वास्तविक समय कोशिकी फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग फूट डालना एम 1 और एम 2 अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज की मेटाबोलिक विशेषता

Summary

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Abstract

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M_(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M_(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.

In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.

Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).

The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.

Introduction

मैक्रोफेज लगभग सभी रोगों में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, उनके लक्षण प्रारूप को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र अभी भी पूरी तरह से सुलझाया नहीं कर रहे हैं। मैक्रोफेज उच्च विविधता को प्रदर्शित करने और microenvironment के जवाब में अलग phenotypes ¹ अपनाने। एलपीएस (+ IFNγ) प्रतिष्ठित एम 1 या एम _{(एलपीएस)} मैक्रोफेज सूजन को बढ़ावा देने और माइक्रोबियल खतरों ² के विभिन्न प्रकार के खिलाफ मेजबान की रक्षा सक्रिय प्रेरित। दूसरों एम 1 ध्रुवीकरण बटोर उत्तेजनाओं के रूप में टीएनएफ के साथ अकेले या संयोजन में IFNγ का उपयोग करें। आईएल -4 और / या आईएल -13 विकल्प बृहतभक्षककोशिका सक्रियण लाती है और इन M2 या एम _{(आईएल 4)} कोशिकाओं प्रबल दमन और ³ चल रहे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियंत्रकों हैं। फूट डालना मैक्रोफेज एलपीएस सक्रिय एम 1 मैक्रोफेज बढ़ाया ग्लाइकोलाइसिस ^4-6 एक चयापचय स्विच के दौर से गुजर के साथ सेलुलर चयापचय की एक विशिष्ट विनियमन प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, बढ़ाया फैटी एसिड ऑक्सीकरण (एफएओ) और माइटोकॉन्ड्रियल oxidativई फास्फोरिलीकरण (OXPHOS) आईएल -4 प्रेरित M2 मैक्रोफेज ^7-9 में निरंतर ऊर्जा प्रदान करता है। इस प्रकार, बदल चयापचय यह उचित ध्रुवीकरण और भड़काऊ विनियमन के लिए एक शर्त है, न ही ध्रुवीकृत बृहतभक्षककोशिका सबसेट की एक विशेषता यह भी है। महत्वपूर्ण बात है, ग्लाइकोलाइसिस या OXPHOS के निषेध / एफएओ क्रमश: ^8,10, एम 1 या M2 सक्रियण ख़राब प्रदर्शन किया गया है। जैसे, मैक्रोफेज में पहचान के चयापचय में परिवर्तन उनके ध्रुवीकरण की स्थिति और भड़काऊ क्षमता का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।

बृहतभक्षककोशिका चयापचय उपाय है कि एक सुसंगत परख इसलिए एक दवा, जीन नीचे दस्तक भविष्यवाणी है कि क्या करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अन्य उपचार बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण और समारोह को प्रभावित करता है। इस वीडियो में, एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक भोले, एम 1 और M2 मैक्रोफेज की बायोइनरजेटिक्स प्रोफाइल को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

यह पांडुलिपि माप की अनुमति देता है कि एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का विवरणसभी प्रासंगिक ग्लाइकोलाइसिस मानकों (ग्लाइकोलाइसिस, अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइसिस और ग्लाइकोलाइटिक आरक्षित) और एक ही परख में माइटोकॉन्ड्रियल समारोह विशेषताओं (कुल श्वसन, बेसल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, एटीपी उत्पादन, प्रोटॉन रिसाव, अधिक से अधिक श्वसन और स्पेयर सांस की क्षमता) की। इस प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करना, बायोइनरजेटिक्स कोशिकाओं (ट्रांसजेनिक overexpression या औषधीय उपचार नीचे दस्तक जैसे जीन) नियंत्रण और 'बदल' के बीच तुलना की जा सकती।

Protocol

1. संवर्धन और ध्रुवीकरण अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज 0 दिवस: ब्याज के 6-10 सप्ताह पुरानी चूहों से अलग फीमर और टिबिया हड्डियों (इस परख में C57BL / 6)। हड्डियों से मांसपेशियों के ऊतकों को निकालें और ठंडा पीबीएस से भरा एक 9 सेमी पेट्री डिश में हड्डियों जगह है। 70% इथेनॉल के साथ भरा एक 9 सेमी पेट्री डिश के लिए हड्डियों स्थानांतरण और धीरे 30 सेकंड के लिए थाली हिला। ठंडा बाँझ पीबीएस के साथ भरा एक ताजा 9 सेमी पेट्री डिश के लिए हड्डियों स्थानांतरण। बाँझ कैंची से दोनों सिरों पर फीमर और टिबिया कट। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज और एक 25 जी सुई का उपयोग 10 मिलीलीटर ठंडा बाँझ पीबीएस के साथ हड्डियों फ्लश। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अस्थि मज्जा लीजिए। एक 23 जी सुई का उपयोग कर एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं स्थानांतरण। एक 25 जी सुई के साथ इस चरण को दोहराएँ। नोट: ये कदम सेल clumps और अस्थि अवशेषों को हटाने की जरूरत है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। समर्थन त्यागेंernatant और 40 मिलीलीटर सेल संस्कृति के माध्यम से (RPMI 1640 प्लस 2 मिमी एल glutamine, 10% एफसीएस, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और 15% फ़िल्टर्ड एल 929 सेल में कोशिकाओं resuspend ( ATCC, सीसीएल -1) एल 929 सेल-वातानुकूलित माध्यम की बजाय एम-सीएसएफ (या वैकल्पिक रूप से 10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक एम-सीएसएफ युक्त -conditioned माध्यम)। नोट: एल 929 सेल-वातानुकूलित माध्यम की पीढ़ी 2013. 11 में पहले इस पत्रिका में विस्तृत था संस्कृति एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्रति प्लेट 20 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम में दो 15 सेमी पेट्री डिश (बृहतभक्षककोशिका इस प्लास्टिक से अलग नहीं होगा क्योंकि सेल संस्कृति का इलाज प्लेटों का उपयोग नहीं करते हैं) में एक माउस से कोशिकाओं। 20 मिलीलीटर पुराने सेल संस्कृति के माध्यम से हटाने के बिना, दिन 3 पर 10 मिलीलीटर ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ें। ऐसा करने से दिन 6 पर 20 मिलीलीटर ताजा संस्कृति के माध्यम से एक थाली के पुराने मध्यम बदलें, गैर पक्षपाती कोशिकाओं को भी हटा दिया जाएगा। दिवस 8: उन्हें 5 मीटर incubating द्वारा कोशिकाओं को अलग(autoclaved एच 2 ओ में 135 मिमी पोटेशियम क्लोराइड प्लस 15 मिमी सोडियम साइट्रेट,) 37 डिग्री सेल्सियस से कम में 10 मिलीलीटर साइट्रेट खारा और में 10 मिलीलीटर पीबीएस से धो लें। एक सेल काउंटर का उपयोग दिन 8 पर परिपक्व अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) की गणना करें। दृश्य निरीक्षण द्वारा या प्रवाह cytometry द्वारा परिपक्व का गठन (CD11b + F4 / 80 +) BMDM सत्यापित करें। 100 μl पीबीएस में 20 मिनट के लिए पीबीएस में 1/100 विरोधी CD16 / CD32 के साथ ब्लॉक 10 5 कोशिकाओं, आरटी पर विरोधी CD11b-FITC 1/200 प्लस 1/200 विरोधी F4 / 80-एपीसी-Cy7 साथ सेते हैं, धोने और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण। नोट:। संवर्धन माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज यिंग एट अल 11 से पहले इस पत्रिका में विस्तार से प्रकाशित किया गया है। बीज 50,000 कोशिकाओं 100 μl संस्कृति के माध्यम में एक सेल संस्कृति microplate में अच्छी तरह से प्रति (इष्टतम कोशिकाओं की गिनती के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए)। पृष्ठभूमि सुधार कुओं (ए 1, ए 12, एच 1, H12) में कोशिकाओं बीज और इन कुओं में केवल मध्यम (कोई कोशिकाओं) मत डालो सुझाव:। एक कोण एक पर पिपेट पकड़ोआधे रास्ते में सबसे सजातीय सेल परत के लिए कुओं की ओर नीचे डटकर। कोशिकाओं 1 घंटे के लिए एक सेल संस्कृति हुड में आरटी पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। यह सेल वितरण भी बढ़ावा देने और बढ़त प्रभाव कम हो जाएगा। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक माइक्रोस्कोप और संस्कृति का उपयोग कर पालन की निगरानी करें। तीन घंटे चढ़ाना के बाद, 10 एनजी / एमएल एलपीएस, या 20 एनजी / साथ 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित मिलीलीटर आईएल 4 क्रमशः, एम 1 या M2 मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए पुनः संयोजक माउस। एक नियंत्रण के रूप में इलाज भोले (एम 0) मैक्रोफेज शामिल करें। आईएल -6, आईएल 12 की एलपीएस प्रेरित स्राव को मापने के द्वारा उचित एम 1 और M2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का आकलन, टीएनएफ (एलिसा) और आईएल -4 प्रेरित arginase -1 गतिविधि और / या एमएमआर (CD206) और MGL (CD301) सतह अभिव्यक्ति पहले 3,11 के रूप में वर्णित (प्रवाह cytometry)। नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं (पूर्व) हो सकता है अन्य कारकों के साथ प्रेरित किया जा सकता ब्याज या मैक्रोफेज के औषधीय यौगिकों के साथ -treated। चूंकि, अलग कुओं के बीच भिन्नता बाद के चरणों हो सकता हैtantial, यह शर्त के अनुसार कम से कम 4 और आदर्श रूप में 6 कुओं का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। कोशिकी फ्लक्स परख के 2. तैयारी एक दिन परख चलाने से पहले सेंसर कारतूस हाइड्रेट: अगले उपयोगिता थाली करने के लिए उल्टा सेंसर कारतूस रखें। Calibrant समाधान के 200 μl के साथ उपयोगिता थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें और calibrant समाधान में सेंसर जलमग्न उपयोगिता थाली पर सेंसर कारतूस कम है। Calibrant समाधान स्तर पर एक गैर-सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर हे / एन में डूबे हुए सेंसर और जगह रखने के लिए काफी अधिक है सत्यापित करें। इस प्रकार के रूप परख के दिन पर परख के माध्यम से तैयार: 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 50 मिलीलीटर एक्सएफ आधार माध्यम। एक 2 मिमी अंतिम एकाग्रता पाने के लिए 500 μl 200 मिमी एल glutamine जोड़ें। 1 एन NaOH का उपयोग कर 7.4 पीएच को समायोजित करें और 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ और 37 डिग्री सेल्सियस पर परख मध्यम रखें। धीरे ध्रुवीकृत मैक्रोफेज से सेल संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर (जैसे एलिसा उचित बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण की जांच करने के लिए)। 100 μl परख के माध्यम से कोशिकाओं को धो अच्छी तरह से प्रति 180 μl परख मध्यम जोड़ने और कोशिकाओं धुल नहीं किया गया है कि खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें। परख रन करने से पहले 1 घंटे के लिए सीओ 2 के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल कल्चर प्लेट रखें। 37 डिग्री सेल्सियस, 1 टेबल में गर्म के रूप में वर्णित डी तक 10 एक्स इंजेक्शन यौगिक मिश्रण एक तैयार, 7.4 और फिल्टर बाँझ पीएच को समायोजित करें। 10x पर सेल संस्कृति कुओं में अंतिम एकाग्रता इन मिश्रण में सभी यौगिकों बनाने के लिए और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए इन सांद्रता का अनुकूलन। बंदरगाहों ए, बी, सी और डी, respe में तैयार 10x इंजेक्शन यौगिक मिश्रण का संकेत दिया संस्करणों (तालिका 1) के साथ प्रदान की लोडिंग गाइड का उपयोग सेंसर कारतूस लोडctively। मिश्रण / इंजेक्शन यौगिकों खंड 10x मिश्रण (μl) प्राप्त करने के लिए जोड़ा खंड परख मध्यम (एमएल) चलाने के दौरान इंजेक्शन की मात्रा (μl) परख में अंतिम एकाग्रता ए 2.5 एम (45%) ग्लूकोज 300 2.7 20 25 मिमी बी एक oligomycin 5 मिमी (ओएम) 9 3.0 22 1.5 माइक्रोन सी 5 मिमी FCCP 9 2.7 25 1.5 माइक्रोन 100 मिमी सोडियम पाइरूवेट समाधान 300 1 मिमी डी 5 मिमी antimycin ए (एए) </tघ> 15 3.0 28 2.5 माइक्रोन 5 मिमी rotenone (रॉट) 7.5 1.25 सुक्ष्ममापी तालिका 1 इंजेक्शन मिश्रण। एक कोशिकी फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर फूट डालना एम 1 और एम 2 BMDM 3. bioenergetic विशेषता 2 मिनट का मिश्रण है और 3 मिनट उपायः बार और (कम से कम) 3 मिश्रण और दर माप के साथ परख जादूगर के साथ एक परख टेम्पलेट बनाएँ 4 इंजेक्शन से प्रत्येक से पहले (1 टेबल) और अंतिम इंजेक्शन के बाद छोरों। नोट: ये सांद्रता अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और RAW264.7 मैक्रोफेज सेल लाइनों के लिए मान्य हैं, लेकिन प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। FCCP मिश्रण में जोड़ा जा रहा है पाइरूवेट अधिक से अधिक श्वसन ईंधन की जरूरत है। प्रारंभ नीचे धक्का द्वारा रन शुरू और तंत्र के निर्देशों का पालन करें। कार पहले लोडहाइड्रेटेड जांच के साथ tridge प्लेट तंत्र और अगले लोड सेल प्लेट द्वारा अंशांकन अनुमति देने के लिए। परख के बाद, ध्यान से सभी परख मध्यम त्यागने और आपूर्तिकर्ता द्वारा विस्तार से वर्णित के रूप में सेल प्रसार परख किट का उपयोग भविष्य सेल सामान्य बनाने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण सेल संस्कृति microplate दुकान। संक्षेप में, आसुत जल में घटक बी 20 गुना कमजोर द्वारा एक 1x सेल lysis बफर तैयार करने और यौगिक 1x सेल lysis बफर में 400 गुना पतला। , अच्छी तरह से प्रति 200 μl जोड़ें आरटी पर 5 मिनट सेते हैं और ~ 180 एनएम उत्तेजना और ~ 520 एनएम उत्सर्जन Maxima साथ प्रतिदीप्ति उपाय। नोट: गैर पक्षपाती कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं या गरीब पालन एक चिंता का विषय है, इस प्रोटोकॉल सब परख मध्यम discarding की आवश्यकता नहीं है क्योंकि प्रत्यक्ष सेल प्रसार किट एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर भी, यह प्रत्यक्ष प्रोटोकॉल इस प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की तुलना में थोड़ा कम संवेदनशील है। प्रतिदीप्ति माप के बाद, मानक के अनुसारप्रत्येक कोशिका गिनती साथ ही सभी भोले बृहतभक्षककोशिका कुओं की औसत कोशिकाओं की संख्या 1 पर सेट किया जाता है, जिसमें एक अनुपात। (जैसे एक बीसीए परख का उपयोग) प्रोटीन मात्रा का ठहराव कोशिकाओं की गिनती के सामान्य करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: ध्यान दें। फिर भी, हमारे हाथ में इस परख सेल प्रसार परख किट की तुलना में कम संवेदनशील था।

Representative Results

बाह्य प्रवाह परख और सेल मात्रा का ठहराव खत्म करने के बाद, डेटा सेल की गिनती के लिए सामान्यीकृत और विश्लेषण किया जा सकता है। चित्रा 1 ए और चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, क्योंकि यह आम तौर पर ECAR और ओसीआर भूखंडों निकलेगा। ग्लूकोज (ए) के इंजेक्शन के बाद, ECAR में वृद्धि ग्लाइकोलाइसिस दर प्रतिनिधित्व करता है। oligomycin (बी) के साथ एटीपी synthase निषेध के बाद ECAR में अतिरिक्त वृद्धि ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व और क्षमता (चित्रा 1 ए) के बारे में जानकारी प्रदान करता है। ओसीआर मूल्यों का विश्लेषण, इंजेक्शन (बी) oligomycin माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी संश्लेषण के लिए इस्तेमाल ऑक्सीजन की खपत की गणना के लिए अनुमति देता है। FCCP (सी) माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन uncouples और इसी ओसीआर माप अधिक से अधिक और स्पेयर सांस की क्षमता के बारे में डेटा उपज। अंत में, rotenone का इंजेक्शन (रॉट) और antimycin ए (एए) माइटोकॉन्ड्रियल जटिल मैं ब्लॉक और तृतीय और अवशिष्ट ओसीआर गैर माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन विपक्ष का प्रतिनिधित्व करता हैumption (चित्रा 1 बी)। चित्रा 1: एक एक्सएफ कोशिकी प्रवाह परख से निकाली गई मेटाबोलिक पैरामीटर। (ए) सेलुलर ग्लाइकोलाइसिस के निम्नलिखित मानकों (मील प्रति घंटे / मिनट में) ECAR मूल्यों से गणना कर रहे हैं: ग्लाइकोलाइसिस, अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और ग्लाइकोलाइटिक आरक्षित। बेसल श्वसन, एटीपी उत्पादन, प्रोटॉन रिसाव, अधिकतम श्वसन और स्पेयर सांस की क्षमता: (pmoles / मिनट में) (बी) ओसीआर माप माइटोकॉन्ड्रियल समारोह के अगले मौलिक मापदंडों की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Gluc = ग्लूकोज; ओम = oligomycin एक; FCCP = कार्बोनिल साइनाइड 4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; ए.ए. = antimycin एक; सड़ांध = Rotenone यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चलाने के बाद, ECAR और ओसीआर माप 1 तिलइस प्रकार के रूप ECAR माप से अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एल 15 एक्सेल में निर्यात किया जा सकता है और निम्नलिखित ग्लाइकोलाइटिक मापदंडों की गणना की जा सकती है: गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण = औसत। ECAR (1,2,3) Glycolysis = औसत। ECAR (4,5,6) – औसत। ECAR (1,2,3) अधिकतम ग्लाइकोलाइटिक क्षमता = औसत। ECAR (7,8,9) – औसत। ECAR (1,2,3) ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व औसत =। ECAR (7,8,9) – औसत। ECAR (4,5,6) ओसीआर दरों से, अगले चयापचय विशेषताओं निर्धारित किया जा सकता है: गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन = औसत। ओसीआर (13,14,15) बेसल श्वसन = औसत। ओसीआर (4,5,6) – औसत। ओसीआर (13,14,15) एटीपी उत्पादन = औसत। ओसीआर (4,5,6) – औसत। ओसीआर (7,8,9) प्रोटॉन रिसाव =औसत। ओसीआर (7,8,9) – औसत। ओसीआर (13,14,15) अधिकतम श्वसन = औसत। ओसीआर (10,11,12) – औसत। ओसीआर (13,14,15) स्पेयर सांस की क्षमता (एसआरसी) = औसत। ओसीआर (10,11,12) – औसत। ओसीआर (4,5,6) चित्रा 2:। भोले के चयापचय विशेषताओं (एम 0), LPS- (एम 1) और आईएल 4- (M2) ध्रुवीकृत मैक्रोफेज 8 व्यक्तिगत कुओं का मतलब (SEM) के प्रत्येक माप, मतलब है और मानक त्रुटि के लिए प्रस्तुत किया है। (ए) कोशिकी अम्लीकरण दर (मील प्रति घंटे / मिनट में ECAR,) और (बी) ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर, pmoles / मिनट में) विभिन्न ध्रुवीकरण (एम 1 और एम 2) और भोले मैक्रोफेज (एम 0) के लिए मापा जाता है। (CyQUANT साथ मापा के रूप में) और भोले मैक्रोफेज की औसत सेल गिनती में 1 पर स्थापित किया गया था सभी मापन सेल गिनती के लिए सामान्यीकृत थेjection एक = ग्लूकोज; बी = oligomycin; सी = FCCP; डी antimycin ए + Rotenone =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2A में दिखाया गया है, एलपीएस के साथ बृहतभक्षककोशिका सक्रियण ग्लाइकोलाइटिक चयापचय वृद्धि हुई लाती है। चित्रा 2 बी में ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) को देख जब LPS और आईएल -4 का इलाज मैक्रोफेज के बीच मतभेदों को और भी अधिक स्पष्ट कर रहे हैं। अधिक से अधिक ऑक्सीडेटिव चयापचय अत्यधिक एम (एलपीएस) में दबा दिया जाता है, जबकि वास्तव में, आईएल 4 M2 मैक्रोफेज में बेसल और विशेष रूप से अधिक से अधिक श्वसन लाती है। एक वृद्धि हुई ग्लाइकोलाइटिक एम (एलपीएस) मैक्रोफेज के लिए नहीं बल्कि अद्वितीय है और एम (IFNγ) मैक्रोफेज ग्लाइकोलाइसिस बढ़ाने प्रदर्शित नहीं करते हैं क्योंकि जरूरी एम 1 मैक्रोफेज की एक विशेषता नहीं है कि ध्यान देना चाहिए। कुल मिलाकर, यह बाह्य प्रवाह विश्लेषण था दर्शाताएलपीएस सक्रिय मैक्रोफेज प्रदर्शन ग्लाइकोलाइटिक चयापचय को बढ़ाया है और किसी भी अतिरिक्त सांस की क्षमता के पास नहीं है, जबकि टी, एम 2 मैक्रोफेज बढ़ाया ऑक्सीडेटिव चयापचय की विशेषता है और विशेष रूप से एक उच्च खाली श्वसन क्षमता (एसआरसी) कर रहे हैं आईएल -4 प्रेरित।

Discussion

हमारी प्रयोगशाला का उद्देश्य बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण और समारोह atherosclerosis और अन्य भड़काऊ शर्तों ¹² के परिणाम में सुधार करने के लिए अंतिम लक्ष्य के साथ प्रभावित किया जा सकता है कि कैसे को समझने की है। बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण का आकलन करने के लिए, एक आम तौर पर, एलपीएस (+ IFNγ) प्रेरित और एम 1 और एम 2 मार्कर जीन (qPCR) के जीन की अभिव्यक्ति आईएल -4 प्रेरित उपायों एलिसा द्वारा आईएल -6, आईएल 12, टीएनएफ और सं स्राव (निर्धारित करता है और Griess प्रतिक्रिया) और आईएल -4 प्रेरित CD71, CD206, CD273 और CD301 सतह फ्लो द्वारा अभिव्यक्ति () और arginase गतिविधि ^3,13 परख होती है। इसके अतिरिक्त, (DiI-oxLDL तेज, LipidTOX तटस्थ लिपिड धुंधला द्वारा) और फोम सेल गठन assays (फ्लोरोसेंट लेटेक्स माला और / या pHrodo ई कोलाई के साथ) phagocytosis assays (Annexin वी / पीआई धुंधला द्वारा) एपोप्टोसिस assays के लिए किया जा सकता है बृहतभक्षककोशिका कार्यक्षमता ¹⁴ का मूल्यांकन। इसके अतिरिक्त, बाह्य प्रवाह विश्लेषण बायोइनरजेटिक्स ध्रुवीकरण मैक के प्रोफाइल को मापने के लिए किया जा सकता हैएक नए और वैकल्पिक कार्यात्मक readout के रूप में rophages।

यह पांडुलिपि बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण उनकी ऊर्जा स्रोत के रूप में वृद्धि ग्लाइकोलाइसिस का उपयोग करने जा एलपीएस प्रेरित मैक्रोफेज साथ चयापचय reprogramming लाती है कि पता चलता है। इसके विपरीत, आईएल -4 प्रेरित M2 मैक्रोफेज एटीपी के मुख्य स्रोत के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फास्फोरिलीकरण का उपयोग करें। महत्वपूर्ण बात है, चयापचय reprogramming न केवल एम 1 और एम 2 ध्रुवीकृत मैक्रोफेज की विशेष आवश्यकताओं के लिए ऊर्जा प्रदान करता है। दरअसल, चयापचय परिवर्तनों बृहतभक्षककोशिका phenotype के ^10,15,16 के प्रत्यक्ष नियामकों हैं कि मेटाबोलाइट सांद्रता प्रभावित करते हैं। लेकिन यह भी अलग बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण राज्यों के एक ड्राइवर (चित्रा 2 में यहाँ दिखाया गया है) और इस नए ज्ञान वर्ष के पिछले कुछ के दौरान immunometabolism अनुसंधान के क्षेत्र का तेजी से विकास समर्थित इसलिए, बृहतभक्षककोशिका चयापचय न केवल एक विशेषता है।

हालांकि, मैक्रो में चयापचय की प्रोफाइल के मजबूत मापphages मुश्किल बनी हुई है और उनकी सीमाओं था। इस अध्ययन में, एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक मजबूती के साथ वास्तविक समय में ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक आरक्षित है, अधिक से अधिक ग्लाइकोलाइटिक क्षमता, गैर ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, बेसल और अधिक से अधिक श्वसन, एटीपी उत्पादन, स्पेयर सांस की क्षमता, प्रोटॉन रिसाव और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन मापने के लिए लागू किया जाता है मैक्रोफेज की एक न्यूनतम राशि में।

इसलिए, हम संशोधित और इस प्रकार के रूप में निर्माता के प्रोटोकॉल में सुधार हुआ। मानक मिटो तनाव टेस्ट (# 103,015-100) ग्लूकोज और पाइरूवेट और 3 इंजेक्शन (ओम, FCCP, ए.ए. / सड़ो) के साथ एक प्रोटोकॉल के साथ माध्यम का उपयोग कर पता चलता है। हम ग्लूकोज / पाइरूवेट मुक्त माध्यम से परख शुरू (Glycolysis तनाव टेस्ट # 103,020-100 में की तरह) पोर्ट ए में पहली बार एक इंजेक्शन के रूप में ग्लूकोज को जोड़ने और इस तरह से बंदरगाह सी में FCCP uncoupler के साथ मिलकर पाइरूवेट जोड़ने के लिए चुनते सभी प्रासंगिक ग्लाइकोलाइसिस मापदंडों के ECAR माप 1-9 और mitochondri के बारे में सभी प्रासंगिक जानकारी से निकाली गई हैओसीआर माप 4-15 से अल समारोह।

यह uncoupling पर अधिक से अधिक श्वसन ईंधन के लिए FCCP के साथ मिलकर पाइरूवेट इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें। इस संयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, एक भी 2-Deoxy-डी ग्लूकोज (2-डीजी) बेसल मूल्यों (1-3) को परख के बाद ECAR स्तर को कम करती है कि सत्यापित करना चाहिए और दर्ज ECAR दरों 4-6 वास्तव में कारण कर रहे हैं ग्लाइकोलाइसिस करने के लिए। इसके अतिरिक्त, एक इस पांडुलिपि में इस्तेमाल यौगिक सांद्रता और सेल नंबर अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और RAW264.7 मैक्रोफेज सेल लाइनों के लिए मान्य हैं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए कि समझना चाहिए। इसके अलावा, एक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो एम-सीएसएफ एक M2-जैसे विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप को बढ़ावा देता है कि ध्यान देना चाहिए। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज से परिणाम प्रस्तुत इसलिए सेल culturi दौरान एम-सीएसएफ की आवश्यकता नहीं है कि प्राथमिक ऊतक निवासी मैक्रोफेज या मैक्रोफेज सेल लाइनों के साथ माप करने के लिए पूरी तरह से तुलना नहीं हो सकतीएनजी।

मौजूदा तरीकों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल मैक्रोफेज की न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता है और जल्दी से लगभग सभी मौलिक चयापचय सेल विशेषताओं प्रदान करता है। यह अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी assays और बायोइनरजेटिक्स की रूपरेखा के लिए प्रयोग किया जाता है, यहां तक ​​कि कोशिकाओं को अभी भी परख के बाद ठाना अन्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए पर्याप्त अधिशेष कोशिकाओं में यह परिणाम है। इसके अलावा, विशेष रूप से 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप एक ही समय में वास्तविक समय में कई की स्थिति का आकलन करने की अनुमति देता है। फिर भी, व्यक्तिगत कुओं के बीच भिन्नता काफी है और इसलिए शर्त के अनुसार कम से कम 4 कुओं का उपयोग अक्सर वांछित है हो सकता है। खाते में इस सीमा में ले ली, वर्णित बाह्य प्रवाह विश्लेषण अभी भी 10 से अधिक प्रयोगात्मक शर्तों को चलाने के लिए अनुमति देता है (एन = 6) परंपरागत तकनीकों की तुलना में काफी अधिक है, जो एक बार में।

कुल मिलाकर, इस लेख के सभी प्रासंगिक ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल परम मापने की अनुमति देता है कि एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार्यात्मक परख प्रदान करता हैध्रुवीकरण बृहतभक्षककोशिका सबसेट में eters। इस तकनीक बृहतभक्षककोशिका समारोह का आकलन करने के लिए और मैक्रोफेज की (चयापचय) phenotype पर अलग जोड़तोड़ के प्रभाव (जैसे जीन नीचे दस्तक, नई दवाइयों, आदि) का मूल्यांकन करने के लिए एक भविष्य के आवेदन के रूप में काम कर सकते हैं। जैसे, बाह्य प्रवाह डेटा बृहतभक्षककोशिका सक्रियण स्थिति का गहराई से लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए अन्य assays के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Materials

23G and 25G needles	Becton Dickinson	#300800 and #300600	To flushed bone marrow
10 ml syringes	Becton Dickinson	#307736	To flushed bone marrow
Petri dishes	Greiner	#639161	To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit	Molecular Probes	#C7026	For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit	Molecular Probes	#35011	For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate	Seahorse Bioscience	#101085-004	96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)	Peprotech	#214-14-B	Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	#L2637	Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge	Seahorse Bioscience	#102416-100	Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant	Seahorse Bioscience	#100840-000	Needed to hydrate the probes overnight
XF base medium	Seahorse Bioscience	#102353-100	Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine	Life Technologies	#25030-081
D-(+)-Glucose	Sigma	#G8769	Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A	Sigma	#75351	Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)	Sigma	#C2920	Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution	Lonza	#BE13-115E	Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A	Sigma	#BE13-115EA8674	Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone	Sigma	#BE13-115EA8674R8875	Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter	Roche Diagnostics	#05 651 697 001	Instrument to count cells
anti-CD16/CD32	eBioscience	#14-0161	Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780	eBioscience	#47-4801	Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC	eBioscience	#11-0112	Antibody to stain macrophages