Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.
Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization.
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC).
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage’s metabolic phenotype and inflammatory status.
Mens makrofager spiller en central rolle i næsten alle sygdomme, de molekylære mekanismer, der regulerer deres fænotype er stadig ikke fuldt optrævlede. Makrofager vise high heterogenitet og som svar på mikromiljø vedtage forskellige fænotyper 1. LPS (+ IFNy) -induceret klassisk aktiveret M1 eller M (LPS) makrofager fremme inflammation og beskytte værten mod forskellige typer af mikrobielle 2 trusler. Andre alene eller i kombination bruge IFNy med TNF som stimuli til fremkaldelse M1 polarisering. IL-4 og / eller IL-13 inducerer alternative makrofagaktivering og disse M2 eller M (IL-4) celler er potente suppressorer og controllere af igangværende immune 3 svar. Polariserede makrofager vise en særskilt regulering af cellulær metabolisme med LPS-aktiverede M1 makrofager gennemgår en metabolisk skifte til forbedret glykolysen 4-6. Omvendt forbedret fedtsyreoxidation (FAO) og mitokondriel oxidative fosforylering (OXPHOS) giver vedvarende energi i IL-4-induceret M2 makrofager 7-9. Således ændret metabolisme er ikke kun en egenskab ved polariserede makrofag delmængder, er det også en forudsætning for korrekt polarisering og inflammatorisk regulering. Vigtigt er det, at hæmning af glykolyse eller OXPHOS / FAO har vist sig at svække M1 eller M2 aktivering henholdsvis 8,10. Som sådan kunne identificerer metaboliske ændringer i makrofager anvendes som et redskab til at vurdere deres polarisering status og inflammatoriske potentiale.
En konsekvent assay, der måler makrofag metabolisme kunne derfor anvendes til at forudsige, om et lægemiddel, gen vælte eller anden behandling påvirker makrofag polarisering og funktion. I denne video, er et ekstracellulært flux analysator bruges til at karakterisere bioenergetik profiler af naive, M1 og M2 makrofager.
Dette håndskrift detaljer en optimeret protokol, der tillader målingenaf alle relevante glycolyse parametre (glycolyse, maksimal glycolyse og glykolytisk reserve) og mitokondriefunktion karakteristika (total åndedræt, basal mitokondrie åndedræt ATP produktions-, proton lækage, maksimal åndedræt og reservedele respiratorisk kapacitet) i én enkelt analyse. Ved hjælp af denne forsøgsopstilling, kan bioenergetik sammenlignes mellem kontrol og "ændret" (f.eks gen vælte, transgene overekspression eller farmakologisk behandling) celler.
Målet med vores laboratorium er at forstå, hvordan makrofag polarisering og funktion kan påvirkes med det ultimative mål at forbedre resultatet af åreforkalkning og andre betændelsestilstande 12. For at vurdere makrofag polarisering, man typisk måler LPS (+ IFNy) -induceret og IL-4-induceret genekspression af M1 og M2 markørgener (qPCR), bestemmer IL-6, IL-12, TNF og NO sekretion (ved ELISA og Griess reaktion) og undersøger IL-4-induceret CD71, CD206, CD273 og CD301 overfladeekspression (ved flowcytometri) og arginase aktivitet 3,13. Derudover kan apoptose analyser (ved Annexin-V / PI farvning), fagocytose assays (med fluorescerende latexperler og / eller pHrodo E. coli) og skum celle dannelse assays (ved Dii-oxLDL optagelse LipidTOX neutralt lipid farvning) udføres for at evaluere makrofag funktionalitet 14. Derudover kan udføres ekstracellulære flux analyse til måling bioenergetik profiler af polariseret macrophages som en ny og alternativ funktionel udlæsning.
Dette håndskrift viser, at makrofag polarisering inducerer metaboliske omprogrammering med LPS-induceret makrofager skifter til øget glykolysen som deres energikilde. Omvendt IL-4-induceret M2 makrofager bruger mitokondriel oxidativ fosforylering som den vigtigste kilde til ATP. Vigtigere, metaboliske omprogrammering ikke kun giver energi til de særlige krav til M1 og M2 polariserede makrofager. Faktisk metaboliske ændringer påvirker metabolitkoncentrationer, der er direkte regulatorer af makrofag fænotype 10,15,16. Derfor makrofag stofskifte er ikke kun et karakteristisk (som vist her i figur 2), men også en drivkraft for distinkte makrofag polarisering stater, og den nye viden støttede den hurtige vækst i det immunometabolism forskningsområdet løbet af de sidste par år.
Men robuste målinger af metaboliske profiler i makrofager forblev vanskelig og havde deres begrænsninger. I denne undersøgelse er et ekstracellulært flux analysator anvendes til robust måling glycolyse, glycolytisk reserve, maksimal glycolytisk kapacitet, ikke-glycolytiske forsuring, basal og maksimal respiration, ATP-produktion, ekstra respiratorisk kapacitet, proton lækage og ikke-mitokondrielle respiration i realtid i en minimal mængde af makrofager.
Derfor har vi ændret og forbedret producentens protokoller som følger. Standarden Mito Stress Test (# 103015-100) foreslår at bruge medium med glucose og pyruvat og en protokol med 3 injektioner (OM, FCCP, AA / Rot). Vi vælger at starte analysen med glucose / pyruvat-frit medium, tilføje glucose som første injektion i port A (som i Glycolysis Stress Test # 103.020 til 100), og der tilsættes pyruvat sammen med FCCP afkobler i havn C. På denne måde , alle relevante glycolyse parametre er afledt af de ECAR målinger 1-9 og alle relevante oplysninger om mitochondrial funktion fra OCR-målinger 4-15.
Bemærk, at det er afgørende at injicere pyruvat sammen med FCCP til brændstof maksimal respiration efter frakobling. Før du bruger denne kombinerede protokol, bør man også kontrollere, at 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) sænker ECAR niveauer efter analysen til de basale værdier (1-3), og at de registrerede ECAR satser 4-6 er faktisk skyldes glykolyse. Derudover bør man forstå, at forbindelsen koncentrationer og celleantal, der anvendes i dette manuskript er gyldige for knoglemarvafledte makrofager og RAW264.7 makrofag cellelinier og skal optimeres for andre celletyper. Desuden bør man bemærke, at M-CSF, der anvendes til at generere knoglemarvafledte makrofager fremmer en M2-lignende antiinflammatorisk fænotype. De præsenterede resultater fra knoglemarvafledte makrofager kan derfor være ikke fuldt sammenlignelige med målinger med primært væv residente makrofager eller makrofager cellelinier, der ikke kræver M-CSF under celle culturing.
Sammenlignet med de eksisterende metoder, denne protokol kræver minimale mængder af makrofager og hurtigt giver stort set alle fundamentale metaboliske cellekarakteristika. Dette resulterer i nok overskydende celler til at udføre andre immunologiske assays og endda celler til bioenergetik profilering kan stadig anvendes til andre Hensigt efter analysen. Desuden især 96-brønds plade format giver vurdere flere betingelser i realtid samtidig. Alligevel kan variationen mellem individuelle brønde være betydelige, og derfor ønskes ofte at anvende mindst 4 brønde pr tilstand. Taget denne begrænsning i betragtning, der er beskrevet ekstracellulære flux analyse tillader stadig at køre mere end 10 eksperimentelle betingelser (n = 6) på en gang, hvilket er langt mere end de traditionelle teknikker.
Samlet set denne artikel giver et let og reproducerbar funktionel analyse, der gør det muligt at måle alle relevante glykolyse og mitokondrie parammetre i polariserede makrofag delmængder. Denne teknik kan tjene som en fremtidig anvendelse til at vurdere makrofagfunktion og til at evaluere virkningen af forskellige manipulationer (f.eks gen vælte, nye lægemidler, etc.) på makrofag s (metabolisk) fænotype. Som sådan kan ekstracellulære flux data anvendes i forbindelse med andre assays for at tillade grundig karakterisering af status makrofagaktivering.
The authors have nothing to disclose.
Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.
23G and 25G needles | Becton Dickinson | #300800 and #300600 | To flushed bone marrow |
10 ml syringes | Becton Dickinson | #307736 | To flushed bone marrow |
Petri dishes | Greiner | #639161 | To culture bone marrow cells |
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #C7026 | For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells) |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit | Molecular Probes | #35011 | For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells) |
XFe96 cell culture microplate | Seahorse Bioscience | #101085-004 | 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done |
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) | Peprotech | #214-14-B | Used to induced alternative macrophage activation |
lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | #L2637 | Pro-inflammatory stimulus |
Seahorse Sensor Cartridge | Seahorse Bioscience | #102416-100 | Contains the probes for pH and O2 measurement |
Seahorse XF Calibrant | Seahorse Bioscience | #100840-000 | Needed to hydrate the probes overnight |
XF base medium | Seahorse Bioscience | #102353-100 | Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes |
L-glutamine | Life Technologies | #25030-081 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | #G8769 | Fuels glycolysis once added to the cells |
oligomycin A | Sigma | #75351 | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | Sigma | #C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
100 mM Sodium Pyruvate solution | Lonza | #BE13-115E | Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis |
Antimycin A | Sigma | #BE13-115EA8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
Rotenone | Sigma | #BE13-115EA8674R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
Casy Cell Counter | Roche Diagnostics | #05 651 697 001 | Instrument to count cells |
anti-CD16/CD32 | eBioscience | #14-0161 | Fc receptor block flow cytometry |
anti-F4/80-APC-eFluor780 | eBioscience | #47-4801 | Antibody to stain macrophages |
anti-CD11b-FITC | eBioscience | #11-0112 | Antibody to stain macrophages |