Abstract
对于大多数哺乳动物病原体，基因表达谱研究已经通过技术困难限于准确地从感染组织量化病原体基因转录。病原RNA构成从被感染的组织样本中分离出的总RNA的一小部分。这两种芯片和RNAseq技术在产生困难可靠的读取为弱表达病原体的基因。突变的病原体菌株具有降低体内扩散构成了更大的挑战。在这里，我们描述了一种在体内基因表达谱协议，这是非常快速的，极其敏感的和高重现性的。我们在我们的血行播散性念珠菌的鼠模型的真菌病原体白色念珠菌的调查过程中开发了这个协议。使用这个协议，我们已经证明动态调节C.时程肾脏感染期间白色念珠菌基因的表达，并发现了意想不到的功能基因表达反应抗真菌药物治疗的体内 。
Introduction
基因表达的动态保存有关细胞如何响应环境变化的重要信息。在一个微生物感染的情况下，基因表达数据可提供有关如何病原体适应于感染环境造成损害到主机临床相关的见解。在过去的二十年里， 无论是在体外和体内基因表达研究已经产生大量的数据，并奠定了基础，了解感染生物学1-3。然而，目前的分析技术，包括芯片和RNAseq，是不是最佳的病原体基因表达的感染过程中剖析。宿主RNA构成从感染的组织样品中分离的总RNA的压倒性部（通常> 99％）。主机RNA有助于对芯片高背景，而占主导地位序列从RNAseq读取。从感染组织病原体细胞分离，在理论上，可以帮助以富集病原体RNA，但它提出了另外人的问题：它需要大量的感染组织;该过程可能是乏味;而且最重要的，所以很难在冗长的过程，以节省天然状态或RNA的完整性。为了产生过程中真正的感染病原基因的表达更全面，更准确的数据，我们着手开发一个协议，允许少数RNA分子的可靠和具有成本效益的量化在混合RNA群。
NanoString NCounter酒店是最近开发的平台使用数字条形码探针对4，5，该平台具有灵敏度水平比得上QRT-PCR的，但不要求酶促扩增，使基因表达的直接复用的测量。该技术并不全基因组，它可以检测在每个测定高达800种不同的基因。因此，关键是要选择信息的基因作为探针进行性能分析。在这里，我们使用基因表达分析的主要嗡嗡声的研究一个病原体，白色念珠菌，在侵入性感染，例如，以证明：1）的实验程序（协议）的技术细节，2）该方法的灵敏度，再现性和动态范围（代表性的结果），和3）重要考虑用于设计和执行基于这个协议（讨论）的实验。该协议可以很容易地适用于各种病原体，并已在许多感染模型6-9得到成功应用。
Protocol
所有的动物程序都在洛杉矶生物医学研究所批准的机构动物护理和使用委员会（协议011000），并根据对动物伦理治疗健康（NIH）的指导方针全国学院进行。将小鼠关在一个AAALAC认证的工厂位于港 - 加州大学洛杉矶分校的研究和教育学院的校园内。有专职兽医谁专门从事实验动物药品监督他们的照顾。笼养和畜牧业是根据指引的美国公共卫生署出版的“指南实验动物的护理和使用”的规定。每一个试图人道地对待老鼠。的小鼠的存活和健康每天监测三次。显然生病，昏睡小鼠从组隔离和安乐死，以减少痛苦。小鼠戊巴比妥过量（210毫克/千克）安乐死的建议，对Euthanas小组IA美国兽医医学协会。
1.准备的组织，试剂与仪器
- 使用雄性BALB / C小鼠权重20-22克所有的研究。接种每个实验组三只小鼠静脉内用1×10 6酵母相C.白色念珠菌细胞。牺牲动物和收获肾脏在特定时间点后感染。将每个肾成螺旋盖管中，管理单元冷冻在液氮中，并储存在-80℃下购买RNA提取6。
注意：动物实验进行如Xu等人详细描述6。 - 从-80℃冰箱取出肾脏之前，请准备以下试剂和仪器：
- 打开一个总RNA提取试剂盒。添加2-巯基乙醇（1％体积/体积）缓冲RLT拌匀（制备2毫升每种样品）。
- 制备苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1（需要600微升的各样品）。
- 标签M型均化管（M-管）和冰浴。
- 标签2 ml的螺旋盖管中，并加入约300μl的锆珠在每个管。
- 检查仪器可供选择：组织离解，珠磨器，台式离心机与适配器50ml试管和96孔板，光度计。
2. RNA提取感染组织
- 删除包含从-80°C冰箱肾管和雪藏。添加1.2毫升缓冲液RLT用2-巯基乙醇对每个肾脏。滗肾脏用缓冲液成M型均化管中。
- 均质使用组织离解器中已预先加载设置RNA_02.01肾脏。
- 离心以1000×g离心在台式离心机在室温下1分钟。
- 转移600μl的匀浆含锆珠螺旋盖管中。保存在冰上剩余的匀浆。
- 添加600微升酚：氯仿：异戊醇25：24：1至管子从以前的步骤。
- 在4℃冷室关闭盖子紧密，涡对珠磨器3分钟。
- 离心管在15000×g离心5分钟，4℃冷室中。
- 水相小心转移到一个新的1.5 ml离心管，用70％的乙醇的等体积混合均匀，然后加载到旋转柱（负载两次）。
- 用700微升缓冲RW冲洗旋转柱一次，接着用两次500μl的缓冲液RPE。在干燥的收集管离心一个额外分钟，以除去残留的液体的离心柱。执行所有离心步骤在8000×g的。
- 洗脱的RNA用50μlH 2 O使用分光光度计测量RNA的浓度为OD 260。
3.基因表达谱使用数字条形码
- 解冻记者代码集（绿帽管）和捕捉代码集（灰帽筒）上冰。
- 添加130微升杂交缓冲液的重新搬运工代码集，颠倒混合和自旋向下。
- 添加20微升混合物到每个12反应管。
- 加10微克总组织的RNA（以体积5微升）到每个管中。通过移液混合。
- 加入5微升捕捉代码集，以每管。翻转管随后又迅速降速混合。
- 孵育反应在65℃下与加热盖O / N（〜18小时）的热循环仪。
- 从-20取出一个样品盒℃，并让它温至室温。
- 除去两个试剂板从4℃离心机在670×g离心在台式离心机2分钟。
- 设置了预备站下面一步一步的指示在屏幕上，选择高灵敏度的选项。
- 从热循环仪中取出的反应，并立即在准备站上加载。选择要运行的高灵敏度程序（3小时）。
- 当准备站计划完成后，取出硒鼓和密封通道用透明胶带。美联社帘布层矿物油到盒的底部（来产生一种NCounter酒店只，后人不需要此步骤），然后加载盒到数字分析仪。
- 建立数字化仪下面一步一步的指示在屏幕上，选择高分辨率的扫描选项。
- 选择高分辨率（600场）选项，运行扫描程序（〜4.5小时）。
- 当扫描程序完成，下载结果（或选择通过电子邮件收到的结果），并导入原始数据转换成制造商的软件。软件会自动检查数据和质量提高的标志，如果数据的质量下降超出正常范围。使用内置功能（可选，按照软件的说明）进行技术性调整，然后将数据导出为Excel文件。
- 正常化使用以下方法之一的数据：从代码集的所有基因的总计数;一个或几个内部对照基因;几何平均值的高表达基因（见讨论）。
- 计算平均表达值的每个基因（如果试验在重复或式三份进行），然后计算出的表达水平的不同的实验组之间的比率。
- （可选）分析和可视化通过在nSolver软件或聚类程序的内置功能，如MultiExperiment浏览器10的分析结果。
Representative Results
体内病原体的基因表达分析的一个主要挑战是获得足够的读取病原体RNA。给定病原体转录物中的总RNA，大量的总RNA的比例很低（> 10微克）具有用于每个反应。该平台具有独特的优势，在这个角度：它采用既捕捉探针和报告探针来增加特异性，那么该主机RNA的压倒性量不会引起噪声的显著水平。 如图1（改编自参考文献6），从背景未感染的组织样品的原始计数（红点）均低于10，而来自两个受感染的组织样品（蓝点）的原始计数所产生的所有上述10.表达数据使用此协议具有很强的可重复性。 如图1（改编自参考文献6），原始计数从两个生物学重复（蓝点，48小时感染后肾样本）具有非常粘质三维相关，与R平方值等于0.945。该平台还提供足够的动态范围以包含天然生物的表达水平（图1，原始计数之间10 1和10 6范围）。
使用探针组指定248环境反应的基因，我们能够看出两个阶段病原体的基因表达（ 图2，改编自参考文献6）的：早期的基因表达反应包括基因的RNA水平的接种和12小时之间显著不同在感染后的样品（P <0.05和>中表达2倍的变化），和一个晚期基因表达响应包括那些在48小时后的感染样品（P中的12小时的时间点之间显著不同的基因与RNA水平<0.05和> 2倍的变化表达）。这些结果表明，C。白色念珠菌基因表达过程中侵入infectio动态监管N A哺乳动物宿主的。
图1.原料从感染的和未感染肾组织计数（改编自参考文献6）。探针计算为两个感染（48小时感染后，蓝色数据点）和一个未感染的（红色数据点）肾脏样品呈现为散情节。 请点击此处查看该图的放大版本。
C的 图2的表达 白色念珠菌 对环境反应基因侵袭性感染期间在小鼠肾脏入侵248 C.（改编自参考文献6）。改变的表达水平白色念珠菌基因在热米呈现AP格式。一式三份生物的平均值示为上调（黄色）和下调的基因的（蓝色），12，24，和感染后相对于48小时为指接种物水平（0小时）。色彩饱和度表示的表达变化在10的范围内，具有完全饱和倍上调或下调。在热图的部分被扩展为说明代表早期上调的基因（上），晚期基因（中），和早期下调基因（底部）。在这些部分，个别样品分别来说明重现性。我们定义的早期表达变化的接种和12小时样品之间显著的差异。我们定义后期表达的变化为12和48小时样品之间显著的差异。意义是指> 2倍和p值<0.05的变化。每个样品的数据进行标准化的RNA水平从控制基因TDH3启动，计算平均值之前。我们的分配条件允许动感中的一些LLY调节基因落入这两个早期和晚期的表达类。 请点击此处查看该图的放大版本。
Discussion
该协议开发，优化感染使用nanoString NCounter酒店平台的微生物的转录谱。整个过程，从组织收集到的表达数据，需要不到48小时。动手时间约4小时的12个样品。在这个协议中的一个关键的变量是缓冲RLT的加入到组织上的第一步骤的量。太多缓冲器会稀释匀浆，并导致降低的RNA浓度，而过少缓冲器可能导致苯酚氯仿提取步骤后形成粘性凝胶的，离开RNA回收无水相。缓冲RLT为小鼠组织（假设典型大小）的经验确定最佳体积为：肾（1.2毫升），舌（1.0毫升）和肺（2.0毫升）中。对于病原微生物，特别是这些丝状的形式不断壮大，珠跳动一步，有助于破开厚厚的细胞壁充分释放细胞内容物。在洗脱工序中，为了提高最终核糖核酸浓度，在第一轮洗脱液可加回到柱中，洗脱第二次。大约总的组织的RNA的100微克可以从一个RNeasy旋转柱（〜2微克/微升×50微升）进行回收。如果需要较大的RNA量，第二制备可以从剩余的组织匀浆进行。直到RNA浓度进行了测量不处置剩余的匀浆，以防万一。
根据感染模型中，接种量和病原体菌株，病原体RNA的总的组织的RNA的百分比从0％-2％之间，典型地落在0.05％-0.5％的范围内。例如，10微克从 C总组织的RNA的白色念珠菌感染的肾能产生原始计数等于10毫微克纯C的白色念珠菌 RNA的体外培养（10毫微克/ 10微克= 0.1％）。由于病原RNA的总的组织的RNA的百分比在宽范围内变化，它是很难知道pathoge的量ÑRNA的总RNA的给定量。为了避免浪费代码集（250个基因×192反应，每次反应的费用是约$ 200）上与低于检测水平病原体RNA样品，的RNA质量控制步骤可被执行，以确定各样品中的病原体RNA水平。这可以通过Q-RT-PCR或含几看家基因的小的代码集来完成。
用病原体的基因正常化是表达谱前的关键步骤可以在不同样本间进行比较。有三个用于标准化的常用方法。 1.使用总计数从代码集所有基因。 2.用一个或几个“看家”基因。 3.使用几何平均值（ 第 N N个数的乘积的根）的高表达基因。对于一个大的代码集（> 100个基因），含随机选择探针，采用总计数正常化可以是一个很好的选择，因为大量不相关的基因可能信仰的总计数充分体现RNA的输入量。对于一个小代码集（<100基因）含有探针集中在一个特定的处理（例如菌丝生长，考虑到菌丝生长基因往往被共调节的），选择一个或几个看家基因作为对照用于标准化是必不可少的。 TDH3，一个健壮表达代谢基因，曾和控制的许多实验。第三种方法是方法1和2的混合体，重点用于从高表达基因相等的贡献。
虽然NCounter酒店平台不全基因组，它允许表达水平的定量为高达800个基因在单次分析。因此，选择最能提供信息的基因分析是对纹的成功至关重要。两种方法来选择用于探针已被使用。第一种方法是“基础知识”。已出版的表达和功能的数据的信息被编译以筛选基因是潜在感兴趣的当前研究，如对环境的反应基因6-9。这种方法使体内的分析数据，许多现有的数据集，从而提供上下文数据诠释容易比较。第二种方法是“基于探索”。 A类基因在微生物基因组中，如指定转录因子，激酶或细胞壁蛋白的所有基因的被选择为探针。这种方法允许识别基于所述体内分析数据6新颖毒力因子和发现的新调节的关系。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R21 DE023311（APM），R56 AI111836（APM＆SGF），R01 AI054928（SGF），和R01 DE017088（SGF）的部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
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