Abstract
सबसे स्तनधारी रोगजनकों के लिए, अध्ययन की रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति सही ढंग से संक्रमित ऊतकों से रोगज़नक़ जीन टेप यों की तकनीकी कठिनाइयों के द्वारा ही सीमित कर दिया गया है। पैथोजन आरएनए संक्रमित ऊतकों के नमूनों से अलग कुल शाही सेना के एक छोटे से हिस्से का गठन किया। माइक्रोएरे और RNAseq प्रौद्योगिकियों दोनों विश्वसनीय कमजोर व्यक्त रोगज़नक़ जीनों के लिए पढ़ता पैदा करने में कठिनाई है। विवो प्रसार में कम से उत्परिवर्ती रोगज़नक़ उपभेदों एक भी बड़ा चुनौती। यहाँ हम बहुत तेजी से बेहद संवेदनशील है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि एक इन विवो जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम hematogenously फैलाया कैंडिडिआसिस के एक murine मॉडल में कवक रोगज़नक़ कैंडिडा सफेद के बारे में हमारी जांच के दौरान इस प्रोटोकॉल का विकास किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम गतिशील विनियमित सी के समय पाठ्यक्रम दस्तावेज है सफेद जीन गुर्दे के संक्रमण के दौरान अभिव्यक्ति, और की खोज की अप्रत्याशित सुविधाओंजीन अभिव्यक्ति की प्रतिक्रियाएं विवो में नशीली दवाओं के उपचार रोधी करने के लिए।
Introduction
जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के लिए एक सेल पर्यावरण परिवर्तन के लिए कैसे प्रतिक्रिया के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी रखती है। एक को संक्रमित सूक्ष्म जीव के मामले में, जीन अभिव्यक्ति डेटा एक रोगज़नक़ संक्रमण पर्यावरण के लिए adapts और होस्ट करने के लिए नुकसान का कारण बनता कैसे पर चिकित्सकीय प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सके। पिछले दो दशकों में, इन विट्रो और इन विवो में दोनों जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पन्न किया है और संक्रमण जीव विज्ञान 1-3 समझने के लिए एक नींव रखी। हालांकि, माइक्रोएरे और RNAseq सहित वर्तमान प्रोफाइलिंग प्रौद्योगिकी, संक्रमण के दौरान रोगज़नक़ जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए इष्टतम नहीं हैं। आरएनए संक्रमित ऊतकों के नमूनों से अलग कुल शाही सेना का एक भारी हिस्सा (आमतौर पर> 99%) का गठन किया होस्ट करें। मेजबान आरएनए प्रोटीन पर उच्च पृष्ठभूमि में योगदान देता है, और अनुक्रम RNAseq से पढ़ता हावी है। संक्रमित ऊतक से पैथोजन सेल अलगाव, सिद्धांत में, रोगज़नक़ आरएनए के लिए बेहतर बनाने के लिए मदद कर सकते हैं, लेकिन यह इसके posesअल समस्याओं: यह संक्रमित ऊतक की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है; प्रक्रिया थकाऊ हो सकता है; और सबसे महत्वपूर्ण बात, यह लंबी प्रक्रिया के दौरान देशी राज्य या शाही सेना की अखंडता के संरक्षण के लिए मुश्किल है। वास्तविक संक्रमण के दौरान रोगज़नक़ जीन अभिव्यक्ति पर अधिक व्यापक और सटीक डेटा उत्पन्न करने के लिए, हम एक मिश्रित आरएनए आबादी में अल्पसंख्यक आरएनए प्रजातियों के विश्वसनीय और लागत प्रभावी मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए निकल पड़े।
NanoString nCounter 4, 5। यह मंच क्यूआरटी पीसीआर के बराबर एक संवेदनशीलता स्तर है लेकिन एंजाइमी प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं है डिजिटल बार कोडेड जांच जोड़े का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष मल्टिप्लेक्स माप में आता है कि एक हाल ही में विकसित मंच है। प्रौद्योगिकी जीनोम चौड़ा नहीं है, यह प्रत्येक परख में अप करने के लिए 800 विभिन्न जीनों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इसलिए, यह रूपरेखा के लिए जांच के रूप में जानकारीपूर्ण जीन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम एक प्रमुख गुंजन के अध्ययन की रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति का उपयोगएक उदाहरण के रूप में एक आक्रामक संक्रमण के दौरान एक रोगज़नक़, कैंडिडा सफेद, प्रदर्शित करने के लिए: 1) प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं (प्रोटोकॉल) की तकनीकी जानकारी, 2) इस विधि की संवेदनशीलता, reproducibility और गतिशील रेंज (प्रतिनिधि परिणाम), और 3) महत्वपूर्ण इस प्रोटोकॉल (चर्चा) पर आधारित प्रयोगों के डिजाइन और प्रदर्शन के लिए विचार। इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और सफलतापूर्वक संक्रमण मॉडल 6-9 की संख्या में लागू किया गया है।
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं लॉस एंजिल्स जैव चिकित्सा अनुसंधान संस्थान में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा (प्रोटोकॉल 011,000) को मंजूरी दे दी और पशु के एथिकल ट्रीटमेंट के लिए हेल्थ (एनआईएच) के दिशा-निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार किए गए। चूहों हार्बर-यूसीएलए अनुसंधान एवं शिक्षा संस्थान के परिसर में स्थित एक AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में बंदी थे। प्रयोगशाला पशु चिकित्सा के क्षेत्र में माहिर एक पूर्णकालिक पशुचिकित्सा उनकी देखभाल का निरीक्षण किया। Caging और पशुपालन अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा प्रकाशन "प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड" में दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदान किया गया। हर प्रयास नम्रता से चूहों का इलाज करने के लिए बनाया गया था। चूहों के अस्तित्व और स्वास्थ्य तीन बार दैनिक नजर रखी थी। जाहिर है बीमार, सुस्त चूहों के समूह से अलग और पीड़ा को कम करने के euthanized थे। Euthanas पर पैनल की सिफारिश के अनुसार चूहों, pentobarbital जरूरत से ज्यादा (210 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा euthanized थेपशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन के आइए।
ऊतकों, अभिकर्मकों और उपकरणों की 1. तैयारी
- सभी की पढ़ाई के लिए 20-22 ग्राम भार पुरुष / Balb ग चूहों का प्रयोग करें। नसों के 1 एक्स 10 6 खमीर चरण सी के साथ प्रयोगात्मक समूह प्रति तीन चूहों टीका लगाना सफेद कोशिकाओं। विशिष्ट समय बिंदुओं के बाद संक्रमण पर जानवरों और फसल गुर्दे बलिदान। एक पेंच टोपी ट्यूब में प्रत्येक गुर्दे की जगह, बाद में शाही सेना निष्कर्षण 6 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, और दुकान तस्वीर।
नोट: जू एट अल में विस्तार से वर्णित के रूप में पशु प्रयोगों से बाहर किए गए 6।। - -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से गुर्दे निकालने से पहले निम्न अभिकर्मकों और उपकरणों को तैयार:
- कुल शाही सेना निकासी किट खोलें। 2-mercaptoethanol जोड़ें (1% वी / वी) RLT बफर और (प्रत्येक नमूने के लिए 2 मिलीलीटर तैयार) मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
- फिनोल तैयार: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब 25: 24: 1 (प्रत्येक नमूना के लिए 600 μl) की जरूरत है।
- लेबल एम-प्रकार homogenization ट्यूब (एम-ट्यूब) और बर्फ पर शांत रहो।
- लेबल 2 मिलीलीटर टोपी नलियों पेंच, और प्रत्येक ट्यूब करने के लिए लगभग 300 μl Zirconia मोती जोड़ें।
- चेक के साधन उपलब्ध हैं: ऊतक dissociator, beadbeater, 50 मिलीलीटर ट्यूब और 96 प्लेटें, दीप्तिमापी के लिए एडाप्टर के साथ टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज।
संक्रमित ऊतकों से 2. शाही सेना निकालना
- -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से गुर्दे युक्त ट्यूबों निकालें और बर्फ पर डाल दिया। प्रत्येक गुर्दे को 2-mercaptoethanol के साथ RLT बफर मिलीलीटर 1.2 जोड़ें। एक एम-प्रकार homogenization ट्यूबों में बफर के साथ गुर्दे छानना।
- पूर्व लोड सेटिंग RNA_02.01 पर एक ऊतक dissociator का उपयोग कर गुर्दा Homogenize।
- आरटी पर एक tabletop अपकेंद्रित्र में 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
- Zirconia मोती युक्त पेंच टोपी ट्यूब के लिए 600 μl homogenate स्थानांतरण। बर्फ पर शेष homogenate बचाओ।
- 600 μl फिनोल जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब 25: 24: 1 के लिएपिछले चरण से ट्यूबों।
- एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में 3 मिनट के लिए beadbeater पर कसकर पलकों को बंद करें और भंवर।
- एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से, एक नया 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब जलीय चरण हस्तांतरण 70% इथेनॉल के बराबर मात्रा के साथ अच्छी तरह मिला लें, तो (दो बार लोड) स्पिन स्तंभ पर लोड।
- दो बार के साथ 500 μl बफर RPE द्वारा पीछा किया, 700 μl बफर आरडब्ल्यू के साथ एक बार स्पिन स्तंभ धो लें। एक सूखी संग्रह ट्यूब में सेंट्रीफ्यूज एक अतिरिक्त मिनट स्पिन स्तंभ में शेष तरल निकालने के लिए। 8000 x जी पर सभी centrifugation के चरणों का प्रदर्शन।
- 50 μl एच 2 ओ के साथ Elute आरएनए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 260 आयुध डिपो में शाही सेना एकाग्रता उपाय।
3. जीन एक्सप्रेशन डिजिटल बार कोडिंग का उपयोग प्रोफाइलिंग
- पिघलना संवाददाता codeset (हरी टोपी ट्यूब) और बर्फ पर कब्जा codeset (ग्रे टोपी ट्यूब)।
- फिर से करने के लिए 130 μl संकरण बफर जोड़ेंकुली codeset, मिश्रण और नीचे स्पिन करने के लिए पलटना।
- 12 प्रतिक्रिया ट्यूबों में से प्रत्येक के मिश्रण के 20 μl जोड़ें।
- प्रत्येक ट्यूब (5 μl की मात्रा में) कुल ऊतक शाही सेना के 10 माइक्रोग्राम जोड़ें। Pipetting द्वारा मिलाएं।
- प्रत्येक ट्यूब 5 μl कब्जा codeset जोड़ें। एक त्वरित स्पिन नीचे से पीछा ट्यूब flipping द्वारा मिलाएं।
- गर्म ढक्कन हे / एन (~ 18 घंटा) के साथ एक थर्मल cycler में 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
- -20 डिग्री सेल्सियस से एक नमूना कारतूस निकालें और आरटी के लिए यह गर्म करते हैं।
- एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में 2 मिनट के लिए 670 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस और सेंट्रीफ्यूज से दो अभिकर्मक प्लेटें निकालें।
- स्क्रीन पर कदम दर कदम निर्देश के बाद प्रस्तुत करने का स्टेशन स्थापित उच्च संवेदनशीलता विकल्प चुनें।
- थर्मल cycler से प्रतिक्रियाओं निकालें और तुरंत प्रस्तुत करने का स्टेशन पर लोड। उच्च संवेदनशीलता कार्यक्रम (3 घंटा) को चलाने के लिए चयन करें।
- प्रस्तुत करने का स्टेशन कार्यक्रम के पूरा होने पर, कारतूस को हटाने और एक स्पष्ट टेप के साथ गलियों सील। एपीप्लाई कारतूस की तह तक खनिज तेल (पीढ़ी के लिए एक nCounter केवल पीढ़ियों इस कदम की आवश्यकता नहीं है बाद में), तो डिजिटल विश्लेषक पर कारतूस लोड।
- उच्च संकल्प स्कैन विकल्प का चयन करें, स्क्रीन पर कदम दर कदम निर्देश का पालन डिजिटल विश्लेषक सेट करें।
- स्कैनिंग कार्यक्रम (~ 4.5 घंटा), उच्च संकल्प (600 क्षेत्रों) विकल्प का चयन करें चलाते हैं।
- स्कैनिंग कार्यक्रम पूरा हो गया है, परिणाम डाउनलोड (या ईमेल द्वारा परिणाम प्राप्त करने के लिए चुनते हैं), और निर्माता के सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा आयात करते हैं। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से डेटा की गुणवत्ता की जांच और डेटा की गुणवत्ता में सामान्य श्रेणी से बाहर हो जाता है, तो झंडे बढ़ा देंगे। तो एक एक्सेल फाइल के रूप में डेटा निर्यात, (सॉफ्टवेयर में निर्देशों का पालन वैकल्पिक) में निर्मित समारोह का उपयोग तकनीकी समायोजन प्रदर्शन करते हैं।
- निम्न विधियों में से एक का उपयोग कर डेटा मानक के अनुसार: codeset में सभी जीनों से कुल मायने रखता है; एक या कुछ आंतरिक नियंत्रण जीन; जियोमेट्रिक माध्यकी अत्यधिक व्यक्त जीनों (चर्चा देखें)।
- उसके बाद विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच अभिव्यक्ति के स्तर के अनुपात की गणना, प्रत्येक जीन (प्रयोग प्रतिकृति या triplicates में किया गया था तो) के लिए मतलब अभिव्यक्ति मूल्यों की गणना।
- (वैकल्पिक) का विश्लेषण और ऐसे MultiExperiment दर्शक के रूप में 10 nSolver सॉफ्टवेयर या एक क्लस्टरिंग कार्यक्रम में निर्मित कार्यों द्वारा की रूपरेखा परिणाम कल्पना।
Representative Results
रोगज़नक़ जीन अभिव्यक्ति विवो में रूपरेखा के लिए एक मुख्य चुनौती पर्याप्त रोगज़नक़ शाही सेना से पढ़ता मिल रहा है। कुल शाही सेना, कुल शाही सेना की बड़ी राशि में रोगज़नक़ टेप के कम प्रतिशत को देखते हुए (> 10 माइक्रोग्राम) प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना है। मंच इस परिप्रेक्ष्य में एक अनूठा लाभ है: यह एक पर कब्जा जांच और मेजबान शाही सेना के भारी मात्रा में शोर का एक महत्वपूर्ण स्तर के कारण नहीं है, इसलिए है कि विशिष्टता को बढ़ाने के लिए एक रिपोर्ट की जांच के लिए दोनों का उपयोग करता है। दो संक्रमित ऊतक के नमूने (नीले डॉट्स) से कच्चे मायने रखता है उत्पन्न सब से ऊपर 10 अभिव्यक्ति डेटा थे, जबकि चित्रा 1 में दिखाया गया है (रेफरी से अनुकूलित। 6), एक असंक्रमित ऊतक के नमूने से पृष्ठभूमि कच्चे मायने रखता है (लाल डॉट्स), सभी 10 से नीचे थे इस प्रोटोकॉल का उपयोग अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। चित्रा 1 में दिखाया गया है (रेफरी से अनुकूलित। 6), कच्चे मायने रखता दो जैविक प्रतिकृति (नीले डॉट्स, 48 घंटा के बाद संक्रमण गुर्दे नमूने) से बहुत goo थाआर-वर्ग मान के साथ घ संबंध 0.945 के बराबर होती है। मंच भी प्राकृतिक जैविक अभिव्यक्ति के स्तर धरना देने के लिए पर्याप्त गतिशील रेंज प्रदान करता है (चित्रा 1, कच्चे मायने रखता 6 1 से 10 और 10 के बीच लेकर)।
एक प्रारंभिक जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया inoculum और 12 घंटा के बीच काफी अलग आरएनए के स्तर के साथ जीन शामिल हैं: 248 पर्यावरण प्रतिक्रिया जीनों को निर्दिष्ट जांच सेट का उपयोग करना, हम रोगज़नक़ जीन (। रेफरी से अनुकूलित चित्रा 2, 6) अभिव्यक्ति के दो चरणों में भेद करने में सक्षम थे बाद संक्रमण के नमूने (पी <0.05 और> अभिव्यक्ति में 2 गुना परिवर्तन), और एक देर जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया 48 घंटा के बाद संक्रमण के नमूने (पी में 12 घंटे के समय बिंदु के बीच काफी अलग हैं कि शाही सेना के स्तर के साथ जीन <0.05 शामिल और> 2 गुना अभिव्यक्ति में परिवर्तन)। इन परिणामों के संकेत मिलता है कि सी सफेद जीन अभिव्यक्ति गतिशील आक्रामक infectio दौरान नियंत्रित किया जाता हैएक स्तनधारी मेजबान के एन।
चित्रा कच्चे संक्रमित और असंक्रमित गुर्दा ऊतकों से गिना जाता है 1.। (। रेफरी से 6 अनुकूलित) जांच गुर्दे नमूने एक बिखराव के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं दो संक्रमित (48 घंटा के बाद संक्रमण, नीले डेटा अंक) और एक असंक्रमित (लाल डेटा अंक) के लिए मायने रखता है साजिश है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सी चित्रा 2. अभिव्यक्ति सफेद पर्यावरण की दृष्टि से संवेदनशील जीन आक्रामक संक्रमण के दौरान (रेफरी से अनुकूलित। 6)। अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन 248 सी के लिए माउस गुर्दे आक्रमण के दौरान सफेद जीन एक गर्मी मीटर में प्रस्तुत कर रहे हैंएपी प्रारूप। जैविक triplicates मूल्यों का मतलब अप-विनियमन (पीला) के लिए दिखाया जाता है और 12, 24 में जीन की (नीला), और 48 घंटे के बाद संक्रमण रिश्तेदार नियमन नीचे inoculum स्तर (0 घंटा) मतलब करने के लिए। रंग संतृप्ति ऊपर गुना या नीचे विनियमन 10 पर पूर्ण परिपूर्णता के साथ अभिव्यक्ति परिवर्तन की हद तक का प्रतिनिधित्व करता है। गर्मी नक्शा के अंश प्रतिनिधि जल्दी विनियमित जीन (ऊपर), देर जीन (मध्य), और जल्दी नीचे विनियमित जीन (नीचे) वर्णन करने के लिए विस्तार कर रहे हैं। इन भागों में, अलग-अलग नमूने reproducibility के उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए अलग से प्रस्तुत कर रहे हैं। हम inoculum और 12 घंटे के नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के रूप में जल्दी अभिव्यक्ति में परिवर्तन को परिभाषित। हम 12 और 48 घंटे के नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के रूप में देर अभिव्यक्ति में परिवर्तन को परिभाषित। महत्व> 2 गुना और एक पी मूल्य 0.05 <के परिवर्तन को दर्शाता है। मतलब मूल्यों की गणना की गई पहले प्रत्येक नमूना के लिए डेटा नियंत्रण जीन TDH3 से शाही सेना के स्तर को सामान्यीकृत थे। हमारा काम मापदंड कुछ Dynamica की अनुमति देते हैंlly विनियमित जीन जल्दी और देर अभिव्यक्ति दोनों वर्गों में गिर करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक nanoString nCounter मंच का उपयोग रोगाणुओं से संक्रमण के ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग अनुकूलन करने के लिए विकसित की है। पूरी प्रक्रिया, अभिव्यक्ति के आंकड़ों के ऊतक संग्रह से, कम से कम 48 घंटा की आवश्यकता है। हाथों पर समय 12 नमूनों के लिए चारों ओर 4 घंटा है। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण चर बहुत पहले कदम पर ऊतक में जोड़ा बफर RLT की राशि है। बहुत कम बफर फिनोल क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम के बाद चिपचिपा जैल के गठन के लिए नेतृत्व और आरएनए वसूली के लिए कोई जलीय चरण छोड़ सकते हैं, जबकि बहुत ज्यादा बफर, homogenate पतला और आरएनए एकाग्रता कम करने के लिए नेतृत्व करेंगे। (विशिष्ट आकार संभालने) माउस ऊतकों के लिए बफर RLT के अनुभव से निर्धारित इष्टतम मात्रा में कर रहे हैं: गुर्दा (1.2 मिलीलीटर), जीभ (1.0 एमएल) और फेफड़ों (2.0 एमएल)। विशेष रूप से इन filamentous रूप में उगाया माइक्रोबियल रोगाणुओं के लिए, मनका-पिटाई के कदम को पूरी तरह सेलुलर सामग्री जारी करने के लिए खुले मोटी सेल की दीवार को तोड़ने के लिए मदद करता है। क्षालन चरण में, क्रम में अंतिम शाही सेना को बढ़ाने के लिएएकाग्रता, पहले दौर eluate स्तंभ वापस करने के लिए जोड़ा है, और एक दूसरी बार elute जा सकता है। लगभग 100 माइक्रोग्राम कुल ऊतक शाही सेना के एक RNeasy स्पिन स्तंभ (~ 2 माइक्रोग्राम / μl एक्स 50 μl) से बरामद किया जा सकता है। शाही सेना की बड़ी राशि की जरूरत है, एक दूसरे प्रस्तुत करने का शेष ऊतक homogenate से बनाया जा सकता है। आरएनए एकाग्रता मापा गया है जब तक बस के मामले में, शेष homogenate के निपटान मत करो।
संक्रमण मॉडल पर निर्भर करता है, inoculum आकार और रोगज़नक़ तनाव, कुल ऊतक शाही सेना में रोगज़नक़ आरएनए का प्रतिशत 0% -2% से भिन्न होता है, और आम तौर पर 0.05% -0.5% सीमा के भीतर गिर जाता है। सी से कुल ऊतक शाही सेना के उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोग्राम सफेद संक्रमित शुद्ध सी के 10 एनजी के बराबर कच्चे मायने रखता है उत्पन्न कर सकता है गुर्दा इन विट्रो संस्कृति से सफेद आरएनए (10 एनजी / 10 माइक्रोग्राम = 0.1%)। कुल ऊतक शाही सेना में रोगज़नक़ आरएनए का प्रतिशत एक विस्तृत श्रृंखला में बदलता है, क्योंकि यह pathoge की मात्रा पता करना मुश्किल हैकुल शाही सेना की दी गई राशि में n आरएनए। बर्बाद कर codeset से बचने के लिए पता लगाने के स्तर से नीचे रोगज़नक़ शाही सेना के साथ नमूनों पर (250 जीनों x 192 प्रतिक्रियाओं के लिए, प्रतिक्रिया प्रति लागत $ 200 के आसपास है), एक शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रत्येक नमूना भीतर रोगज़नक़ आरएनए स्तर निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस क्यू RTPCR या कुछ गृह व्यवस्था जीन से युक्त एक छोटे codeset या तो द्वारा किया जा सकता है।
रोगज़नक़ जीन का उपयोग कर सामान्यीकरण विभिन्न नमूनों के बीच तुलना की जा सकती अभिव्यक्ति प्रोफाइल पहले एक महत्वपूर्ण कदम है। सामान्य बनाने के लिए तीन आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीके हैं। Codeset में सभी जीनों से 1. इस्तेमाल की कुल मायने रखता है। 2. इस्तेमाल एक या कुछ 'हाउसकीपिंग' जीन। 3. उपयोग ज्यामितीय मतलब (एन एन उत्पाद की संख्या की जड़ ध) अत्यधिक व्यक्त जीनों की। एक बड़े codeset (> 100 जीन), एक अच्छा विकल्प हो सकता है सामान्य बनाने के लिए कुल गिनती का उपयोग, बेतरतीब ढंग से चुनी जांच युक्त लिए क्योंकि असंबंधित जीन हो सकता विश्वास की एक बड़ी संख्या के कुल मायने रखता हैपूरी तरह से शाही सेना इनपुट की राशि को दर्शाते हैं। एक छोटे से codeset (hyphal विकास जीन सह-विनियमित हो जाते हैं यह देखते हुए कि इस तरह के hyphal विकास के रूप में), एक विशेष प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित जांच युक्त (<100 जीन), एक को चुनने या कुछ हाउसकीपिंग जीनों के लिए सामान्य बनाने के लिए नियंत्रण आवश्यक है। TDH3, एक मजबूती के साथ व्यक्त चयापचय जीन, कई प्रयोगों के लिए नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से सेवा की है। तीसरा तरीका अत्यधिक व्यक्त जीनों से बराबर योगदान के लिए जोर देने के साथ, विधि 1 और 2 के एक संकर है।
NCounter मंच जीनोम चौड़ा नहीं है, यह एक एकल परख में से 800 जीनों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसलिए, विश्लेषण करने के लिए सबसे जानकारीपूर्ण जीनों को चुनने की रूपरेखा की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। जांच के लिए चयन करने के लिए दो तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। पहले दृष्टिकोण "आधारित ज्ञान है।" प्रकाशित अभिव्यक्ति और कार्यात्मक डेटा से सूचना चालू करने के लिए संभावित ब्याज की हैं कि जीन के लिए स्क्रीन करने के लिए संकलित किया गया हैइस तरह के पर्यावरण प्रतिक्रिया जीन 6-9, के रूप में अध्ययन करते हैं। इस दृष्टिकोण में विवो इसलिए डेटा की व्याख्या करने के लिए संदर्भ प्रदान करने, कई मौजूदा डेटासेट के लिए डेटा की रूपरेखा की आसान तुलना की अनुमति देता है। दूसरा दृष्टिकोण "आधारित अन्वेषण" है। ऐसे प्रतिलेखन कारक है, kinases या सेल दीवार प्रोटीन को निर्दिष्ट सभी जीनों के रूप में एक सूक्ष्म जीव जीनोम में जीन, के एक वर्ग जांच के लिए चुना जाता है। इस दृष्टिकोण में विवो डेटा 6 रूपरेखा पर आधारित उपन्यास विषैलापन कारकों और उपन्यास नियामक रिश्तों की खोज की पहचान के लिए अनुमति देता है।
Acknowledgments
यह काम एनआईएच अनुदान R21 DE023311 (एपीएम), R56 AI111836 (एपीएम और एसजीएफ), R01 AI054928 (एसजीएफ), और R01 DE017088 (एसजीएफ) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
