Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.
Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.
Även makrofager spelar en central roll i praktiskt taget alla sjukdomar, de molekylära mekanismer som reglerar deras fenotyp är fortfarande inte helt avslöjad. Makrofager uppvisar hög heterogenitet och som svar på mikro anta olika fenotyper 1. LPS (+ IFNy) -inducerad klassiskt aktiverad M1 eller M (LPS) makrofager främja inflammation och skydda värden mot olika typer av mikrobiella hot 2. Andra använder IFNy ensamt eller i kombination med TNF som stimuli för att framkalla M1 polarisering. IL-4 och / eller IL-13 inducerar alternativa makrofagaktivering och dessa M2 eller M (IL-4) celler är potenta suppressorer och styrenheter av pågående immunsvar 3. Polariserade makrofager uppvisar en tydlig reglering av cellulär metabolism med LPS-aktiverade M1 makrofager som genomgår en metabolisk övergång till förbättrad glykolys 4-6. Omvänt förbättrad fettsyraoxidation (FAO) och mitokondriell oxidative fosforylering (OXPHOS) ger ihållande energi i IL-4-inducerad M2 makrofager 7-9. Således är förändrad metabolism inte bara en egenskap hos polarise macrophage delmängder, det är också en förutsättning för korrekt polarisering och inflammatorisk reglering. Viktigt, hämning av glykolys eller OXPHOS / FAO har visat sig försämra M1 eller M2 aktivering, respektive 8,10. Som sådan kunde identifiera metabola förändringar i makrofager användas som ett verktyg för att bedöma deras polariseringsstatus och inflammatorisk potential.
En konsekvent analys som mäter makrofag metabolism kan därför användas för att förutsäga om ett läkemedel, gen slå ner eller annan behandling påverkar makrofager polarisering och funktion. I den här videon, är ett extracellulärt flöde analysator som används för att karakterisera bioenergetik profiler av naiva, M1 och M2 makrofager.
Detta manuskript detaljer ett optimerat protokoll som möjliggör mätningav alla relevanta glykolys parametrar (glykolys, maximal glykolys och glykolytiska reserv) och mitokondriella funktions egenskaper (total andning, basal mitokondrie andning, ATP produktion, proton läcka, maximal andning och reservandningskapacitet) i en enda analys. Med hjälp av denna experimentuppställning, kan bioenergetik jämföras mellan kontroll och "förändrad" (t.ex. genen slå ner, transgena uttryck eller farmakologisk behandling) celler.
Syftet med vårt laboratorium är att förstå hur makrofager polarisering och funktion kan påverkas med slutmålet att förbättra resultatet av åderförkalkning och andra inflammatoriska tillstånd 12. För att bedöma makrofag polarisering, en mäter typiskt LPS (+ IFNy) -inducerade och IL-4-inducerade genuttrycket av M1 och M2 markörgener (qPCR) bestämmer IL-6, IL-12, TNF och NO-utsöndring (genom ELISA och Griess reaktion) och undersöker IL-4-inducerad CD71, CD206, CD273 och CD301 ytexpression (genom flödescytometri) och arginas aktivitet 3,13. Dessutom kan apoptosanalyser (av Annexin-V / PI färgning), fagocytos analyser (med fluorescerande latexpärlor och / eller pHrodo E. coli) och skumcellbildning analyser (av Dil-oxLDL upptag, LipidTOX neutral lipid färgning) utföras för att utvärdera makrofag funktionalitet 14. Dessutom kan genomföras extracellulärt flödesanalys för att mäta bioenergetik profiler av polariserad macrophages som en ny och alternativ funktionell avläsning.
Detta manuskript visar att makrofag polarisering inducerar metabolisk omprogrammering med LPS-inducerade makrofager byta till ökad glykolys som sin energikälla. Omvänt, IL-4-inducerad M2 makrofager använder mitokondriell oxidativ fosforylering som den viktigaste källan till ATP. Viktigt ger metaboliska omprogrammering inte bara energi för de särskilda kraven för M1 och M2 polariserade makrofager. I själva verket, metabola förändringar påverkar metabolitkoncentrationer som är direkta regulatorer av makrofag fenotypen 10,15,16. Därför är makrofager metabolism inte bara en egenskap (som visas i figur 2) men också en drivkraft för olika makrofag polariseringstillstånd och denna nya kunskap stödde den snabba tillväxten av immunometabolism forskningsområdet under de senaste åren.
Men robusta mätningar av metaboliska profiler i makrofager fortsatt svårt och hade sina begränsningar. I denna studie är ett extracellulärt flöde analysator tillämpas på kraftigt mäta glykolysen, glykolytiska reserv, maximal glykolytiska kapacitet, icke-glykolytiska försurning, basal och maximal andning, ATP-produktion, reservlungkapacitet, proton läcka och icke-mitokondriell andning i realtid i en minimal mängd av makrofager.
Därför vi modifieras och förbättras tillverkarens protokoll såsom följer. Standarden Mito Stress Test (# 103015-100) föreslår att man använder medium med glukos och pyruvat och ett protokoll med 3 injektioner (OM, FCCP, AA / Rot). Vi väljer att starta analysen med glukos / pyruvat fritt medium, tillsätt glukos som en första injektion i port A (som i glykolysen stresstest # 103.020-100) och tillsätt pyruvat tillsammans med FCCP frikopplare i hamn C. På detta sätt alla relevanta glykolys parametrar härleds från ECAR mätningarna 1-9 och all relevant information om mitochondrial-funktion från OCR mätningar 4-15.
Observera att det är viktigt att injicera pyruvat tillsammans med FCCP till bränsle maximal andning vid frånkoppling. Innan du använder denna kombinerade protokoll, bör man också kontrollera att 2-deoxi-D-glukos (2-DG) sänker ECAR nivåer efter analysen till de basala värdena (1-3) och att de inspelade ECAR priser 4-6 är verkligen beror till glykolys. Dessutom bör en förstå att de föreningskoncentrationer och cellantal som används i detta manuskript gäller för benmärgshärledda makrofager och Raw264.7 makrofagcellinjer och bör optimeras för andra celltyper. Dessutom bör man notera att M-CSF som används för att generera benmärgshärledda makrofager befrämjar en M2-liknande antiinflammatorisk fenotyp. De presenterade resultaten från benmärgshärledda makrofager kan därför vara inte helt jämförbar med mätningar med primär vävnads residenta makrofager eller makrofager cellinjer som inte kräver M-CSF under cell culturing.
Jämfört med befintliga metoder, kräver detta protokoll minimala mängder av makrofager och snabbt ger nästan alla grundläggande metabola cellegenskaper. Detta resulterar i tillräckligt överskott celler för att utföra andra immunologiska analyser och även de celler som används för bioenergetik profilering kan fortfarande användas för andra purposed efter analysen. Dessutom tillåter den särskilda 96 brunnar format bedömer flera villkor i realtid samtidigt. Ändå kan variationen mellan individuella brunnar vara betydande och därför är användningen av minst 4 brunnar per betingelse är ofta önskvärt. Tagit denna begränsning hänsyn tillåter den beskrivna extracellulära flödesanalys fortfarande att köra mer än 10 experimentella betingelser (n = 6) på en gång, vilket är mycket mer än traditionell teknik.
Sammantaget denna artikel ger ett enkelt och reproducerbar funktionell analys som gör det möjligt att mäta alla relevanta glykolys och mitokondriell parammetrar i polarise makrofag delmängder. Denna teknik kan fungera som en framtida program för att bedöma makrofagfunktion och utvärdera effekten av olika manipulationer (t.ex. gen knock ner, nya läkemedel, etc.) på makrofagen s (metabolisk) fenotyp. Som sådan, kan extracellulära flödesdata användas tillsammans med andra analyser för att möjliggöra en fördjupad karakterisering av makrofagaktivering status.
The authors have nothing to disclose.
Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.
23G and 25G needles | Becton Dickinson | #300800 and #300600 | To flushed bone marrow |
10 ml syringes | Becton Dickinson | #307736 | To flushed bone marrow |
Petri dishes | Greiner | #639161 | To culture bone marrow cells |
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #C7026 | For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells) |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #35011 | For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells) |
XFe96 cell culture microplate | Seahorse Bioscience | #101085-004 | 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done |
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) | Peprotech | #214-14-B | Used to induced alternative macrophage activation |
lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | #L2637 | Pro-inflammatory stimulus |
Seahorse Sensor Cartridge | Seahorse Bioscience | #102416-100 | Contains the probes for pH and O2 measurement |
Seahorse XF Calibrant | Seahorse Bioscience | #100840-000 | Needed to hydrate the probes overnight |
XF base medium | Seahorse Bioscience | #102353-100 | Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes |
L-glutamine | Life Technologies | #25030-081 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | #G8769 | Fuels glycolysis once added to the cells |
oligomycin A | Sigma | #75351 | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | Sigma | #C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
100 mM Sodium Pyruvate solution | Lonza | #BE13-115E | Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis |
Antimycin A | Sigma | #BE13-115EA8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
Rotenone | Sigma | #BE13-115EA8674R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
Casy Cell Counter | Roche Diagnostics | #05 651 697 001 | Instrument to count cells |
anti-CD16/CD32 | eBioscience | #14-0161 | Fc receptor block flow cytometry |
anti-F4/80-APC-eFluor780 | eBioscience | #47-4801 | Antibody to stain macrophages |
anti-CD11b-FITC | eBioscience | #11-0112 | Antibody to stain macrophages |