Profil d'expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar

Abstract

Pour la plupart des agents pathogènes de mammifères, profils d'expression génique études ont été limitées par des difficultés techniques de quantifier avec précision transcrits du gène pathogène à partir de tissus infectés. ARN pathogène constitue une infime partie de l'ARN total isolé à partir d'échantillons de tissus infectés. Les deux microréseaux et technologies RNAseq ont des difficultés à générer lit fiable pour les gènes pathogènes faiblement exprimés. Souches pathogènes mutants avec réduite dans la prolifération in vivo posent un défi encore plus grand. Nous décrivons ici une vivo l'expression du gène de protocole en ce que le profilage est très rapide, très sensible et hautement reproductible. Nous avons développé ce protocole au cours de notre enquête sur les champignons Candida albicans pathogène dans un modèle murin de candidose disséminée hématogène. En utilisant ce protocole, nous avons documenté les temps de régulée dynamiquement C. l'expression du gène albicans lors d'une infection rénale, et caractéristiques inattendues de découvertesRéponses d'expression de gène antifongique à un traitement médicamenteux in vivo.

Introduction

La dynamique d'expression génique est l'information essentielle sur la façon dont une cellule réagit aux changements environnementaux. Dans le cas d'un microbe infectant, les données d'expression génique pourraient fournir des indications sur la façon cliniquement pertinentes d'un agent pathogène adapte à l'environnement de l'infection et provoque des dommages à l'hôte. Dans les deux dernières décennies, les études d'expression du gène à la fois in vitro et in vivo ont généré grande quantité de données et jeté une base pour la compréhension de biologie de l'infection ^1-3. Cependant, les technologies de profilage actuelles, y compris microarray et RNAseq, ne sont pas optimales pour le profilage de l'expression génique des agents pathogènes pendant l'infection. Hôte ARN constitue une portion écrasante (généralement> 99%) de l'ARN total isolé à partir des échantillons de tissus infectés. L'ARN hôte contribue à fond élevé sur les microréseaux, et domine séquence lit à partir RNAseq. L'isolement cellulaire des pathogènes à partir de tissus infectés, en théorie, peut contribuer à enrichir de l'ARN de l'agent pathogène, mais il pose plusproblèmes al: il nécessite de grandes quantités de tissus infectés; la procédure peut être fastidieux; et surtout, il est difficile de conserver l'état ou l'intégrité de l'ARN natif pendant le long processus. Afin de générer des données plus complètes et précises sur l'expression des gènes des pathogènes durant infections réelles, nous avons décidé de développer un protocole qui permet une quantification fiable et rentable d'espèces d'ARN minoritaire dans une population d'ARN mixte.

NanoString nCounter est une plate-forme élaborée récemment, qui rend la mesure multiplexée directe de l'expression des gènes en utilisant des paires de sondes de codes-barres numériques ^{4, 5.} Cette plate-forme a un niveau comparable à celui de QRT-PCR sensibilité, mais ne nécessite pas d'amplification enzymatique. La technologie est pas l'échelle du génome, il permet de détecter jusqu'à 800 gènes différents dans chaque essai. Par conséquent, il est essentiel de sélectionner les gènes informatifs en tant que sondes pour le profilage. Ici, nous utilisons l'expression du gène de profilage étude d'un ronflement importantun agent pathogène, Candida albicans, lors d'une infection invasive à titre d'exemple, pour démontrer: 1) les détails techniques des procédures expérimentales (protocole), 2) La sensibilité, la reproductibilité et la gamme dynamique de cette méthode (résultats représentatifs), et 3) Important considérations pour la conception et la réalisation d'expériences basées sur ce protocole (de discussion). Ce protocole peut être facilement adapté pour divers agents pathogènes et a été appliquée avec succès dans un certain nombre de modèles d'infection ^6-9.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle au Angeles Biomedical Research Institute de Los (protocole 011000) et effectués selon les National Institutes of Health (NIH) des lignes directrices pour le traitement éthique des animaux. Les souris ont été mis en cage dans un établissement accrédité par AAALAC situé sur le campus de Port-UCLA Institut de recherche et d'éducation. Un vétérinaire à temps plein qui se spécialise dans la médecine des animaux de laboratoire a supervisé leurs soins. Confiner et l'élevage ont été fournis selon les lignes directrices dans la publication «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire" US Public Health Service. Tout a été fait pour traiter les souris humainement. La survie et la santé de la souris a été suivie trois fois par jour. Évidemment souris malades, léthargique ont été séparés du groupe et euthanasiés pour minimiser les souffrances. Les souris ont été tués par une overdose de pentobarbital (210 mg / kg), comme recommandé par le Groupe d'étude sur EuthanasIA de l'American Veterinary Medical Association.

1. Préparation des tissus, réactifs et des instruments

1. Utilisez mâles souris Balb / c pesant 20-22 g pour toutes les études. Inoculer trois souris par groupe expérimental par voie intraveineuse avec 1 x 10 ⁶ levure phase C. cellules albicans. Sacrifier des animaux et les reins récolte à des moments spécifiques post-infection. Placez chaque rein dans un tube à bouchon à vis, snap gel dans de l'azote liquide, et les conserver à -80 ° C pour l'extraction de l'ARN tard ^6.
   Remarque: Les expériences animales ont été réalisées comme décrit en détail dans Xu et al ^6..
2. Préparer les réactifs et les instruments suivants avant de retirer les reins du congélateur à -80 ° C:
   1. Ouvrez un kit d'extraction totale de l'ARN. Ajouter du 2-mercaptoéthanol (1% v / v) de tampon RLT et bien mélanger (2 ml préparer pour chaque échantillon).
   2. Préparer phénol: chloroforme: alcool isoamylique 25: 24: 1 (600 ul besoin pour chaque échantillon).
   3. Identifier les tubes de type M homogénéisation (M-tube) et froid sur la glace.
   4. Étiquette 2 ml vis des tubes à bouchon, et ajouter environ 300 billes de zircone ul à chaque tube.
   5. Vérifier les instruments sont disponibles: dissociateur de tissu, BeadBeater, centrifugeuse de avec des adaptateurs pour tubes de 50 ml et plaques à 96 puits, photomètre.

2. Extraction de l'ARN à partir de tissus infectés

1. Retirer les tubes contenant les reins de -80 ° C congélateur et mis sur la glace. Ajouter 1,2 ml de tampon RLT avec 2-mercaptoéthanol à chaque rein. Décanter rein avec un tampon dans les tubes d'homogénéisation de type M.
2. Homogénéiser le rein en utilisant une dissociateur de tissu sur la pré-chargée paramètre RNA_02.01.
3. Centrifuger à 1000 g pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse à température ambiante.
4. Transférer 600 ul homogénat au tube de bouchon à vis contenant des billes de zircone. Enregistrez le homogénat restant sur la glace.
5. Ajouter 600 pi de phénol: chloroforme: alcool isoamylique 25: 24: 1 àles tubes de l'étape précédente.
6. Fermez les couvercles hermétiquement et vortex sur BeadBeater pendant 3 min dans un 4 ° C chambre froide.
7. Centrifuger les tubes à 15 000 xg pendant 5 min à 4 ° C une chambre froide.
8. Soigneusement transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml, bien mélanger avec un volume égal d'éthanol à 70%, puis les charger sur la colonne de spin (de charge deux fois).
9. Laver la colonne de centrifugation une fois avec 700 ul de tampon RW, suivie par deux fois avec 500 ul de tampon RPE de. Centrifugeuse un minute supplémentaire dans un tube de collecte sec pour enlever le liquide restant dans la colonne de spin. Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 8000 x g.
10. Eluer avec 50 ul d'ARN H ₂ O. Mesurer la concentration de l'ARN à une DO de ₂₆₀ au moyen d'un spectrophotomètre.

3. profilage d'expression génique utilisant numérique de codage de bar

1. Codeset dégel du rapporteur (tube à bouchon vert) et la capture jeu de codes (tube gris bouchon) sur de la glace.
2. Ajouter du tampon d'hybridation 130 ul de la rePorter codeset, renverser pour mélanger et centrifuger.
3. Ajouter 20 pi de mélange pour chacun des 12 tubes de réaction.
4. Ajouter 10 ug d'ARN de tissu total (en un volume de 5 ul) dans chaque tube. Mélanger à la pipette.
5. Ajouter 5 ul capture codeset à chaque tube. Mélanger en retournant le tube suivi d'une vrille rapide vers le bas.
6. Incuber les réactions à 65 ° C dans un cycleur thermique à couvercle chauffé O / N (~ 18 h).
7. Retirez une cartouche d'échantillon de -20 ° C et laisser réchauffer à température ambiante.
8. Retirer les deux plaques réactifs de 4 ° C et centrifuger à 670 g pendant 2 min dans une centrifugeuse de table.
9. Mettre en place la station de préparation suivant étape par étape les instructions sur l'écran, sélectionnez l'option haute sensibilité.
10. Retirez les réactions du cycleur thermique et charger immédiatement sur la station de préparation. Sélectionnez pour exécuter le programme de haute sensibilité (3 h).
11. Lorsque le programme de la station de préparation est terminée, retirez la cartouche et sceller les voies avec un ruban adhésif transparent. Apnappe d'huile minérale au fond de la cartouche (pour la génération d'un nCounter que, plus tard, les générations ne nécessitent pas cette étape), puis charger la cartouche sur l'analyseur numérique.
12. Configurer l'analyseur numérique suivant étape par étape les instructions sur l'écran, sélectionnez l'option balayage à haute résolution.
13. Sélectionnez l'option (600 champs) haute résolution, exécutez le programme de numérisation (~ 4,5 h).
14. Lorsque le programme de numérisation est terminée, téléchargez les résultats (ou choisir de recevoir les résultats par e-mail), et importer des données brutes dans le logiciel du fabricant. Le logiciel vérifie automatiquement la qualité des données et de soulever les drapeaux si la qualité des données se situe hors de la plage normale. Effectuer ajustement technique en utilisant la fonction intégrée (en option, suivez les instructions dans le logiciel), puis exporter les données dans un fichier Excel.
15. Normaliser les données en utilisant l'une des méthodes suivantes: comptes totaux de tous les gènes dans le jeu de codes; une ou quelques gènes de contrôle interne; Moyenne géométriquegènes fortement exprimés de (voir la discussion).
16. Calculer les valeurs moyennes d'expression pour chaque gène (si l'expérience a été effectuée en triple ou répétitions), puis calculer le rapport des niveaux d'expression entre les différents groupes expérimentaux.
17. (optionnel) analyser et visualiser les résultats de profilage par les fonctions intégrées dans le logiciel nSolver ou un programme de regroupement tels que MultiExperiment Viewer ^10.

Representative Results

Un défi majeur pour l'expression du gène pathogène profilage in vivo est d'obtenir suffisamment lit à partir de l'ARN de l'agent pathogène. Compte tenu du faible pourcentage de transcrits d'ARN total en agents pathogènes, une grande quantité d'ARN total (> 10 pg) doit être utilisé pour chaque réaction. La plate-forme dispose d'un avantage unique dans cette perspective: il utilise à la fois une sonde de capture et une sonde de rapport pour augmenter la spécificité, de sorte que la quantité écrasante de l'ARN d'accueil ne provoque pas un niveau significatif de bruit. Comme le montre la Figure 1 (adapté de Réf. 6), fond chiffres bruts à partir d'un échantillon de tissu non infecté (points rouges) étaient toutes inférieures à 10, tandis que les chiffres bruts provenant de deux échantillons de tissus infectés (points bleus) étaient tous au-dessus de 10. Les données d'expression générées en utilisant ce protocole sont hautement reproductible. Comme le montre la figure 1 (adapté de Réf. 6), chiffres bruts de deux répétitions biologiques (points bleus, des échantillons post-infection des reins 48 h) avait très good corrélation, avec une valeur de R-carré est égal à 0,945. La plate-forme fournit également une dynamique suffisante pour englober les niveaux d'expression biologiques naturels (Figure 1, chiffres bruts se situaient entre 10 et 10 ^{1 6).}

L'utilisation d'un ensemble de sondes précisant 248 gènes de la réponse de l'environnement, nous avons été en mesure de discerner deux phases de l'expression du gène de l'agent pathogène (Figure 2, adapté de Réf. 6): une réponse de l'expression du gène précoce comprend des gènes avec des niveaux significativement différents entre l'inoculum et 12 h ARN échantillons post-infection (P <0,05 et> 2 fois le changement dans l'expression), et une réponse de l'expression du gène retard comprend des gènes avec des niveaux d'ARN qui sont significativement différents entre le point de temps de 12 heures à des échantillons post-infection 48 h (P <0,05 et> 2 fois changement dans l'expression). Ces résultats indiquent que C. l'expression du gène albicans est dynamiquement régulée au cours Infectio invasiven d'un hôte mammifère.

Figure 1. Raw compte à partir de tissus rénaux infectés et non infectés (adapté de Réf. 6). Probe est compté pour deux infectée (48 heures post-infection, points de données bleus) et un (points de données rouges) non infectées échantillons rénaux sont présentés comme une dispersion parcelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Expression de C. albicans gènes sensibles de l'environnement lors de l'infection invasive (adapté de Réf. 6). Les changements dans les niveaux d'expression lors de l'invasion de rein de souris pour 248 C. albicans gènes sont présentés dans une chaleur mFormat ap. Les valeurs moyennes de trois exemplaires biologiques sont montrés pour régulation à la hausse (jaune) et la régulation (bleu) de gènes à 12, 24, et 48 h post-infection par rapport à la concentration moyenne inoculum (0 h). La saturation des couleurs représente la mesure de la variation de l'expression, avec la pleine saturation à 10 fois haut ou bas-régulation. Des portions de la carte de chaleur sont développés pour illustrer représentant début jusqu'à réglementés gènes (en haut), les gènes tardifs (au milieu), et les gènes début régulé à la baisse (en bas). Dans ces parties, les échantillons individuels sont présentés séparément pour illustrer la reproductibilité. Nous définissons les changements d'expression dès différences significatives entre l'inoculum et 12 échantillons de RH. Nous définissons les changements d'expression tardives comme des différences significatives entre les échantillons 12 et 48 h. Importance réfère aux changements de> 2 fois et une valeur de p <0,05. Les données pour chaque échantillon ont été normalisées à des niveaux de TDH3 du gène d'ARN de commande avant les valeurs moyennes ont été calculées. Nos critères d'affectation permettent une certaine dynamicagènes régulés lly de tomber dans les deux classes d'expression précoces et tardives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce protocole est développé pour optimiser profilage transcriptionnel d'infecter les microbes en utilisant une plate-forme nanoString nCounter. L'ensemble de la procédure, de la collection de tissus à des données d'expression, exige moins de 48 heures. Les mains sur le temps est environ 4 h pour 12 échantillons. Une variable clé dans ce protocole est la quantité de RLT tampon ajoutée au tissu à la toute première étape. Trop de tampon va diluer l'homogénat et conduire à abaisser la concentration d'ARN, tandis que trop peu de tampon peut conduire à la formation de gels visqueux après l'étape d'extraction au phénol chloroforme et de ne pas laisser de phase aqueuse pour la récupération de l'ARN. Les volumes déterminés empiriquement optimales de tampon RLT pour des tissus de souris (en supposant tailles typiques) sont les suivants: rein (1,2 ml), de la langue (1,0 ml) et du poumon (2,0 ml). Pour les agents pathogènes microbiens, en particulier ces cultivées en forme filamenteuse, l'étape de perles battant contribue à briser le mur de la cellule ouverte épais pour libérer entièrement contenu cellulaire. Dans l'étape d'élution, en vue d'accroître l'ARN finaleconcentration, le premier éluat ronde peut être ajouté à la colonne, et élue une deuxième fois. Environ 100 pg d'ARN total de tissu peut être récupéré d'une colonne de spin RNeasy (~ 2 pg / pl x 50 pi). Si plus grande quantité de l'ARN est nécessaire, une seconde préparation peut être faite à partir de l'homogénat de tissu restant. Ne jetez pas de l'homogénat restant jusqu'à la concentration d'ARN a été mesurée, juste au cas où.

Selon le modèle d'infection, la taille de l'inoculum et la souche pathogène, le pourcentage de l'ARN de l'agent pathogène dans l'ARN tissulaire totale varie de 0% -2%, et typiquement relève de la gamme de 0,05% -0,5%. Par exemple, 10 ug d'ARN total de tissus de C. albicans infecté rein pourrait générer des chiffres bruts égal à celui de 10 ng de pur C. albicans à partir de l'ARN in vitro d'une culture (10 ng / 10 ug = 0,1%). Parce que le pourcentage de l'ARN de l'agent pathogène dans l'ARN du tissu total varie dans une large gamme, il est difficile de connaître la quantité de pathogen ARN dans une quantité donnée de l'ARN total. Pour éviter de perdre le jeu de codes (pour 250 gènes x 192 réactions, le coût par réaction est d'environ 200 $) sur des échantillons d'ARN de l'agent pathogène en dessous du niveau de détection, une étape de contrôle de la qualité de l'ARN peut être effectuée pour déterminer le niveau de l'ARN de l'agent pathogène à l'intérieur de chaque échantillon. Cela peut être fait soit par Q-RT-PCR ou un petit jeu de codes contenant quelques gènes de ménage.

La normalisation en utilisant des gènes pathogènes est une étape critique avant les profils d'expression peuvent être comparées entre différents échantillons. Il existe trois méthodes couramment utilisées pour la normalisation. 1. Utiliser des chiffres totaux de tous les gènes dans le jeu de codes. 2. Utilisez un ou quelques gènes «ménagers». 3. Utilisation de la moyenne géométrique (N ^ième racine du produit des nombres N) de gènes fortement exprimés. Pour un grand jeu de codes (> 100 gènes) contenant des sondes choisies au hasard, en utilisant le compte total pour la normalisation peut être un bon choix, parce que les nombres totaux d'un grand nombre de gènes indépendants peuvent foirefléter pleinement le montant de l'entrée de l'ARN. Pour un petit jeu de codes (<100 gènes) contenant des sondes ont porté sur un processus spécifique (tels que la croissance des hyphes, étant donné que les gènes de croissance des hyphes ont tendance à être co-réglementé), choisissant l'un ou quelques gènes de ménage que le contrôle de la normalisation est essentielle. TDH3, un gène métabolique vigoureusement exprimé, a bien servi en tant que témoin pour de nombreuses expériences. La troisième méthode est un hybride de la méthode 1 et 2, avec un accent pour sa contribution égale de gènes fortement exprimés.

Bien que la plate-forme nCounter est pas l'échelle du génome, il permet de quantifier le niveau d'expression jusqu'à 800 gènes dans un seul essai. Par conséquent, le choix des gènes les plus informatives à analyser est essentiel pour le succès du profilage. Deux approches pour sélectionner pour les sondes ont été utilisées. La première approche est "fondée sur la connaissance". Informations expression données publiées et fonctionnelle est compilé à l'écran pour les gènes qui sont d'un intérêt potentiel pour le courantétudier, tels que les gènes de la réponse de l'environnement ^6-9. Cette approche permet de comparer facilement les données de profilage in vivo à de nombreux jeux de données existants, donc fournir un contexte pour l'interprétation des données. La seconde approche est "exploration basée". Une catégorie de gènes dans un génome de microbes, tels que les gènes spécifiant des facteurs de transcription, des kinases ou des protéines de la paroi cellulaire sont choisis pour les sondes. Cette approche permet l'identification de nouveaux facteurs de virulence et la découverte de nouvelles relations de régulation basés sur le profilage des données in vivo ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotec	130-093-235
gentelMACS M tube	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-mercaptoethanol	Sigma	M-3148
Phenol:CHCl3:IAA	Sigma	P-2069
Zirconia beads	Biospec Products	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
nCounter Analysis system	nanoString Technologies
nCounter Gene Expression Codesets	nanoString Technologies
nSolver Analysis tool	nanoString Technologies