красного и зеленого флуоресцентных красителей путем растворения 50 мкг порошка в 100 мкл ДМСО. Разбавьте растворы 1: 400 в 1x PBS для получения 2,5 мкм рабочих растворов. Маточные растворы можно хранить при -20 ° С в течение года.
  11. Смешайте 2 мкл 2,5 мкМ красного красителя с 98 мкл культуральной среды для получения конечной концентрации 50 нМ.
  12. Заменить клеточной культуральной среды CyclinB1-GFP клеток, несущих MCF10A (генерируемых на этапе 5.8) с красным красителем, содержащую среду в течение 2 мин. ПовторитьТакая же процедура с зеленым красителем для Cdk1-RFP подшипник MCF10A клеток.
  13. Промыть два раза с 100 мкл 1 х PBS, чтобы избавиться от избытка раствора для окрашивания, добавляют 100 мкл 1x PBS в 96-луночного планшета.
  14. Визуализируйте митохондрии и CyclinB1-GFP (возбуждение 488 нм и эмиссии при 494 - 536 нм) и Cdk1-RFP (возбуждение 560 нм и эмиссии при 565 - 620 нм) на 96-луночные планшеты под флуоресцентным микроскопом при 40-кратном увеличении.

6. Идентификация дифференцированно фосфорилированных белков с помощью 2D-Dige

  1. Базовые приготовления
    1. Изолировать митохондрии и лизировать митохондриальные фракции, как в шаге 1.3. Добавить равный объем 20% ТХУ (трихлоруксусной кислоты в воде) к каждому образцу и вихря на 15 сек. Инкубируйте образцы на льду в течение 30 мин, как белки выпадают в осадок из раствора.
    2. Центрифуга образцов при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин, удаления надосадочной жидкости, и добавить 60 мкл холодного ацетона (100%) с последующимцентрифугирование при 9300 х г при 4 ° С в течение 5 мин.
    3. Повторите шаг ацетон стирки (этап 6.1.2) еще один раз, удалить супернатант и повторно приостанавливать образцы в 50 мкл ПГЛП мечения буфера (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, рН 8,5).
  2. Подготовьте флуоресцентными красителями
    1. Подготовка маточного раствора: Растворите красители (5 нмоль) в 5 мкл свежей диметилформамида (ДМФ) до конечной концентрации 1 нмоль / мкл. Хранить раствор красителя запас при -20 ° С до использования в течение нескольких месяцев.
    2. Подготовка рабочего раствора: Разрешить красители устанавливать при комнатной температуре в течение 5 мин. Развести 1 мкл красителя с 4 мкл ДМФ до конечной концентрации 200 пмоль / мкл. Держать на льду во время использования. Примечание: Рабочий раствор можно хранить при -20 ° С в течение 3 -х недель.
  3. Этикетка Белки
    1. Смешайте 1 мкл рабочего раствора красителя, на 12,5 мкг белка. Масштабирование по мере необходимости. Для объединенных стандартов, добавьте 61, л су2 рабочего раствора до 300 мкг белка объединенных.
    2. Вихревые в течение 30 сек и центрифугировать при 4 ° С в течение 30 с при 12000 х г. Инкубируют на льду в темноте в течение 30 мин. Остановить маркировку путем добавления 1 мкл 10 мМ лизина на 1 мкл рабочего раствора, используемого. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в темноте в течение 10 мин.
    3. Бассейн индивидуально помечены образцы и смешать с регидратации буфером (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, бромфенол синий). Общий объем будет 125 мкл.
    4. Образцы Vortex в течение 30 сек и позволяют установить образцы при комнатной температуре в течение 30 мин. Нагрузка 125 мкл образцов на 7 см рН 4 - 9, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) полосы.
  4. Первое измерение электрофорез
    1. Поместите держатели полосы (гробы) на электродной пластины, убедившись, что держатели полосы являются абсолютно чистыми и сухими. Пипетировать 125 мкл образцов в гроб, распространяясь равномерно по всему гробу.
    2. Использование выщипыватьRS, возьмите полоску ИЭФ, осторожно удалите защитную пластиковую защитную крышку, и поместите его (гель стороной вниз) в Гроб / регидратации буфера. Избегайте образования пузырьков. Медленно заполнить гроб с телом (1 - 1,5 мл) с минеральным маслом и поместить гроб покрывает на гробах.
    3. Начинают изоэлектрического фокусирования в соответствии с протоколом в таблице 2:
      Примечание: После того , как прогон завершения, полоски могут храниться в пластиковых пробирках при температуре -80 ° С или непосредственно перешли к уравновешивания и втором измерении.
  5. Второе измерение - додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
    1. уравновешивание
      1. Оттепель SDS буфера для уравновешивания (8 мл на полоски, 6 М мочевины, 30% глицерина, 2% SDS). Взвесить дитиотреитола (DTT; 10 мг DTT на 1 мл SDS буфера для уравновешивания). Растворите DTT в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      2. Взвесить IAA (иодацетамида, 25 мг ИУК на 1 мл SDS буфера для уравновешивания).Растворите IAA в 4 мл SDS буфера для уравновешивания.
      3. Melt 1 мл герметизирующие раствора агарозы в водяной бане для последующего использования.
      4. Если полоски были заморожены, позволяют им оттаять полностью. Поместите полоски сторону геля вверх в лоток reswelling. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с ДТТ в каждой полосе и инкубировать в течение 15 мин при осторожном встряхивании.
      5. Слейте все уравновешивающим буфером SDS с DTT. Добавляют 4 мл SDS буфера для уравновешивания с МАА в каждой полосе и инкубировать в течение еще 15 мин при осторожном встряхивании. После уравновешивания с буфером IAA, нальет уравновешивающим буфером SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Берем мини - гели, снимите расческу и промыть гель и лунки с DDH 2 O. Удалите белую ленту в нижней части геля перед запуском. Сориентируйте полосу на геле правильно, ориентация гель имеет решающее значение для точечной резки.
      2. Поместите квартиру гель на прилавке с небольшую тарелку вверх и гель верхней стороной электроннойxperimenter. Положите полоску на высокую тарелку с конца анодной (++ заканчивается с штрих-кодом) с видом на левую сторону геля. С помощью линейки, медленно толкать полосу вниз на поверхность геля. Избегайте образования пузырьков между полосой и гелем. Выдерживают гель вверх в стеклянной пластине стенда.
      3. Добавить 1 мл горячего раствора агарозы запечатывание к открытию кассеты. Убедитесь, что все пузырьки воздуха выдавливается с помощью плоской линейки. Собрать аппарат и запустить гель при постоянной 125 В в течение 90 мин.
      4. Когда гель завершения работы, поместите гель на биомолекулярной томографа с 2 мл DDH 2 O и сканировать гель в режиме обнаружения флуоресценции с лазерным возбуждением 635 нм и 665 нм фильтром эмиссии.
    3. фосфопротеином Окрашивание
      1. Закрепить гель с 50% метанола и 10% -ной смеси уксусной кислоты (10 мл) в течение 30 мин дважды. Промывают 10 мл воды в течение 10 мин три раза, и пятно с 10 мл фосфопротеинкиназы пятно в течение 60 - 90 мин, а затемОбесцвечивание с 10 мл раствора destain в течение 30 минут три раза.
      2. Мытье с 10 мл воды 5 мин дважды и изображение геля с помощью сканера гель-лазера при 532 нм / 560 нм возбуждения / испускания.
    4. Переваривания белков и идентификации
      1. Акцизной все дифференциально экспрессированные белки пятна из геля в лунки микропланшета с использованием роботизированного спот-подборщика в соответствии с инструкциями производителя, и добавляют 100 мМ бикарбоната аммония (2 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы destain гелевые части. Высушить с 2 мл 100% ацетонитрила моют два раза и сушат в вакуумном концентраторе в течение 30 мин.
      2. Увлажняет кусочки геля с помощью 100 мкл 13 нг / мкл модифицированного свиного трипсина в 50 мМ бикарбоната аммония в течение 16 ч при 37 ° С. Собирают супернатанты и далее извлекать белки со 100 мкл 5% -ной трифторуксусной кислоты в 50% ацетонитрила в течение 30 мин.
      3. Концентрат пептидов до 5 мкл с помощью вакуумной центрифуге ОБОГАЩЕНИЯrator и анализировать с матрицей лазерной десорбцией Ионизация - Время полета - тандем масс - спектрометрического анализа (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro киназы

  1. Получение подложках
    1. Sub-клон Комплекс I (CI) субъединицами (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 и NDUFA12), которые определены как дифференцированно фосфорилированных мишеней CDK1, в pGEX-5X-1 вектор для генерации глутатион-S-трансферазы (GST) -tagged бактериальная экспрессия плазмид 11. Очищают CI субъединиц с использованием высокого сродства глутатиона столбцы следующие ниже протокола.
      1. Культура GST-меченый CI - субъединицу , не содержащий кишечной палочки штамма BL-21 в Лурии-Бертани (LB) бульоне с 50 мкг / мл ампициллина , в шейкере при 37 ° С до оптической плотности (ОП) было достигнуто 0,6. Добавить изопропил-Bd-тио-галактопиранозида (IPTG) к культуЮр при конечной концентрации 0,1 мМ и инкубируют еще в течение 3 часов.
      2. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин, чтобы собрать бактерии и повторно приостанавливать в 5 мл 1 х PBS буфера, содержащего 5 мМ ДТТ, 1 х ингибитор протеиназы коктейлем, и 0,1% лизоцим. Лизиса клеток путем обработки ультразвуком в течение двадцати 5 с очередями, и удалить остатки клеток центрифугированием при 600 х г в течение 10 мин.
      3. Собирают супернатант и инкубировать с глутатион-агарозных 4B бусин в объемном соотношении 4: 1 (надосадочной: Шарик) в течение 1 ч при комнатной температуре.
      4. Элюируйте GST-слитые белки из гранул с 3 мл глутатион буфера для элюции (10 мМ восстановленного глутатиона в 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0) и подвергают Элюированные белки диализу в молекулярной пористой мембранной трубки (молекулярная масса отсечки 12 -14 кД) с 1 х PBS / 1 мМ ЭДТА. Храните очищенные белки при - 80 ° С.
  2. Cdk1 киназы
    1. До начала киназы задницуау, установить нагревательные блоки до 30 ° C и 100 ° C. Оттепель коммерческий CyclinB1 комплекс ферментов и субстратов на льду / Cdk1.
    2. Подготовка реакционной смеси на льду. Так как 32 P АТФ изотоп участвует, подготовить все реакционные смеси в 1,5 мл пробирок с винтовыми крышками , содержащими кольца O , чтобы предотвратить распространение радиоактивности.
      Внимание: Соблюдайте правила радиационной защиты материала. Используйте толщиной 8 мм оргстекла экранирование и работу по крайней мере, на расстоянии вытянутой руки. Протрите любую загрязненную область с водой.
    3. Приготовьте реакционного буфера 30 мкл , содержащем 1 х Cdk1 буфер (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 2 мМ ДТТ, 1 мМ EGTA, 0,01% Brij 35, рН 7,5), 0,6 мМ холодного АТФ, 0,1 мкКи 32Р АТФ, 2 единицы CyclinB1 / Cdk1 и 6 мкг белка субстрата. Отрегулируйте громкость до 30 мкл с DDH 2 O. Для получения положительной контрольной реакции, замените субстрат с 0,01 мМ гистона H1, хорошо известного CyclinB1 / Cdk1 подложке.
      1. Для получения отрицательного Controл реакции, (1) заменить субстрат с GST белка только и (2) заменить субстрат с 0,01 мМ гистона H1 + 0,5 мкМ RO-3306, селективного ингибитора CDK1.
    4. хорошо перемешайте с пипеткой и центрифугу, чтобы принести всю жидкость в нижней части трубки, сводя к минимуму риск загрязнения. Инкубируют при 30 ° С в течение 60 мин.
    5. Добавить 6 мкл 5х буфера для образцов SDS , чтобы остановить реакцию , и денатурации при 100 ° С в течение 10 мин. Выполнить образцов на 10% -ном SDS-PAGE при 160 V в течение 2 часов, или до тех пор, пока фронт красителя достиг конца геля. Перенесите гель на хроматографическую бумагу и обернуть полиэтиленовой пленкой.
      Внимание: Все жидкости в контакте с радиоизотопы должны рассматриваться как радиоактивные отходы и утилизировать в поли бутыль 5-галлона предоставляемых услуг в области здравоохранения и безопасности окружающей среды в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
    6. Expose гель для рентгеновской пленки в течение 1 дня или до 1 недели при температуре -20 ° С в зависимости от удельной активности радиоизотопныеи фермент.

8. сайт-направленного мутагенеза, чтобы генерировать доминантный негативный Cdk1 (D146N)

  1. Дизайн мутагенеза праймеров; Два праймера, комплементарные друг другу, содержащим мутантный сайт (G будет заменен нуклеотидную для кодирования N вместо D аминокислоты) фланкированного 20 оснований на каждой стороне 11.
  2. Готовят 50 мкл полимеразной цепной реакции (ПЦР) , содержащей 1х реакционного буфера, 2,5 мМ дНТФ, 10 мкМ праймеров (вперед и назад), 40 нг матрицы, и DDH 2 O. Добавить 2,5 ед ДНК полимеразы в реакцию.
  3. Выполните следующую программу ПЦР: 95 ° C 3 мин, 95 ° C 30 сек, 55 ° C 30 мин, 68 ° C 6 мин; 16 циклов (Примечание: 68 ° C Время инкубации определяется размером ДНК 1 мин / кб требуется для ДНК ≤ 10 кбайт для увеличения ДНК, 2 мин / кбайт плюс 10 секунд за один цикл..). Следуйте на 68 ° C 7 мин и удерживать при 4 ° С до готовности к использованию.
  4. Добавить2 мкл ДПН I рестриктазы (10 ед / мкл) и 5,7 мкл DPN Я буфер, хорошо перемешать с нежным крана с пальцем и инкубировать реакции при 37 ° С в течение 1 часа.
  5. Передача 10 мкл Dpn I обработанных продуктов ПЦР в 50 мкл компетентных клеток DH5 & alpha для трансформации. Инкубируют на льду в течение 30 мин, а затем 45 сек теплового шока при 42 ° С и 5 минут на льду. Добавьте 500 мкл LB и встряхивают при температуре 37 ° С в течение 1 ч перед металлизированный на LB-агар пластин. Выдержите O / N при 37 о С.
  6. Выберите колонию из O / N выращивают агаром с использованием стерильного желтый наконечник пипетки, падение наконечник в пробирку , содержащую 5 мл LB, и расти O / N в C шейкере 37 °. Изолировать плазмиды с использованием набора минипрепаративную и последовательность плазмиды для подтверждения мутации в соответствии с протоколом производителя.

9. Определение фазы клеточного цикла Длины с EDU инкорпорации Пробирной

  1. сортировки клеток
    1. Трansfect 2 х 10 5 клеток с указанными векторами (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-масс-ОПП или MTS-Cdk1-дп-RFP) в 6-луночного планшета с использованием 1: 2 (вес: v , 2,5 мкг: 5 мкл) соотношение ДНК: Трансфекция Реагент смесь, полученную в 2,5 мл serum- и антибактериальной свободной культуральной среды в течение 48 часов. Живые клетки сортировки, стабильно экспрессирующих GFP-меченый Cdk1 и RFP меченых белков CyclinB1 с помощью проточной цитометрии.
      1. Вымойте клеток с 1 х PBS, добавляют 100 мкл трипсина в чашку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Добавляют 2 мл культуральной среды для сбора клеток и передавать их через фильтр с диаметром 70 мкм, чтобы сформировать одноклеточной суспензии. Промыть одноклеточной суспензии с 500 мкл 1% фетальной телячьей сыворотки в PBS (FCS / PBS) перед их загрузкой на проточном цитометре.
      2. Настройка параметров сортировки следующие протоколы : 18 , установленных стробирования для двойных положительных клеток , окрашенных с обоими GFP и RFP. Собирают отсортированные клетки выходят из цитометра в трубку содернин среда для культивирования клеток и использовать эти клетки для анализа прогрессии клеточного цикла с маркировки EDU импульсов погоня, как в протоколе 9.2.
  2. Измерение длины клеточного цикла с использованием анализа Edu Этикетировочное проточной цитометрии
    1. Семенной сортируется клетки в 6-луночные планшеты при плотности 2,5 × 10 5 клеток на лунку и культуры O / N при 37 ° С в СО 2 инкубаторе. Добавить ОБР в культуральной среде при конечной концентрации 25 мкМ. Инкубировать при 37 о С в СО 2 инкубаторе в течение 1 часа.
    2. Вымойте клеток с 1% BSA в 500 мкл PBS и собирают их в 1,5 мл пробирку с 2 интервалами ч в общей сложности 10 - 12 часов.
    3. Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант. Выбить гранул путем добавления 100 мкл раствора (фиксирующей предоставленного производителем в комплекте маркировки EDU) в течение 15 мин при комнатной температуре и хорошо перемешать.
    4. Промыть клетки с 1 мл 1% BSA в PBS, в три раза. ЗакрепитьКлетки снова с 0,5 мл 70% этанола O / N при 4 о С.
      Примечание: фиксация Этанол имеет решающее значение для гашения внутренней GFP / RFP флуоресценции из-за экспрессии рекомбинантного меченого белка.
    5. Центрифуга клетки снова при 350 мкг в течение 5 мин и промывают осадок с помощью 1 мл 1% BSA в PBS один раз. Повторное приостановить клеток в 1 мл пермеабилизации буфера (0,1% Тритон-Х-100, 1% БСА, 0,2 мг / мл РНКазы А на PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре.
    6. Промыть клетки с 1 мл 1% БСА в PBS один раз. Добавить 0,5 мл реакционного коктейля в каждую пробирку и хорошо перемешать. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
    7. Промыть 1 мл 1% BSA в PBS один раз и ДНК пятна с 50 мкг / мл пропидиума йодида (PI) в 1 мл 1% BSA в PBS.
    8. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии следовать Edu-позитивного населения. Присутствует разброс точек участок Edu-меченых клеток окрашиваются по содержанию ДНК (PI окрашивания, по оси Х) и Эду (Alexa 647 окрашивания, Y-оси).
      1. Используйте APC канал для Alexa647-EDU с использованием фильтра верхних частот 670/30 полосы со всеми света представлено менее 685 нм, что фильтр удара; и фикоэритрин канал (PE) для PI с фильтра нижних частот 581/15 полосы перед ним со всеми света представлено менее 600 нм удара этот фильтр.
      2. Вставьте первую пробирку, содержащую клетки в проточной цитометрии и использовать стандартную стратегию стробирования для приобретения: Участок FSC-Area X SSC-зона для морфологии с последующим PI (PE) канал X Alexa647-Edu (APC канал) для окрашивания клеток. Запись данных для всех трубок один за другим, приобретающего 10000 событий в выборке.
      3. Определить распределение фазы клеточного цикла клеток и длины фазы с использованием проточной цитометрии программного обеспечения для анализа данных в соответствии с установленными протоколами 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Суб-митохондриальной локализации CyclinB1 и Cdk1

экстракция Карбонат натрия используется для определения того, является ли белок, расположенный внутри митохондрий или на наружной поверхности, а именно наружной мембраны. После того, как белок показан для локализации внутри митохондрий, дальнейшее определение суб-митохондриальной локализации может быть сделано с помощью mitoplasting в сочетании с протеазы пищеварения. Чтобы указать суб-митохондриальной локализации CyclinB1 или Cdk1, mitoplasts были выделены разбавлением митохондрии в гипотонических буферов с уменьшением концентрации осмотического сахарозы от 200 мМ до 25 мМ. Наружная мембрана начинает разрываться при концентрации 150 мМ сахарозы, в то время как внутренняя мембрана остается неповрежденной до конечной концентрации в 25 мМ сахарозы (фиг.1А). В сочетании с mitoplasting, анализ защиты протеазы может быть выполнена с использованием trypsв переваривать белки подвергаются следующие внешнего разрыва мембраны. Это приведет к перевариванию межмембранного пространства белков. Если интерес белок защищен от усвоением трипсина, это указывает на то митохондриальной локализации матрицы белка. В этом представительном фигуре, митохондриях белка Hsp60 и межмембранное пространство белка Timm13 были использованы в качестве суб-маркеров митохондриальной локализации. Подобно с Hsp60 , но в отличие от Timm13, CyclinB1 и Cdk1 были защищены от трипсина пищеварения, что указывает на их митохондриальной локализации матрицы (рис 1B).

Митохондриальная экспрессия MTS- и GFP-меченый CyclinB1 и Cdk1 Белки

МТС клонируют в рамке на N-конце генов CyclinB1 или CDK1, который имеет или GFP RFP тегов на своем С-конце. Полученный рекомбинантный белок является митохондрия-мишенью GFP- или RFP-меченый СаяclinB1 или Cdk1. Перечень конструкций, полученных и используемых в данном исследовании, показана на рисунке. Используя эти конструкции избыточная экспрессия CyclinB1 и / или Cdk1 в митохондриях было достигнуто, как показано здесь , с помощью вестерн - блоттинга выделенных митохондриальных фракций (рисунок 2).

Потенциальные Митохондриальные Цели CyclinB1 / Cdk1 Определяются 2D-Dige

Cdk1 принадлежит серин / треонин (S / T) семейства киназ, катализирующий перенос фосфата от АТФ на пролин (P) -ориентированная S или T остатков. Мутация точка , которая заменяет аспартат (D) остатка аспарагина (N) в положении 146 Cdk1 (D146N) порождает доминантный негативный (Dn) CDK1 мутант 19. Для изучения функции митохондриальной Cdk1, митохондрий, ориентированных Cdk1-дп белок генерируется путем конструирования плазмиды (pERFP-N1-MTS-Cdk1-дп), содержащий 29 аминокислот-LONг митохондриального таргетинга последовательности (MTS), полученный из субъединиц VIII человека оксидазы цитохрома C, связанного с RFP-меченого дп-Cdk1. pERFP-N1-MTS производит митохондрии таргетингом ERFP белок был использован в качестве пустого векторного управления. Митохондриальные фосфопротеинам G2 / M-клетки, трансфецированные обе конструкции были профилированных по 2D-анализа гель с рН 4-10 гелевых полосок. По сравнению с пустыми векторными трансфектантов (рисунок 3, верхняя панель), группа митохондриальных фосфопротеинам по- видимому , отсутствует или уменьшается в Cdk1-Д.Н. трансфектантов (рис 3, нижняя панель). Масс-спектрометрический анализ пятен, обнаруженных определяют идентичность белков фосфорилируется Cdk1 в митохондриях.

Клеточного цикла Прогрессия и определение фазы Длины с EDU импульсно-чейза Пробирной

Для того, чтобы исследовать прогрессирование клеточного цикла WHeп митохондриальная CyclinB1 / уровни Cdk1 увеличиваются, импульсно-Погоня маркировки эксперимент с использованием аналог тимидина, этинил деоксиуридин (EDU) проводили для мечения популяции клеток , проходящих синтез ДНК 20. Этот метод позволяет визуализировать клеточного цикла захваченный над окном в 22 ч путем отслеживания ОБР-позитивной популяции, когда клетки прогрессировать через S и G2 / M фазы и накапливаются в G1 фазе. Результаты показывают, что меченые фазовые клетки S прогрессировали через G2 / M фазе и появился в фазе G1 так быстро, как 4 ч в клетках, экспрессирующих дикого типа митохондриальной CyclinB1 / CDK1, по сравнению с 6 ч в клетках, трансфецированных с контрольным вектором или мутантного CyclinB1 / Cdk1 (фиг.4А), что указывает на усиление митохондриальной CyclinB1 / Cdk1 ускоряет ход клеточного цикла.

Рисунок 1
Рисунок 1. Митохондриальная CyclinB1 / Cdk1 локализуется в матрице. (AB) Суб-митохондриальной локализации CyclinB1 и Cdk1 обнаруженных mitoplasting и анализа методом защиты протеазы, цифра была изменена с Wang и др., 2014 11. Общее (Т), осадок (Р), и супернатант (S) фракции подвергали Вестерн-блоттинга с указанными антителами. TIMM13 (интер-пространство белка), и HSP60 (матрица белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Экспрессия митохондриальных CDK1 конструктов. Вестерн - блоттинга митохондриальных фракций , выделенных из клеток , трансфицированных митохондрии-мишенью CyclinB1 и / или дикого типа или доминантный негативный мутант Cdk1 (плазмид показаны на нижней 11. pEGFP-N1-MTS и векторы pERFP-N1-MTS были пустой вектор управления для МТС-CyclinB1 и МТС-Cdk1 соответственно). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Потенциальные Митохондриальные Субстраты Cdk1. Митохондриальные белки , извлеченные из G2 / M-островерхими клеток , трансфицированных митохондрии таргетингом пустым вектором (pERFP-N1-MTS, верхняя панель) или мутантного Cdk1 (pERFP-N1-MTS-Cdk1-дп, нижняя панель) были помечены Cy5 (зеленый), разделенных 2-D геле и фосфорилированные белки окрашивали фосфопротеинкиназы краситель (красный). Эта цифра была изменена с Wang и др. 2014 11."> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Митохондриальная Cdk1 Усиливает G2 / M перехода и общий цикл Прогрессия.
Анализ клеточного цикла с маркировкой Edu-импульсной погони. Разброс участок гистограммы Edu-меченых клеток были разработаны для содержания ДНК (X-ось) и Эду (Y-ось). Нижние фигуры в каждой панели показывают среднюю интенсивность флуоресценции Edu меченых ядер. Моменты времени были указаны в ч после импульса EDU 11. Для всех моментов времени, были сделаны ворота, отображающие следующие группы населения: G0 / G1, S и G2 / M. Для 6, 8 и 10-часовых временных точках, обученным помечены G1 *, S / G2 * и G2 / M * популяции показаны. Эта цифра была изменена с Wang и др., 2014 11. Пожалуйста , нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Сахароза Концентрации, используемые
Нет трипсина 25 мМ 50 мМ 100 мМ 150 мМ 200 мМ
+ трипсина 25 мМ 50 мМ 100 мМ 150 мМ 200 мМ

Таблица 1. Гипотонические Сахароза буферов , используемых для шага 4.2

Шаг 1 30 В 12 ч Шаг и удерживайте
Шаг 2 300 В 0,5 ч Шаг и удерживайте
Шаг 3 1000 V 0,5 ч градиент
5000 V 1.33 ч градиент
Шаг 5 5000 V 20000 V ч Шаг и удерживайте

Таблица 2. Изоэлектрическая протокол , используемый для стадии 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как и белки , предназначенные для других внутриклеточных органелл, митохондриальные белки обладают мишенью таргетингом сигналы в их первичной или вторичной структуры , которые направляют их органеллы с помощью сложного белка транслокации и складных машин 21,22. Митохондрии нацеливающие последовательности (MTS) , полученные из исключительно митохондриальных белков - резидентов , таких как COX8 могут быть добавлены к N-концу любой последовательности гена целевой специфических белков в митохондрии 11,23,24. Здесь гены CyclinB1 и Cdk1 были клонированы в COX8 MTS, содержащих векторы и при экспрессии рекомбинантной CyclinB1 и Cdk1 были локализованы в митохондриях. Преимущество этого подхода состоит в том, что она дает возможность модификации экспрессии генов в определенном субклеточном отсеке, в этом случае митохондрий, без изменения общего экспрессии гена. С помощью этой стратегии, митохондрии-специфические функции ядерной киназы, Cdk1 были деределяется. Аналогичным образом, путем добавления МТС доминантный негативный Cdk1, сбить митохондрии специфических функций Cdk1 была достигнута, что позволило идентифицировать митохондриях конкретных задач Cdk1 и позволил анализ функциональных последствий митохондриальной отсутствие функции CDK1. Сверхэкспрессия Cdk1 без результатов тегов МТС в повышенной экспрессии Cdk1 в обоих митохондрий и ядра, и, следовательно, затрудняет дальнейшие исследования последствий митохондрии конкретных действий Cdk1.

Тем не менее, этот подход может не подходить для всех продуктов генов, как мы пережили несколько неудачных попыток при перемещении некоторых киназ в митохондрии с помощью добавления тегов МТС. Некоторые клеточные линии могут быть весьма устойчивы к трансфекции, а также найти оптимальный протокол может быть много времени. Даже тогда, когда клетки здоровы и трансфекция прошла успешно, работая с люминесцентными меченных белков проявляет некоторые проблемы SUCч как агрегирование, неправильная локализация, нефункциональных слитых и слабых сигналов.

Основные ограничения выделения митохондрий и mitoplasts включают низкий выход и возможного загрязнения от других клеточных или суб-митохондриальных отсеков. Предполагается, что адгезивные клетки не разорвана эффективно обычными химическими или механическими способами, поэтому, что делает его трудно получить большие количества митохондрий из культивированных адгезивных клеток. Здесь мы использовали прилипшие культур клеток MCF10A. Для того, чтобы дать около 30 - 50 мкг белка митохондрий, начальная сумма 3 - 5 х были использованы 10 7 клеток. Стадию гомогенизация является еще одним важным моментом для конечного выхода митохондриальных препаратов. В зависимости от клеточных линий, используемых, число штрихов и / или времени гомогенизации может изменяться. Для клеток MCF10A, мы наблюдали, что 10 мин гомогенизации с помощью стекла / стекла гомогенизатор требуется, в то время как мыши эмбриональные fibroblaГНС (MEF) требуется только 3 - 5 мин гомогенизации. Поскольку чрезмерное гомогенизация может привести к повреждению мембраны митохондрий и вызывают высвобождение митохондриальных компонентов, стандартные условия для каждой клеточной линии должны быть определены опытным путем. Использование стекла стеклянного гомогенизатора увеличивает выход митохондриальных препаратов по сравнению со стеклом / тефлоновые гомогенизаторы. Исходное количество клеток, а также замораживание / оттаивание клеток может изменить количество ходов, необходимых для взламывать клетки. И, наконец, денатурации белка и агрегации может происходить из-за местного нагрева образца в процессе гомогенизации. Поэтому, важно, чтобы предварительно охладить гомогенизатора тканей и держать образцы на льду во время этой процедуры.

Другой метод, представленный в данной статье, является использование маркировки EDU для контроля клеточного цикла в реальном времени. EDU представляет собой модифицированный аналог тимидина, который флуоресцентно меченных с ярким, фотостабильным Alexa Fluor красителя. Edu является энергосбетивно включены во вновь синтезированную ДНК. Этот метод является лучшей альтернативой использованию традиционных мечения пролиферирующих клеток с нуклеозидными аналогами, бромдеоксиуридина (BrdU). BrdU включается в ДНК во время синтеза активного ДНК. Количественное BrdU-меченых ДНК требует денатурации ДНК относительно жестких методов, таких как высокая тепла или высокой кислотности, чтобы разоблачить молекулы BrdU для связывания BrdU антитела. Суровое обращение к денатурации ДНК может повлиять на качество образца и отнимает много времени. С ОБР, моющее средство пермеабилизации, как правило, достаточным для обнаружения реагента ОБР, чтобы получить доступ к ДНК. Без необходимости использовать агрессивные химические вещества или тепла для доступа к ДНК, метод Edu проще в использовании, более точным и последовательным. Помимо преимуществ Edu обеспечивает, там были некоторые опасения по поводу использования Edu для изучения пролиферации. ОБР показал небольшое антипролиферативное активность при лечении в течение 72 ч, что может быть уменьшена до negligible уровни , когда Эду пульс выдерживали при 1 ч 25.

Одна из модификаций применяется с маркировкой Edu время фиксации и способ. Комплект предложил 15 мин фиксации с предоставленному фиксирующим раствором. Тем не менее, дополнительный фиксация с 70% -ным этанолом, использовали в этом эксперименте. Есть две причины для использования этанола: 1), чтобы следить за прогрессию клеточного цикла в течение долгого времени, эксперимент по времени точка была выполнена, где клетки собирали через каждые 2 ч. Клетки не содержали в 70% -ном этаноле при 4 ° С до тех пор все экспериментальные моменты времени были завершены. На самом деле, клетки могут быть сохранены в 70% этаноле в течение более длительных (несколько недель до нескольких месяцев), если это будет необходимо. 2) Клетки, используемые для эксперимента, были стабильно трансфицированных GFP-меченый Cdk1 и / или RFP-меченый CyclinB1. Для разделения Edu и PI сигналов от GFP / RFP флуоресценции, фиксации этанол был использован для денатурации GFP и RFP белки, и, следовательно, утолить флуоресценции перед выполнением Edu вd PI окрашивания. Денатурированные GFP / RFP белки, по существу , полностью нефлуоресцирующего, предположительно потому , что хромофор больше не защищен от закалки 26,27.

Для выявления митохондриальных целей Cdk1, использовали 2D-ПГЛП метод, который превосходит традиционные 2D гелей во многих отношениях. В 2D-Dige, различных флуоресцентных красителей, например, Cy 3, 5 и 2, используются для образцов этикеток, которые позволяет запускать до 3 -х образцов в одном геле, уменьшая вариабельность без необходимости запуска повторах , как и в стандартном 2D - геле. Флуоресцентные красители, используемые в 2D-DIGE имеют очень высокую чувствительность 0,2 нг / место по сравнению с трифенилметановых красителей при 100 нг / месте, таким образом, что требует меньшего количества белков работать на гелей 2D-DIGE с высоким разрешением пятна и публикация качества гель сканирование. Автоматизированное программное обеспечение используется для обнаружения, количественной оценки и определить дифференциально экспрессированных протеинов. Из-за высокого разрешения пятна, дифференциальное экспрессию белка в образцах чап можно сравнить точно с помощью программного обеспечения автоматизированного точечной количественной оценки; разница в цене на 10% могут быть обнаружены с помощью 2D-Dige, что позволяет визуализировать пост-трансляционных модификаций легко. Использование программного обеспечения автоматизированного в геле анализ также обеспечивает более высокую скорость получения данных. Однако, так как оборудование, такие как флуоресцентные сканеры, которые требуются для получения изображений, использование этого метода связано с дополнительными затратами. Другие ограничения 2D-DIGE включают плохое представление гидрофобных белков, а также белки с экстремальными изоэлектрическими точками и большими молекулярными массами 28,29. Дальнейшее подтверждение результатов, полученных с помощью 2D-DIGE с использованием альтернативных методов, таких как иммуногистохимии или вестерн-блоттинга требуется для подтверждения новых выводов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
Экспериментальные подходы к изучению Митохондриальная локализации и функции цикла ядерных клеток киназа, CDK1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter