Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

doi: 10.3791/53417 Published: February 25, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico 3 y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas 4.

En la proliferación de células de mamíferos, mitocondrial ATP se genera a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) maquinaria (cadena de transporte de electrones), que se compone de 5 complejos de múltiples subunidades; complejo I - complejo V (IC-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): ubiquinona oxidorreductasa o complejo I (CI) es la más grande y menos comprendido de los cinco complejos 5. El complejo consists de 45 subunidades, 14 de los cuales forman el núcleo catalítico. Una vez montado, el complejo adopta una estructura en forma de L con un brazo que sobresale en la matriz y el otro brazo incrustado en el 6,7 membrana interna. Las mutaciones en las subunidades de CI son la causa de una variedad de trastornos mitocondriales 8. Se requiere un CI funcionalmente eficiente en la fosforilación oxidativa, no sólo para la respiración mitocondrial general 9, sino también para la progresión del ciclo celular con éxito 10. Desentrañar los mecanismos que subyacen al funcionamiento de este complejo enzimático unido a la membrana en la salud y la enfermedad podría permitir el desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y estrategias terapéuticas avanzadas. En un estudio reciente, se ha encontrado que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria en el G2 (mitosis) fase M (Gap 2) / y fosforila subunidades IC para mejorar la producción de energía mitocondrial, potencialmente, para compensar el aumento de las necesidades de energía de las células durante celular ciclo de 11. Aquí nos Showcase procedimientos experimentales y las estrategias que se pueden utilizar para estudiar la translocación mitocondrial de quinasas de otro modo núcleo / citoplasma, sus sustratos mitocondrial, así como consecuencias funcionales de su localización mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como un ejemplo.

El hallazgo de que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria cuando sea necesario se le solicite los estudios de sobreexpresión y desmontables de este complejo-mitocondria específica. Para conseguir la expresión-mitocondria específico de proteínas, se puede añadir una secuencia de mitocondrias de orientación (MTS) en el N-terminal de la proteína de interés. Las mitocondrias de orientación secuencias permiten la clasificación de las proteínas mitocondriales en las mitocondrias, donde residen normalmente 12. Hemos utilizado una secuencia dirigida a las mitocondrias 87 de base procedentes del precursor de la citocromo oxidasa subunidad humana c 8A (COX8) y se clonó en Green Fluorescent Protein (GFP)-etiquetados CyclinB1 o rojo fluorescenteProteína (RFP)-etiquetados Cdk1 que contiene plásmidos en el marco. Este método nos ha permitido también identificar los CyclinB1 y Cdk1 en la mitocondria, cambiando específicamente la expresión mitocondrial de estas proteínas sin afectar a su piscina nuclear. Mediante el etiquetado con fluorescencia estas proteínas, hemos sido capaces de controlar su localización en tiempo real. Del mismo modo, hemos introducido MTS en un plásmido que contiene RFP-etiquetados dominante Cdk1 negativo, lo que permitió a la detonación específicamente por la expresión mitocondrial y funciones de Cdk1. Es esencial distinguir entre las funciones mitocondriales y nucleares de las quinasas que tienen localizaciones duales como Cdk1. Ingeniería MTS en el N-terminal de estas quinasas duales funcionales ofrece una gran estrategia que es fácil de ser empleado y eficaz.

Desde Cdk1 es un ciclo celular quinasa, es fundamental para determinar la progresión del ciclo celular cuando Cdk1 se localiza en las mitocondrias. Para lograr esto, hemos utilizado un nuevo method para supervisar el contenido de ADN en las células. Los métodos tradicionales incluyen el uso de BrdU (bromodesoxiuridina), un análogo de timidina sintético, que incorpora en el ADN recién sintetizado durante la fase S del ciclo celular para sustituir timidina. A continuación, las células que están replicando activamente su ADN se pueden detectar usando anticuerpos anti-BrdU. Una desventaja de este método es que requiere la desnaturalización del ADN para proporcionar acceso para el anticuerpo BrdU por métodos agresivos como tratamiento con ácido o calor, que pueden resultar en inconsistencia entre los resultados de 13,14. Alternativamente, se utilizó un enfoque similar para monitorear las células que se dividen activamente con un análogo de la timidina diferente, edu. EdU detección no requiere desnaturalización del ADN duras como tratamiento detergente suave permite que el reactivo de detección para acceder a la UDE en el ADN recién sintetizado. El método EdU ha demostrado ser más fiable, consistente y con un potencial de análisis de alto rendimiento 15.

Finalmente, to determinar los sustratos mitocondriales de Cdk1, se utilizó una herramienta de proteómica llamado 2D-DIGE, que es una versión avanzada de la electroforesis bidimensional en gel clásico. Dos electroforesis dimensional separa las proteínas en función de su punto isoeléctrico en la primera dimensión y el peso molecular en el segundo. Desde modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación afectan el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas, geles 2D pueden detectar las diferencias entre los estados de fosforilación de las proteínas dentro de las diferentes muestras. El tamaño (área e intensidad) de la proteína de spots de cambios con el nivel de expresión de las proteínas, lo que permite la comparación cuantitativa entre múltiples muestras. Usando este método, hemos sido capaces de diferenciar las proteínas fosforiladas en el tipo salvaje frente a las células que expresan Cdk1 mitocondrias orientada mutantes. Se aislaron las manchas de proteínas específicas que mostraron en el tipo salvaje, pero faltaban en el mutante preparación Cdk1 mitocondrias y las orientadas poridentificado mediante espectrometría de masas.

En los geles en 2D tradicionales, colorantes de trifenilmetano se utilizan para visualizar las proteínas en el gel. 2D-DIGE utiliza etiquetas de la proteína fluorescente con un efecto mínimo sobre la movilidad electroforética de proteínas. Diferentes muestras de proteína pueden ser marcadas con diferentes colorantes fluorescentes, mezclados entre sí y separadas por los geles idénticos, lo que permite la co-electroforesis de múltiples muestras en un solo gel 16. Esto minimiza las variaciones de gel a gel, lo cual es un problema crítico en estudios de proteómica a base de gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Aislamiento de las mitocondrias de las células cultivadas

  1. Preparación de aislamiento de células Buffer (IBC) Buffer
    1. Preparar 0,1 M Tris / MOPS (tris (hidroximetil) aminometano / 3- (N morfolino) propanosulfónico): Disolver 12,1 g de Tris en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando MOPS en polvo, añadir agua destilada hasta un total volumen de 1 L y se almacena a 4 ° C
    2. Preparar 0,1 M EGTA (etilenglicol bis (éter de 2-aminoetil) tetraacético) / Tris: Disolver 38,1 g de EGTA en 800 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,4 usando polvo de Tris, añadir agua destilada hasta un volumen total de 1 l y almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar 1 M de sacarosa: Disolver 34,23 g de sacarosa en 100 ml de agua destilada, hacer alícuotas de 20 ml y se almacena a -20 ° C.
    4. Preparar tampón C IB: Preparar 100 ml de IB c Buffer por adición de 10 ml de Tris 0,1 M / MOPS y 1 ml de 0,1 M EGTA / Tris a 20 ml; De 1 M de sacarosa. Añadir agua destilada hasta un volumen total de 100 ml. Ajustar el pH a 7,4.
  2. Preparación de Tampón de Lisis Celular
    1. Preparar el tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM (ácido etilen diamino), EGTA 1 mM, 1% de Triton-X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM β- glicerofosfato, 1 mM ortovanadato de sodio. Añadir inhibidores de proteinasa 1 mg / ml de leupeptina y PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) justo antes de su uso.
  3. Aislamiento de mitocondrias
    1. Cosecha 3 x 10 7 células con enfriado con hielo 1x PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7,4 y centrifugar las células a 600 xg durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en tampón IB c 5 ml enfriado con hielo.
    2. Homogeneizar las células utilizando un triturador de tejidos de vidrio / vidrio durante aproximadamente 10 min. Transferir el homogeneizado a un tubo de 15 ml y centrifugar a 600 g durante 10 millasn a 4 ° C. Para mitocondrias funcional, se utiliza el acoplamiento de vidrio / teflón, ya que es menos perjudicial para mitocondrias que el triturador de tejidos de vidrio / vidrio.
    3. Recoger el sobrenadante en tubos de 1,5 ml y centrifugar a 7000 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml y guardar como proteína de citosol.
    4. Lavar el sedimento (mitocondrias) dos veces con tampón IB c enfriado con hielo 200 l y se centrifuga a 7000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en el tampón de lisis celular y usarlo inmediatamente o almacenar a -80 ° C para su uso futuro. Si se necesitan las mitocondrias funcionales, volver a suspender el sedimento en el tampón restante después de descartar el sobrenadante. La dilución de la fracción mitocondrial adicional puede resultar en la pérdida de la función de las mitocondrias. Almacenar en hielo y el uso de la preparación in 1 - 3 horas para obtener mejores resultados.
    6. Sonicar el sedimento se volvió a suspender durante treinta ráfagas de 3 seg en unabaño de hielo, se centrifuga a 10.000 xg durante 5 min, y guardar el sobrenadante como la fracción mitocondrial.

2. Co-inmunotinción de Cdk1, CyclinB1 y COXIV, una proteína mitocondrial Residente

  1. Crecer 5 x 10 4 células en cubreobjetos en placas de 24 pocillos O / N o hasta el 70% de confluencia. Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 500 l enfriado en hielo 1 x PBS, pH 7,4.
  2. Fijar las células con 500 l enfriado en hielo paraformaldehído al 4% a TA durante 10 min. Aspirar la solución de fijación y se lavan las células con 500 l 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno con agitación suave a temperatura ambiente.
  3. Permeabilizar las células con 0,2% Triton X-100 en 500 l de PBS durante 5 min a TA. Aspirar la solución y se lavan las células 3 veces, 5 minutos cada uno con 500 l de PBS. Añadir la solución de bloqueo (500 l, 1% de BSA (albúmina de suero bovino) en PBS que contenía 1% de Tween 20) durante 30 min a TA.
  4. Diluir los anticuerpos primarios 1: 250 (v: v) en 5001; l de solución de bloqueo e incubar las células con anticuerpos primarios deseados planteadas en diferentes especies para evitar la señalización de cruz (CyclinB1 (ratón) y COXIV (conejo) o Cdk1 (ratón) y COXIV (conejo) a TA durante 30 - 60 min o O / N a 4 ° C.
  5. Lavar los cubreobjetos con 500 l de 1 x PBS 3 veces, 5 minutos cada uno y luego se incuba con el anticuerpo secundario diluido 1: 1000 en 500 l solución a TA durante 1 h seguido de lavado con 500 l de PBS 3 veces, 5 min cada bloqueo.
  6. Montar el cubreobjetos con 20 l de solución de montaje anti-fade y sellar las diapositivas con esmalte de uñas. Imagen de las diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia de inmediato o se mantienen en la oscuridad a 4 ° C durante 1 - 2 semanas.

3. Carbonato de Sodio La extracción de mitocondrias intactas

  1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 7 células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en la sección 1. mitocondrial Divide en dos aislamientos parts antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes del paso 1.3.4); salvo un medio para ser utilizado como la mitocondria total (paso 3.2), utilizar el otro medio para la extracción de carbonato de sodio (siguiendo los pasos 3.3 a 3.6) para separar las proteínas unidas solubles y de membrana.
  2. Lyse las mitocondrias total del pellet con 30 l de tampón de lisis celular y almacenar el lisado a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
  3. Añadir 250 l de 0,1 M Na 2 CO 3 (carbonato de sodio), pH 11,0, a la otra mitad de la pastilla mitocondrial e incubar en hielo durante 30 min.
  4. Centrifugar a 100.000 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante y proceda al paso 3.5. Lyse el sedimento usando 30 l de tampón de lisis celular y se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6. Almacenar a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.
  5. Añadir un volumen igual de 20% de ácido tricloroacético recién hecho (TCA) al sobrenadante para precipitar las proteínas y mantener en hielo durante 30 min.
  6. CentrifUGE a 15.000 xg durante 10 min. Descartar el sobrenadante, disolver el precipitado en 80 l de tampón de lisis celular y se almacena a -80 ° C hasta que se utilizó en inmunotransferencia.

4. La separación de membranas interior y exterior de las mitocondrias (Aislamiento de Mitoplasts)

  1. Crecer de aproximadamente 20 x 10 7 células, cosecha, lavado una vez con PBS y aislar las mitocondrias como se describe en el apartado 1. Separar las fracciones mitocondriales en 10 porciones iguales antes de la última centrifugación para sedimentar las mitocondrias (antes de la etapa 1.3.4).
  2. Disolver cada sedimento en 30 l de la concentración indicada de tampón de sacarosa hipotónica (EDTA 1 mM, 10 mM MOPS / KOH (hidróxido de potasio), pH 7,2; concentración de sacarosa que oscila desde 25 hasta 200 mM) con o sin 50 mg / ml de tripsina ( véase la Tabla 1) y se incuba 30 min en hielo.
  3. Añadir 3 l de PMSF 10 mM (para llegar a una concentración final de PMSF 1 mM) a la tripsina que contiene viales para detener tque la digestión con tripsina y se incuba en hielo durante 10 min.
  4. Centrifugar a 14.000 xga 4 ° C durante 10 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, lisar el precipitado en 30 l de tampón de lisis celular, se somete a ultrasonidos como en el paso 1.3.6, y se almacena a -80 ° C

5. Construcción de mitocondrias-dirigida de GFP / RFP-etiquetados CyclinB1 / Cdk1 vectores y la confirmación de su localización mitocondrial

  1. Clonar la mitocondria secuencia de direccionamiento (MTS; derivado del precursor de la citocromo humano c oxidasa subunidad 8A (COX8) entre los nucleótidos 76 - 161) en marco en el extremo N-terminal de GFP o RFP en los sitios NheI y BamHI del pEGFP-N1 o pERFP vectores -N1 utilizando técnicas de clonación molecular estándar.
  2. En el diseño de cebadores de PCR para genes CyclinB1 y Cdk1, añadir BamHI sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (en negrita) al extremo 5 'de los cebadores de PCR.
    Reenviar BamH1 Cdk15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
    Revertir Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
    Adelante CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
    Revertir CyclinB1 BamH1 5 'TGG ATA ATC CTG CAC CAC CTT TGC AGC C
  3. Amplificar los genes Cdk1 y CyclinB1 utilizando estos cebadores siguiendo técnicas estándar. Digerir los productos de PCR con 1 l de enzima de restricción BamHI a 37 ° C durante 2 hr. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1%. El uso de una cuchilla de afeitar, cortar los fragmentos de ADN -sized correctas y purificar el ADN del gel usando un kit de extracción de gel.
  4. Digerir 1 g de MTS-pEGFP-N1 y plásmidos MTS-pERFP-N1 con 1 l de enzima BamHI a 37 ° C durante 2 horas. Añadir 1 l de Calf-Intestinal fosfatasa alcalina (CIP) durante 30 minutos a 37 ° C. Ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1% y purificar plásmidos lineales de gel como en el paso 5.3.
  5. Configurar una reacción de unión mediante la adición de 1 l de plásmido a partir del paso 5.4 y 5 l de Cdk1 o CyclinB1 del Paso 5.3 a 3 l de tampón ligasa, 0,5 l de T4 ligasa, y 20,5 l de dH2O Incubar O / N a 4 ° C.
  6. Transformar Escherichia coli DH5a competentes células con 10 l de mezcla de ligación siguiendo las técnicas estándar y crecer las bacterias en 10 mg / ml de kanamicina que contiene placas de agar LB O / N a 37 ° C para obtener colonias.
  7. Escoja una colonia de O / N placas adultos utilizando una punta de pipeta estéril, inserte la punta en un 5 ml de kanamicina-LB que contiene el tubo e incubar S / N. Aislar el plásmido utilizando kits de miniprep de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la secuencia del plásmido utilizando técnicas estándar.
  8. Transfectar crecimiento exponencial MCF1Células 0A (1,5 x 10 4 células sembradas en placas de 96 pocillos) con MTS-Cdk1-RFP o MTS-CyclinB1-GFP plásmidos de Paso 5.7 mediante la preparación de una relación de reactivo de plásmido / transfección de 1: 2 (w: v, 100 ng : 0,2 l) en 100 l de suero y medio libre de antibióticos.
  9. Se incuban las células en el plásmido mezcla / reactivo durante 48 horas a 37 ° C en una incubadora de CO 2 con control de humedad (5% de CO 2, 95% de humedad relativa).
  10. Preparar 1 mM solución madre de tintes fluorescentes rojos y verdes mitocondriales mediante la disolución de 50 g de polvo en 100 l de DMSO. Diluir las soluciones madre 1: 400 en PBS 1x para obtener 2,5 M soluciones de trabajo. Las soluciones madre pueden ser almacenadas a -20 ° C durante un año.
  11. Mezcle 2 l de 2,5 M de colorante rojo con 98 l de medio de cultivo para preparar una concentración final de 50 nM.
  12. Sustituir el medio de cultivo celular de CyclinB1-GFP teniendo células MCF10A (generados en la etapa 5.8) con el tinte rojo que contiene medio de 2 min. Repite elmismo procedimiento con colorante verde para las células MCF10A rodamiento Cdk1-RFP.
  13. Lavar dos veces con 100 l 1 x PBS para deshacerse del exceso de solución de tinción, se añaden 100 l de PBS 1x a la placa de 96 pocillos.
  14. Visualizar la mitocondria y CyclinB1-GFP (excitación por 488 nm y emisión a 494 hasta 536 nm) y Cdk1-RFP (excitación por 560 nm y emisión a 565 hasta 620 nm) en placas de 96 pocillos bajo el microscopio fluorescente a un aumento de 40X.

6. Identificación de proteínas diferencialmente fosforilados a través de 2D-DIGE

  1. Preparación de la muestra
    1. Aislar las mitocondrias y la lisis de las fracciones mitocondriales como en el paso 1.3. Añadir un volumen igual de 20% de TCA (ácido tricloroacético en agua) a cada muestra y agitar durante 15 seg. Incubar las muestras en hielo durante 30 min como las proteínas precipitan fuera de la solución.
    2. Centrifugar las muestras a 9.300 xga 4 ° C durante 5 min, eliminar el sobrenadante y añadir 60 l de acetona fría (100%), seguido decentrifugación a 9300 xga 4 ° C durante 5 min.
    3. Repita el paso de lavado acetona (Paso 6.1.2) una vez más, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las muestras en 50 l de tampón de etiquetado DIGE (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, Tris 30 mM, pH 8,5).
  2. Preparar el tintes fluorescentes
    1. Preparar la solución madre: Disolver colorantes (5 nmol) en 5 l de formamida fresca de dimetilo (DMF) a una concentración final de 1 nmol / l. La solución madre de tinte a -20 ° C hasta su uso durante unos meses.
    2. Preparar la solución de trabajo: Permitir a los tintes para establecer a temperatura ambiente durante 5 min. Diluir 1 l de colorante con 4 l de DMF a una concentración final de 200 pmol / l. Mantener en hielo durante el uso. Nota: La solución de trabajo se puede mantener a -20 ° C durante 3 semanas.
  3. Las proteínas de la etiqueta
    1. Mezclar 1 l de solución de colorante por 12,5 g de proteína de trabajo. Ampliar según sea necesario. Para los estándares agrupados, agregar 61; l de solución de trabajo Cy2 a 300 g de proteína agrupados.
    2. Vortex durante 30 segundos y se centrifuga a 4 ° C durante 30 segundos a 12.000 x g. Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min. Detener el etiquetado mediante la adición de 1 l de 10 mM de lisina por 1 l de solución de trabajo utilizados. Mezclar bien e incubar en hielo en la oscuridad durante 10 min.
    3. Piscina etiquetados individualmente y mezclar las muestras con tampón de rehidratación (7 M urea, tiourea 2 M, 4% CHAPS, 1,2% destreak, 1% pharmalytes, azul de bromofenol). Volumen total será de 125 l.
    4. muestras de vórtice durante 30 segundos y permita que las muestras fijaron a temperatura ambiente durante 30 min. Carga 125 l de muestras sobre 7 cm pH 4-9, enfoque isoeléctrico (IEF) tiras.
  4. Primera dimensión electroforesis
    1. Coloque los soportes de tira (ataúdes) en la placa de electrodos, asegurándose de que los titulares de la tira son completamente limpia y seca. Pipetear 125 muestras l en un ataúd, extendiendo uniformemente a través de todo el ataúd.
    2. usando tweezers, recogen la tira IEF, retirar con cuidado la cubierta protectora de plástico, y lo colocan (lado gel de abajo) en tampón ataúd / rehidratación. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Llenar lentamente el ataúd (1 - 1,5 ml) con aceite mineral y colocar el ataúd cubre a los ataúdes.
    3. Comience enfoque isoeléctrico siguiendo el protocolo en la Tabla 2:
      Nota: Una vez que la ejecución se ha completado, las tiras pueden ser almacenadas en tubos de plástico a -80 ° C o directamente trasladaron a equilibración y la segunda dimensión.
  5. Segunda dimensión - dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE)
    1. Equilibrio
      1. Descongelar el tampón de equilibrado SDS (8 ml por cada tira, 6 M de urea, glicerol al 30%, SDS al 2%). Pesar ditiotreitol (DTT; 10 mg TDT por 1 ml de tampón de equilibrio SDS). Disolver la TDT en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      2. Pesar IAA (yodoacetamida, 25 mg de IAA por 1 ml de tampón de equilibrio SDS).Disolver IAA en 4 ml tampón de equilibrado SDS.
      3. Derretir 1 ml de sellado solución de agarosa en un baño de agua para su uso posterior.
      4. Si se congelaron las tiras, permitir que se descongelen por completo. Coloque las tiras de gel de lado arriba en la bandeja reswelling. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con DTT a cada tira y se incuba durante 15 min con agitación suave.
      5. Retirar todo el tampón de equilibrado SDS con TDT. Añadir 4 ml de tampón de equilibrado SDS con IAA a cada tira y se incuba durante otros 15 min con agitación suave. Después del equilibrado con el tampón de IAA, se vierte el tampón de equilibrado de SDS.
    2. SDS-PAGE
      1. Desenvolver minigeles, retire el peine y enjuague el gel y los pocillos con ddH2O Retire la cinta blanca en la parte inferior del gel antes de ejecutar. Orientar correctamente la tira en el gel, gel de orientación es fundamental para el corte in situ.
      2. Coloque la plana gel en barra con la placa pequeña arriba y de arriba hacia gel de correoxperimenter. Coloque la tira sobre la placa de altura con el extremo anódico (++ terminar con el código de barras) que mira hacia el lado izquierdo de la gel. Usando una regla, empujar lentamente la tira hacia abajo sobre la superficie del gel. Evitar que queden atrapadas burbujas de aire entre la banda y el gel. Colocar el gel en un soporte de la placa de vidrio.
      3. Añadir 1 ml de solución de agarosa de sellado caliente para la apertura de la cassette. Asegúrese de que todas las burbujas de aire se presionan a cabo usando una regla plana. Montar el aparato y correr el gel a una constante de 125 V durante 90 min.
      4. Cuando el gel se haya ejecutado, colocar el gel en un generador de imágenes biomoleculares con 2 ml ddH2O y escanear el gel en el modo de adquisición de fluorescencia con láser de 635 nm de excitación y 665 nm de emisión filtro.
    3. La tinción fosfoproteína
      1. Fijar el gel con 50% de metanol y la mezcla de ácido acético al 10% (10 ml) durante 30 min dos veces. Lavar con 10 ml de agua durante 10 minutos tres veces y mancha con 10 ml fosfoproteína mancha durante 60-90 min, seguido dedecoloración con 10 ml de solución decolorante durante 30 minutos tres veces.
      2. Lavar con 10 ml de agua 5 min dos veces y la imagen de gel con un escáner de gel láser a 532 nm / 560 nm de excitación / emisión.
    4. La digestión de proteínas e Identificación
      1. Impuestos Especiales toda la expresados ​​diferencialmente manchas de proteínas desde el gel en pocillos de la microplaca utilizando un spot-selector de robot de acuerdo con las especificaciones del fabricante, y añadir bicarbonato de amonio 100 mM (2 ml) durante 1 hora a RT a destain las piezas de gel. Deshidratar con 2 ml 100% de acetonitrilo se lava dos veces y se seca en un concentrador de vacío durante 30 min.
      2. Rehidratar las piezas de gel con 100 l de 13 ng / l tripsina porcina modificada en bicarbonato de amonio 50 mM durante 16 horas a 37 ° C. Recoger los sobrenadantes y extraer aún más las proteínas con 100 l de ácido trifluoroacético 5% en 50% de acetonitrilo durante 30 min.
      3. Concentrar los péptidos de hasta 5 l mediante vacío concent centrífugarator y analizar con láser asistida por matriz de desorción ionización - tiempo de vuelo - tandem análisis espectrometría de masas (MALDI TOF-MS / MS) 17.

7. In Vitro Ensayo de quinasa

  1. Preparación de sustratos
    1. I (IC) subunidades sub-clon complejas (NDUFV1, NDUFV3, Ndufs2, NDUFB6, y NDUFA12), que se identifican como blancos Cdk1 diferencialmente fosforilados, en pGEX-5X-1 vectores que generan glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetados expresión bacteriana plásmidos 11. Purificar subunidades IC utilizando las columnas de alta afinidad de glutatión siguiendo el protocolo a continuación.
      1. Cultura GST-tagged subunidad CI que contiene Escherichia coli cepa BL-21 en medio Luria-Bertani (LB) caldo con 50 g / ml de ampicilina en un agitador a 37 ° C hasta una densidad óptica (DO) de 0,6 se alcanzó. Añadir isopropil-BD-tio-galactopiranósido (IPTG) al cultoure a una concentración final de 0,1 mM, y se incuba durante un 3 h adicionales.
      2. Centrifugar a 600 xg durante 10 min para recoger las bacterias y volver a suspender en 5 ml de 1 x tampón de PBS que contiene 5 mM de DTT 1 x cóctel inhibidor de proteinasa, y 0,1% de lisozima. Lyse las células por sonicación durante veinte 5 s ráfagas, y eliminar los restos celulares por centrifugación a 600 xg durante 10 min.
      3. Recoger el sobrenadante e incubar con cuentas de 4B de glutatión-agarosa en una relación en volumen de 4: 1 (sobrenadante: perla) durante 1 hora a RT.
      4. La elución de las proteínas de fusión GST de las perlas con 3 ml de tampón de glutatión elución (10 mM de glutatión reducido en 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) y someter las proteínas eluidas a diálisis en tubo de membrana porosa molecular (peso molecular de corte 12 -14 kiloDaltons) con EDTA 1 x PBS / 1 mM. Almacenar las proteínas purificadas a - 80 ° C
  2. Cdk1 Ensayo de quinasa
    1. Antes de iniciar el culo quinasaay, establecer bloques de calentamiento a 30 ° C y 100 ° C. Descongelar complejo comercial CyclinB1 / Cdk1 enzima y los sustratos sobre hielo.
    2. Preparar la mezcla de reacción en hielo. Desde 32 isótopos P ATP está involucrado, preparar todas las mezclas de reacción en tubos de 1,5 ml de muestra con tapones de rosca que contiene una junta tórica para evitar la propagación de la radiactividad.
      Precaución: Siga las normas de protección de materiales radiactivos. Utilice un niño de 8 mm de espesor de plexiglás de blindaje y el trabajo por lo menos en condiciones de independencia mutua. Limpie cualquier área contaminada con agua.
    3. Preparar un tampón de reacción 30 l que contiene 1 x tampón de Cdk1 (50 mM Tris-HCl, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, EGTA 1 mM, 0,01% de Brij 35, pH 7,5), 0,6 mM ATP frío, 0,1 Ci 32 P ATP, 2 unidades de CyclinB1 / Cdk1 y 6 g de proteína sustrato. Ajuste el volumen a 30 l con ddH2O Para la reacción de control positivo, reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1, un sustrato CyclinB1 / Cdk1 bien conocido.
      1. Para contro negativol reacciones, (1) reemplazar el sustrato con única proteína GST y (2) reemplazar el sustrato con 0,01 mM de histona H1 + 0,5 M RO-3306, un inhibidor selectivo de Cdk1.
    4. Mezclar bien con la pipeta y se centrifuga para llevar todo el líquido al fondo del tubo, lo que minimiza el riesgo de contaminación. Incubar a 30 ° C durante 60 min.
    5. Añadir 6 l de tampón de muestra SDS 5x para detener la reacción y desnaturalizar a 100 ° C durante 10 min. muestras analizadas, el 10% SDS-PAGE gel a 160 V durante 2 horas, o hasta frente de colorante ha alcanzado el final del gel. Transferencia de gel sobre un papel de cromatografía y envolver con papel film.
      Precaución: Todo el líquido en contacto con radioisótopos debe ser tratado como residuo radiactivo y desecharse en un bidón de 5 galones poli proporcionada por los servicios de salud y seguridad ambiental de acuerdo con las directrices institucionales.
    6. Exponer el gel a una película de rayos X durante 1 día o hasta 1 semana a -20 ° C, dependiendo de la actividad específica del radioisótopo utilizadoy la enzima.

8. mutagénesis dirigida al sitio para generar dominante Cdk1 Negativo (D146N)

  1. Diseño cebadores de mutagénesis; dos cebadores, complementarios entre sí, que contiene el sitio mutante (G serán sustituidos por un nucleótido para codificar N en lugar de D aminoácido) flanqueada por 20 bases en cada lado 11.
  2. Preparar un 50 l Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) mezcla que contenía tampón de reacción 1x, dNTPs 2,5 mM, 10 mM de los cebadores (directa e inversa), 40 ng de la plantilla, y ddH2O Añadir 2,5 U de ADN polimerasa en la reacción.
  3. Ejecutar el siguiente programa de PCR: 95 ° C 3 min, 95 ° C 30 seg, 55 ° C 30 min, 68 ° C 6 min; 16 ciclos (Nota: 68 ° C tiempo de incubación se determina por el tamaño del ADN se requiere 1 min / kb de ADN ≤ 10 kb Para el ADN más grande, 2 min / kb, más 10 segundos por ciclo..). Siga por 68 ° C 7 min y mantener a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
  4. Añadir2 l de la enzima de restricción Dpn I (10 U / l) y 5,7 l Dpn I buffer, se mezclan bien con suave toque con el dedo e incubar la reacción a 37 ° C durante 1 hora.
  5. Transferencia de 10 l Dpn I tratados con productos de PCR en 50 l de células competentes DH5a para la transformación. Incubar en hielo durante 30 min, seguido de 45 segundos de choque térmico a 42 ° C y 5 min en hielo. Añadir 500 l de LB y agitar a 37 ° C durante 1 hora antes de placas en placas de agar LB. Incubar O / N a 37 ° C.
  6. Escoja una colonia de la O / N cultiva placas de agar utilizando una punta de pipeta estéril de color amarillo, la caída de la punta en un tubo que contiene 5 ml de LB, y crecer O / N en un agitador C 37 °. Aislar el plásmido utilizando un kit miniprep y la secuencia del plásmido para confirmar la mutación de acuerdo con el protocolo del fabricante.

9. Determinación del ciclo celular de fase longitudes con EdU Ensayo de incorporación

  1. Clasificación celular
    1. Transfect 2 x 10 5 células con los vectores indicados (MTS-GFP / RFP, MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-peso-RFP o MTS-Cdk1-dn-RFP) en una placa de 6 pocillos usando 1: 2 (w: v , 2,5 mg: 5 relación l) de ADN: reactivo de transfección mezcla preparada en 2,5 ml de suero y medio de cultivo libre de antibióticos durante 48 horas. ordenar las células vivas que expresan establemente las proteínas GFP-etiquetados CyclinB1 Cdk1 y RFP-etiquetados mediante citómetro de flujo.
      1. Lavar las células con 1 x PBS, añadir 100 l de tripsina en el plato y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Añadir 2 ml de medio de cultivo para recoger las células y pasar a través de un filtro de 70 micras para generar una suspensión de células individuales. Se lava la suspensión de células individuales con 500 l de 1% suero de ternera fetal en PBS (FCS / PBS) antes de cargarlos en citómetro de flujo.
      2. Configurar los parámetros de clasificación siguientes protocolos establecidos compuerta 18 para las células doble positivas teñidas con tanto GFP y RFP. Recoger las células clasificadas que sale del citómetro en un tubo contaiNing medio de cultivo celular y el uso de estas células para el análisis de la progresión del ciclo celular con el etiquetado EdU pulso-caza como en el protocolo 9.2.
  2. La medición de la duración del ciclo celular usando el ensayo de EdU Etiquetado Citometría de Flujo
    1. Se siembran las células ordenados en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 10 5 células por pocillo y la cultura de O / N a 37 ° C en una incubadora de CO 2. Añadir EdU al medio de cultivo a una concentración final de 25 mM. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 1 hora.
    2. Lavar las células con 1% de BSA en 500 l de PBS y recoger en un tubo de 1,5 ml a intervalos de 2 horas para un total de 10 a 12 hr.
    3. centrifugar las células a 350 xg durante 5 min, descartar el sobrenadante. Desalojar el sedimento por adición de 100 l de solución de fijación (proporcionado por el fabricante en el kit de marcaje de EDU) durante 15 min a RT y mezclar bien.
    4. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS tres veces. Arregla ellas células de nuevo con 0,5 ml de 70% de etanol O / N a 4 ° C.
      Nota: El etanol fijación es crítica para extinguir la fluorescencia de GFP / RFP interna debido a la expresión de proteínas recombinantes con etiqueta.
    5. Centrifugar las células de nuevo a 350 xg durante 5 min y se lava el sedimento con 1 ml de BSA 1% en PBS una vez. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de permeabilización (0,1% Triton-X-100, 1% de BSA, 0,2 mg / ml RNasa A en PBS) durante 20 min a TA.
    6. Lavar las células con 1 ml de 1% de BSA en PBS una vez. Añadir 0,5 ml de mezcla de reacción en cada tubo y mezclar bien. Incubar mezcla de reacción a TA durante 30 min en la oscuridad.
    7. Lavar con 1 ml de 1% BSA en PBS una vez y el ADN mancha con 50 mg / ml de yoduro de propidio (PI) en 1 ml de BSA 1% en PBS.
    8. Analizar las células por citometría de flujo para seguir la población EdU-positivo. Presente gráfico de puntos de dispersión de las células marcadas con EdU teñidas para contenido de ADN (tinción PI, eje X) y Edu (Alexa 647 de tinción, eje Y).
      1. Utilizar el canal de APC para AlexA647-edu utilizando un filtro de paso de banda de 670/30 con todos los presentes luz inferior a 685 nm golpear ese filtro; y ficoeritrina (PE) de canal para PI con un filtro de paso de banda de 581/15 delante de ella con todos los presentes luz inferior a 600 nm golpear ese filtro.
      2. Introduzca las primeras células tubulares que contiene en la citometría de flujo y el uso de una estrategia de compuerta estándar para la adquisición: Parcela FSC-Zona X SSC-Área de la morfología seguido por PI (canal PE) X Alexa647-EDU (canal APC) para la tinción de células. datos de registro para todos los tubos uno por uno adquisición de 10.000 eventos por muestra.
      3. Determinar la distribución de fase del ciclo celular de las células y las longitudes de fase utilizando una citometría de flujo de software de análisis de datos siguiendo los protocolos establecidos 11,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sub-localización mitocondrial de CyclinB1 y Cdk1

extracción de carbonato de sodio se utiliza para determinar si una proteína se encuentra dentro de la mitocondria o en la superficie exterior, a saber, la membrana exterior. Una vez que se muestra una proteína de localizar dentro de la mitocondria, mas la determinación de la sub-localización mitocondrial puede realizarse a través mitoplasting combinado con la digestión de la proteasa. Para especificar la localización sub-mitocondrial de CyclinB1 o Cdk1, mitoplasts se aislaron diluyendo mitocondrias en tampones hipotónicos con concentraciones decrecientes de la sacarosa osmótica de 200 mM a 25 mM. La membrana externa comienza a romperse a 150 mM de sacarosa, mientras que la membrana interna se mantiene intacta hasta que la concentración final a 25 mM de sacarosa (Figura 1A). En combinación con mitoplasting, ensayo de protección de proteasa puede realizarse usando de Disparospara digerir las proteínas expuestas después de la rotura de la membrana externa. Esto dará lugar a la digestión de las proteínas espacio intermembrana. Si la proteína de interés está protegido de la digestión con tripsina, esto indica la localización matriz mitocondrial de la proteína. En esta figura representativa, proteína de la matriz mitocondrial Hsp60, y la proteína espacio intermembrana Timm13 se utilizaron como marcadores de sub-localización mitocondrial. Similares con Hsp60 pero a diferencia de Timm13, CyclinB1 y Cdk1 estaban protegidos de la digestión de tripsina, lo que indica su localización mitocondrial matriz (Figura 1B).

La expresión mitocondrial de MTS- y CyclinB1 GFP-etiquetados y Cdk1 Proteínas

MTS es clonado en marco en el extremo N-terminal de CyclinB1 o Cdk1 genes, que tiene las etiquetas GFP o RFP en su C-terminal. La proteína recombinante resultante es mitocondrias orientada GFP o RFP-Cy etiquetadoclinB1 o Cdk1. La lista de las construcciones generadas y utilizadas en este estudio se muestra en la figura. El uso de estas construcciones, la sobreexpresión de CyclinB1 y / o Cdk1 en la mitocondria se logró, que se muestra aquí por transferencia Western de las fracciones mitocondriales aislados (Figura 2).

Los objetivos potenciales mitocondriales de CyclinB1 / Cdk1 Determinados por 2D-DIGE

Cdk1 pertenece a la serina / treonina (S / T) de la familia quinasa que cataliza la transferencia de un fosfato del ATP a la prolina (P) -oriented S o T residuos. Una mutación puntual que sustituye a un residuo de aspartato (D) con asparagina (N) en la posición 146 de Cdk1 (D146N) genera una dominante negativa (dn) Cdk1 mutante 19. Para estudiar la función de Cdk1 mitocondrial, una proteína Cdk1-dn mitocondrias orientada fue generado mediante la construcción de un plásmido (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn) que contiene un 29 amino ácido-long mitocondrial secuencia de direccionamiento (MTS) derivado de la subunidad VIII de la citocromo C oxidasa humana ligada a RFP-tagged dn-Cdk1. pERFP-N1-MTS producir proteínas PFRE mitocondrias-dirigidos se utilizó como un control de vector vacío. fosfoproteínas mitocondriales en G2 / M células transfectadas con ambas construcciones fueron perfilados por análisis de gel 2D con pH 4-10 tiras de gel. En comparación con los transfectantes de vector vacío (Figura 3, panel superior), un grupo de fosfoproteínas mitocondriales era aparentemente ausente o disminuido en el Cdk1-dn transfectantes (Figura 3, panel inferior). análisis de espectrometría de masas de las manchas detectadas determinó la identidad de las proteínas fosforilados por Cdk1 en la mitocondria.

La progresión del ciclo celular y la determinación de la fase de ensayo con longitudes de pulso-caza EdU

Para investigar la progresión del ciclo celular cuando planeesn CyclinB1 mitocondrial / niveles de Cdk1 se incrementan, un experimento de etiquetado pulso-caza usando un análogo de la timidina, se realizó desoxiuridina etinilo (EDU) para etiquetar la población de células que experimentan síntesis de ADN 20. Este método permite la visualización de ciclo celular capturado sobre una ventana de 22 horas mediante el seguimiento de la población EdU-positivo cuando las células progresan a través de S y G2 / M fases y se acumulan en la fase G1. Los resultados muestran que las células en fase S etiquetados progresaron a través de la fase G2 / M y aparecieron en fase G1 tan rápido como 4 h en células que expresan de tipo salvaje CyclinB1 mitocondrial / Cdk1, en comparación con 6 h en células transfectadas con un control de vector o CyclinB1 mutante / Cdk1 (Figura 4A), lo que indica que la mejora de CyclinB1 mitocondrial / Cdk1 acelera la progresión del ciclo celular.

Figura 1
Figura 1. mitocondrial ciclina1 / Cdk1 se localiza en la matriz. (AB) Sub-mitocondrial localización de CyclinB1 y Cdk1 detectados por mitoplasting y ensayo de protección de la proteasa, la figura ha sido modificado a partir de Wang et al., 2014 11. El total (T), pellet (P), y las fracciones de sobrenadante (S) se sometieron a análisis de transferencia Western con anticuerpos indicados. TIMM13 (una proteína inter-espacio), y Hsp60 (una proteína de la matriz). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Expresión de constructos mitocondriales Cdk1. Western Blot de las fracciones mitocondriales aisladas a partir de células transfectadas con CyclinB1 mitocondrias-dirigida y / o de tipo salvaje o mutante dominante negativo Cdk1 (plásmidos se indican en la parte inferior 11. pEGFP-N1-MTS y los vectores pERFP-N1-MTS eran controles de vectores vacíos para MTS-CyclinB1 y MTS-Cdk1, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. potenciales mitocondriales Sustratos de Cdk1. Las proteínas mitocondriales extraídos de las células G2 / M-tocado techo transfectadas con mitocondrias orientados por el vector vacío (pERFP-N1-MTS, panel superior) o Cdk1 mutante (pERFP-N1-MTS-Cdk1-dn, panel inferior) fueron etiquetados con Cy5 (verde), separados por electroforesis en gel 2-D y proteínas fosforiladas se tiñeron con colorante fosfoproteína (rojo). Esta cifra ha sido modificado a partir de Wang et al. 2014 11."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Mejora mitocondrial Cdk1 G2 / M transición y la progresión del ciclo global.
Análisis del ciclo celular con el etiquetado EdU pulso-caza. histogramas gráfico de dispersión de células marcadas con EdU se extrajeron el contenido de ADN (eje X) y Edu (eje Y). Las cifras más bajas de los dos gráficos muestran la intensidad de fluorescencia media de la UDE etiquetado núcleos. Los puntos de tiempo se indican en h después del pulso EdU 11. Para todos los puntos de tiempo, se extrajeron puertas que exhiben las siguientes poblaciones: G0 / G1, S y G2 / M. Para momentos de la hora 6, 8, y 10-hr, educación etiquetado G1 *, S / G2 *, y G2 / M * poblaciones se muestran. Esta cifra ha sido modificado a partir de Wang et al., 2014 11. Por favor, haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las concentraciones de sacarosa usados
sin tripsina 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM
+ tripsina 25 mM 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM

Tabla 1. hipotónicas de sacarosa tampones usados ​​para el paso 4.2

Paso 1 30 V 12 hr Paso y Espera
Paso 2 300 V 0,5 horas Paso y Espera
Paso 3 1.000 V 0,5 horas Gradiente
5.000 V 1.33 hr Gradiente
paso 5 5.000 V 20.000 V hr Paso y Espera

Tabla 2. Protocolo isoeléctrico usados ​​para el paso 6.4.5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras 21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de genes a proteínas diana específicas en la mitocondria 11,23,24. Aquí, CyclinB1 y Cdk1 genes fueron clonados en MTS COX8 que contienen vectores y después de la expresión, la CyclinB1 recombinante y Cdk1 se localizaron en las mitocondrias. La ventaja de este enfoque es que permite la modificación de la expresión génica en un determinado compartimiento subcelular, en este caso las mitocondrias, sin cambiar la expresión génica global. Con esta estrategia, las mitocondrias específicas de las funciones de una quinasa nuclear, se Cdk1 Deminada. Del mismo modo, mediante la adición de MTS a un Cdk1 dominante negativo, tumbar de las funciones específicas de las mitocondrias-Cdk1 se logró, lo que permitió la identificación de las mitocondrias objetivos específicos de Cdk1, y permitió el análisis de las consecuencias funcionales de la ausencia de la función mitocondrial Cdk1. La sobreexpresión de Cdk1 sin la etiqueta de resultados de MTS en una mayor expresión de Cdk1 tanto en las mitocondrias y el núcleo, y por lo tanto complica la profunda investigación de las consecuencias de las acciones específicas de las mitocondrias-Cdk1.

Sin embargo, este enfoque puede no ser adecuado para todos los productos de los genes que hemos experimentado algunos intentos fallidos de la reubicación de algunas quinasas en la mitocondria a través de la adición de la etiqueta MTS. Algunas líneas de células pueden ser muy resistentes a la transfección, y encontrar el protocolo óptimo pueden llevar mucho tiempo. Incluso cuando las células son sanas y la transfección tiene éxito, el trabajo con proteínas fluorescentes etiquetadas presenta algunos problemas such como la agregación, la localización incorrecta, fusiones no funcionales, y las señales débiles.

Las principales limitaciones del aislamiento de las mitocondrias y mitoplasts incluyen el bajo rendimiento y la posible contaminación de otros compartimentos celulares o sub-mitocondriales. Se sugiere que las células adherentes no se rompen de manera eficiente por métodos químicos o mecánicos convencionales, por lo tanto, por lo que es difícil obtener grandes cantidades de las mitocondrias de las células adherentes cultivadas. En este caso, hemos utilizado cultivos adherentes de las células MCF10A. Para producir aproximadamente 30 - 50 g de proteína mitocondrial, una cantidad de partida 3 - 5 x 10 7 se utilizaron células. La etapa de homogeneización es otro punto crítico para el rendimiento final de las preparaciones mitocondriales. En función de las líneas celulares utilizadas, el número de golpes y / o tiempo de homogeneización puede variar. Para las células MCF10A, se observó que se requiere 10 minutos de homogeneización por homogeneizador de vidrio / vidrio, mientras que fibrobla de embriones de ratónpts (MEF) requiere sólo un 3 - 5 min de homogeneización. Desde homogeneización excesiva puede causar daño a la membrana mitocondrial y desencadenar la liberación de componentes mitocondriales, las condiciones estándar para cada línea celular deben ser determinados por la experiencia. El uso de un homogeneizador de vidrio-vidrio aumenta el rendimiento de las preparaciones mitocondriales en comparación con homogeneizadores de vidrio / teflón. El importe de partida de las células, así como la congelación / descongelación de las células pueden alterar el número de golpes necesarios para romper las células. Por último, la desnaturalización de proteínas y la agregación pueden ocurrir debido a un calentamiento localizado de la muestra durante la homogeneización. Es, por lo tanto, esencial para pre-enfriar el triturador de tejidos y mantener las muestras en hielo durante este procedimiento.

Otro método que se presenta en este artículo es el uso del etiquetado EdU para controlar el ciclo celular en tiempo real. EdU es un análogo de la timidina modificada que se fluorescentemente marcado con un colorante brillante, fotoestable Alexa Fluor. EdU es eficientemente incorporada en el ADN recién sintetizado. Este método es una alternativa mejor que el uso del etiquetado tradicional de la proliferación de células con el análogo de nucleósido, bromodesoxiuridina (BrdU). BrdU se incorpora en el ADN durante la síntesis de ADN activo. La cuantificación de ADN marcadas con BrdU requiere la desnaturalización del ADN por métodos relativamente agresivos, tales como alta temperatura o alta acidez para exponer las moléculas de unión de los anticuerpos para BrdU BrdU. El tratamiento dura para la desnaturalización del ADN puede afectar a la calidad de la muestra y es mucho tiempo. Con EdU, permeabilización detergente es generalmente suficiente para que el reactivo de detección EdU para acceder al ADN. Sin la necesidad de utilizar productos químicos o calor para el acceso ADN, el método EdU es más fácil de usar, más precisa y consistente. Aparte de las ventajas EdU ofrece, ha habido algunas preocupaciones con respecto a la utilización de EdU para estudiar la proliferación. EdU mostró una actividad anti-proliferativa débil en el tratamientos de más de 72 horas, que puede ser reducido a desdniveles igible cuando el pulso EdU se mantuvo a 1 hora 25.

Una modificación empleada con el etiquetado EdU es el tiempo de fijación y método. El kit sugiere una fijación 15 min con la solución de fijación proporcionado. Sin embargo, una fijación adicional con 70% de etanol se utilizó en este experimento. Hay dos razones para el uso de etanol: 1) para seguir la progresión del ciclo celular con el tiempo, se realizó un experimento de punto de tiempo, donde se recogieron las células cada 2 hr. Las células se mantuvieron en etanol al 70% a 4 ° C hasta que todos los puntos de tiempo experimentales se han completado. En realidad, las células se pueden mantener en 70% de etanol durante más tiempo (de varias semanas a meses) si es necesario. 2) Las células utilizadas para el experimento se transfectaron de forma estable con Cdk1 GFP-etiquetados y / o CyclinB1 RFP-tagged. Para separar las señales EdU y PI de la fluorescencia de GFP / RFP, la fijación de etanol se utiliza para desnaturalizar las proteínas GFP y RFP, y por lo tanto saciar su fluorescencia antes de realizar la EdU unad tinción PI. Proteínas GFP / RFP desnaturalizadas son esencialmente totalmente no fluorescente, presumiblemente porque el cromóforo ya no está protegido de temple 26,27.

Para identificar objetivos mitocondriales de Cdk1, se utilizó el método 2D-DIGE, que es superior a geles 2D tradicionales de muchas maneras. En 2D-DIGE, colorantes fluorescentes diferentes, por ejemplo, Cy 3, 5 y 2, se utilizan para las muestras de la etiqueta, lo que permite que se ejecutan hasta 3 muestras en un gel, reduciendo la variabilidad sin la necesidad de ejecutar repeticiones, como en gel 2D estándar. Los colorantes fluorescentes utilizados en 2D-DIGE tienen una muy alta sensibilidad de 0,2 ng / punto de comparación con la de colorantes de trifenilmetano en 100 ng / mancha, por lo tanto, que requiere menor cantidad de proteínas correr en los geles 2D-DIGE con resolución de punto alto y exploraciones de gel calidad de publicación. Un software automatizado se utiliza para detectar, cuantificar y definir proteínas expresadas diferencialmente. Debido a la alta resolución lugar, la expresión diferencial de proteínas en muestras de can compararse con precisión utilizando la cuantificación punto de software asistida; una diferencia tan bajo como 10% se puede detectar a través de 2D-DIGE, que permite la visualización de las modificaciones post-traduccionales fácilmente. El uso de programas informáticos de ayuda en-gel de análisis también permite la adquisición de datos más rápida. Sin embargo, puesto que los equipos, tales como escáneres fluorescentes, son necesarios para la adquisición de imágenes, el uso de este método implica costos adicionales. Otras limitaciones de 2D-DIGE incluyen la escasa representación de proteínas hidrófobas, así como proteínas con puntos isoeléctricos extremas y pesos moleculares grandes 28,29. Se requiere una mayor validación de los resultados obtenidos con 2D-DIGE utilizando técnicas alternativas, como la inmunocitoquímica o western blot para confirmar nuevos hallazgos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32P ATP  PerkinElmer BLU002001MC 
Anti-mouse secondary antibody Invitrogen  A-11003 Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody Invitrogen  A11029 Alexa-488 conjugated
ATP Research Organics 1166A For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody Cell Signaling Technology 9112
Cdk1 kinase buffer New England Biolabs P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Life Technologies C10337 For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody Cell Signaling Technology 4844S For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody Santa Cruz Biotech sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex New England Biolabs P6020S Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit GE Healthcare Life Sciences 25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit GE Healthcare Life Sciences 28-9480-26 AA
Dimethylformamide  Sigma Aldrich 319937 DMF
Dithiothreitol Bio-Rad 161-0611 DTT
dNTP EMD Millipore 71004 For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme Stratagene 200519-53 For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid GE Healthcare Life Sciences 17-1335-01 Used as mineral oil
EDTA J.T. Baker 4040-03
EGTA Acros Organics 409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator Fisher Scientific 07-748-13 Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01 Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences 649908 For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1 Calbiochem 382150 For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels GE Healthcare Life Sciences 18-1016-61 IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione Thermo Scientific 15160 Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit GE Healthcare Life Sciences 11-0033-64 IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside  RPI Corp 156000-5.0 IPTG
Leupeptin Sigma Aldrich L9783 For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668027 Transfection reagent
Lysine Sigma Aldrich L5501 For CyDye labeling
Lysozyme EMD Chemicals 5960
Mitoctracker Red/Green Invitrogen  M7512/M7514 Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS EMD Chemicals 6310
pEGFP-N1 Clonetech 6085-1 GFP-expressing vector
Pfu Stratagene 600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Life Sciences 28-9545-53 GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride Shelton Scientific IB01090 PMSF
Phosphate buffered saline Life Technologies 14040 PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing Spectrum Labs 132700 as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain Life Technologies P-33300 For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail Calbiochem 539134 For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit Stratagene 200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306 Alexis Biochemicals 270-463-M001 Cdk1 inhibitor
Rotenone MP Biomedicals 150154 Complex I inhibitor
Sodium carbonate Fisher Scientific S93359
Sodium chloride EMD Chemicals SX0420-5 For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate Alfa Aesar 33385 For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar L03425 For cell lysis buffer
SpectraMax M2e  Molecular Devices M2E Microplate reader
Sucrose Fisher Scientific 57-50-1
Tissue Grinder pestle Kimble Chase 885301-0007 For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube Kimble Chase 885303-0007 For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution Sigma Aldrich T0699 TCA
Tris MP Biomedicals 103133
Triton-x-100 Teknova T1105
Trypsin Calbiochem 650211
Typhoon Imager GE Healthcare Life Sciences 28-9558-09 Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone Sigma Aldrich C7956

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12, (6), 658-665 (2000).
  3. Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26, (2), 301-310 (2007).
  4. Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17, (11), 563-569 (2007).
  5. Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
  6. Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221, (3), 1027-1043 (1991).
  7. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197, (3), 563-576 (1991).
  8. Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29, (4), 499-515 (2006).
  9. Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (5), 1930-1935 (2010).
  10. Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40, (3), 356-361 (2008).
  11. Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29, (2), 217-232 (2014).
  12. Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123, (6), 1010-1016 (1998).
  13. Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52, (4), 433-440 (2011).
  14. Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58, (1), 45-52 (2004).
  15. Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49, (1), 525-527 (2010).
  16. Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3, (9), 1758-1766 (2003).
  17. Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. Unit 10.25 (2009).
  18. Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. Macey, M. G. Humana Press. 257-276 (2007).
  19. van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  20. Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1, (2), 859-869 (2006).
  21. Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353, (5), 1011-1020 (2005).
  22. Karniely, S., Pines, O. Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6, (5), 420-425 (2005).
  23. Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5, (3), 166-175 (2013).
  24. Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5, (8), e12341 (2010).
  25. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, (7), 626-636 (2008).
  26. Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13617-13622 (1996).
  27. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  28. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, (3), 669-678 (2005).
  29. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8, (23-24), 4886-4897 (2008).
  30. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. (2011).
Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).More

Candas, D., Qin, L., Fan, M., Li, J. J. Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1. J. Vis. Exp. (108), e53417, doi:10.3791/53417 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter