Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bygga en snabb Brillouin spektrometer. Cascading nästan avbildade fas array (VIPA) etalons uppnå en hastighetsmätning mer än 1.000 gånger snabbare än traditionell skanning Fabry-Perot spektrometrar. Denna förbättring ger möjlighet för Brillouin analys av vävnad och biomaterial vid låga effektnivåer in vivo.
Abstract
Målet med detta protokoll är att bygga en parallell hög utrotning och hög upplösning optisk Brillouin spektrometer. Brillouin-spektroskopi är en beröringsfri mätmetod som kan användas för att erhålla direkt avläsning av viskoelastiska materialegenskaper. Det har varit ett användbart verktyg i materialkarakterisering, strukturell övervakning och miljö avkänning. I det förflutna, har Brillouin spektroskopi används vanligen scanning Fabry-Perot etalons att utföra spektralanalys. Denna process kräver hög ljusstyrka effekt och långa hämtningstider, vilket gör tekniken olämplig för biomedicinska tillämpningar. En nyligen införda nya spektrometer vinner denna utmaning genom att använda två VIPAs i en tväraxelkonfiguration. Denna innovation gör sub-gigahertz (GHz) upplösning spektralanalys med sub-andra förvärv tid och belysning makt inom säkerhetsgränserna för biologisk vävnad. De många nya applikationer underlättas av denna förbättring är currently undersöks i biologisk forskning och klinisk tillämpning.
Introduction
Brillouinspridning, som först beskrevs av Leon Brillouin 1 1922, är det oelastiska spridning av ljus från de termiska akustiska moder i en solid och från de termiska densitet svängningar i en vätska eller gas. Den spektrala förskjutning av det spridda ljuset, vanligen i under GHz-range, ger information om samspelet mellan det infallande ljuset och de akustiska fononer i provet. Som ett resultat, kan det ge användbar information beträffande de viskoelastiska egenskaperna hos det undersökta materialet.
I dess spontana versionen har Brillouinspridning allmänt tvärsnitt i storleksordningen Ramanspridning, vilket resulterar i en mycket svag signal. Dessutom Brillouin frekvensskift är storleksordningar mindre än Raman skift. Som en följd av elastiskt spritt ljus (från Rayleigh eller Mie spridning), ströljus och back-reflexer från provet kan alla lätt överskugga Brilloiun spektrala signatur. DärförBehöver en Brillouin spektrometer att inte bara uppnå sub-GHz spektral upplösning men också hög spektral kontrast eller utrotning.
I traditionella Brilloiun spektrometrar dessa krav uppfylls av scanning-galler monokromatorer, optiska malningsmetoder, och, mest populärt, med flera pass scanning Fabry-Perot interferometrar 2. Dessa metoder mäter varje spektralkomponent sekventiellt. Detta synsätt leder till hämtningstider för en enda Brillouin spektrum från några minuter till flera timmar, beroende på instrumentet och på provet. Tvåstegs-VIPA spektrometer, byggd med hjälp av detta protokoll, har förmågan att samla alla de spektrala komponenterna inom mindre än en sekund samtidigt som tillräcklig utrotning (> 60 dB) för att effektivt undertrycka andra falska signaler 2.
Integrationen av VIPA etalons är den viktigaste delen av denna spektrometer. En VIPA är en solid etalon med tre olika coating områden: i den främre ytan, gör en smal antireflexbehandling Remsan ljuset att komma in i VIPA, medan resten av ytan har en högreflekterande (HR) beläggning; i den bakre ytan, gör en delvis reflekterande beläggning en liten del (~ 5%) av det ljus som skall sändas. När fokuseras på den smala ingången till något lutande VIPA, får ljusstrålen som reflekteras i delkomponenter med fast fasskillnad i VIPA 2. Interferens mellan underkomponenterna uppnår eftersträvade hög spektral spridning. Justera två VIPAs sekventiellt i tväraxelkonfiguration introducerar spektral dispersion i ortogonala riktningar 3. Den spektrala spridningen i ortogonala riktningar separerar spatialt Brilloiun toppar från oönskad överhörning, vilket gör det möjligt att plocka upp bara Brillouin signalen. Figur 1 visar en schematisk bild av tvåstegs VIPA spektrometer. Pilarna under de optiska elementen indikerar degree av frihet där translationella stegen bör inriktas.
Figur 1. Instrumental inställning. En optisk fiber levererar Brillouinspridning i spektrometern. En cylindrisk lins C1 (f = 200 mm) fokuserar ljuset in i ingången till den första VIPA (VIPA1). En annan cylindrisk lins C2 (f = 200 mm) kartlägger spektrala vinkel dispersionen i en rumslig separation i fokalplan C2. I detta plan, är en vertikal mask används för att välja den önskade delen av spektrumet. En analog konfiguration följer, lutar i 90 grader. Strålen passerar genom en sfärisk lins S1 (f = 200 mm) och fokuseras i ingångsslitsen av andra VIPA (VIPA2). En sfärisk lins S2 (f = 200 mm) skapar två-dimensionell spektralt separerade mönstret i dess fokalplan, där en annan horisontell mask är placerad. Horsontal mask avbildas på EMCCD kameran med en akromatisk lins par. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En doktorand med några optik kurser och grundläggande inriktnings erfarenhet bör kunna bygga och använda detta i två steg spektrometer. Spektrometern har nyligen visat sig vara kompatibel med en mängd olika standard optiska sönder 3,4,5 (t.ex. konfokal mikroskop, endoskop, spaltlampa oftalmoskop). Här, är spektrometern ansluten till ett konfokalmikroskop. Laserljuset är inriktad i en standard forskning inverterat systemet mikroskop efter att integrera en 90:10 stråldelare. Den bakåtspridning ljus från provet kopplas till en enkelmodfiber, vilket gör mikroskopet konfokala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Brillouin spektralanalys kräver en enda longitudinell mod laser (~ 10 mW vid provet). För inriktning ändamål, använd en kraftigt försvagad del av denna laserstråle (<0,1 mW).
1. Grundinställn av Fiber och EMCCD (Electron Multiplied Charge Coupled Device) Kamera
- Identifiera ca 1600 mm fritt inriktnings utrymme för spektrometern på en optisk bord.
- Montera EMCCD kameran vid slutet av den fria inriktningsutrymme.
- Använd ställskruvar för att fästa kameran på inlägg. Dra stolparna i befattningshavare på den önskade optiska axeln höjd. Dra åt befattningshavare på den optiska tabell med tabell klämmor.
- Slå på EMCCD kameran. Var uppmärksam för att undvika kamera mättnad.
- Installera kamerans mjukvara på lab datorn och anslut kameran till datorn.
- Inaktivera förstärkningen och ställa låg integrationstiden (~ 0,01 sek). Börja förvärva EMCCD bilder. Observera kamerabildens på datorskärmen.
- Montera fiber kollimatorn om 1.600 mm framför kameran.
- Placera fiber kollimator i fiber kollimatorn adaptern.
- Montera adaptern på ett inlägg. Dra åt-tjänst till en stolpe hållare vid den ungefärliga höjden för den optiska axeln (höjden av kameran). Dra åt befattningshavare på optisk tabell med tabell klämmor.
- Rikta utgångsstrålen utmed den optiska axeln.
- Använd en ställskruv för att ansluta en standard iris till en tjänst. Dra åt tjänst till en befattningshavare.
- Placera iris framför fiber kollimator (<50 mm). Justera höjden av iris till balken. Flytta iris längs den önskade optiska axeln, som ska peka direkt in i kameran.
- Sätt en optisk densitet filter direkt efter laserutsignalen om kamera mättas. Använd justeringsskruvar fiber koUimator fästet att rikta strålen längs den optiska axeln. När detta har uppnåtts, denstrålen rent passera genom iris längs hela strålbanan.
- Montera ett matchat akromatisk lins par (f = 30 mm) framför kameran.
2. Horisontellt Stadium Spectrometer
- Montera den horisontella masken.
- Använd ställskruvar för att fästa den horisontella masken på ett inlägg. Dra åt tjänst till en befattningshavare. Montera stolpen hållare på en translationssteget, vilket gör att masken för att glida horisontellt in och ut ur strålgången. (Figur 1)
- Använd skruvarna för att dra åt den translation stadium på den optiska bordet så att masken avbildas skarpt på CCD-kamera på fokalavståndet (f = 30 mm) för den akromatisk lins paret.
- Montera och justera den sfäriska linsen S1 (f = 200 mm) 600 mm framför den horisontella masken.
- Använd ställskruvar för att montera S1 på en befattningshavare. Dra åt tjänst till en befattningshavare.
- Montera två iris, såsom beskrivs i 1.5.1. Före Placing S1 i strålgången, infoga en iris före och en iris efter önskat S1 läge (600 mm framför den horisontella mask). Justera höjden på iris så att strålen passerar rent genom dem båda.
- Placera S1 600 mm framför den horisontella masken (Figur 1). Justera höjd och vinkel på S1 tills både den återreflektion bort från linsen och ut kommande balk, rent passera genom iris. Dra åt befattningshavare håller S1 på den optiska tabell med tabell klämmor.
- Montera VIPA2 i fokalplan den sfäriska linsen (200 mm framför S1).
- Montera VIPA hållare på ett inlägg med hjälp av de medföljande skruvarna med hållaren. Dra åt tjänst till en befattningshavare. Dra åt befattningshavare på en horisontell translationssteg. (Figur 1)
- Placera VIPA2 försiktigt i VIPA hållaren med ingångsslitsen orienterade vertikalt. (Figur 1)
- Fine-justera positionen of VIPA mount vara exakt i fokalplanet av S1. (Kontrollera genom att spåra strålmidja med ett vitt kort.)
- Använd skruvarna för att dra åt translationell scenen på den optiska bordet och skjut VIPA2 ur strålen med hjälp av graden av frihet translationell scenen.
- Montera och justera den sfäriska linsen S2 (f = 200 mm) 200 mm efter VIPA och 200 mm framför den horisontella masken. Följ förfarandet som beskrivs i 2.2.1-2.2.3. I stället för att fästa stolpen hållare på den optiska bordet, montera den på en translationell stadium med dess frihetsgrad orienterad längs den optiska axeln. (Figur 1) Använd skruvarna för att dra åt translationell scenen på den optiska bordet.
- Använd den horisontella translationssteget (2.3.4) att skjuta VIPA2 inträde i strålgången. Följ vertikala linjer på kamerabilden.
- Finjustera S2 med hjälp av translationell scenen monterade i 2.4 tills de vertikala linjer på kamerabilden visasskarp.
- Justera spektrum med horisontell lutning grad av frihet på VIPA hållaren och translationell scenen. Använd den horisontella-översättning grad av frihet att ställa ingången läget för strålen i etalonen. Använd horisontell lutning grad av frihet att ställa ingångsvinkeln för strålen i etalonen.
- Mät finess och genomströmning.
- Ta en bild genom att trycka på F5 eller alternativt genom att klicka på "förvärvs setup" i det övre vänstra hörnet och välja alternativet "ta bild" i kamerans mjukvara.
- Högerklicka på bilden och välj alternativet "linjediagram". Dra markören horisontellt över bilden för att generera en linjediagram. Släpp markören för att observera den genererade linjediagram.
- Använd linjediagram för att mäta finess. Fördela avståndet mellan två toppar av deras halvvärdesbredd (FWHM). Sikta på> 30.
- Bestäm genomströmningen genom measuring makten med en effektmätare omedelbart före och efter VIPA2. Sikta på> 50%.
- Trimma ingångsvinkeln för strålen in i etalonen med graden av frihet på VIPA hållaren (2,6) och observera avvägningen mellan finess och kapacitet.
- Om finess och genomströmning är inte tillfredsställande gå tillbaka och fina justera inriktningen. Se till VIPA2 är i fokalplanet av S1. Upprepa steg 2.3.3 -2,7.
3. Vertikal Stadium Spectrometer
- Skjut VIPA (VIPA2), inriktade i del 2, av strålen med hjälp av translationell skede (2.3.4). Den horisontella stadiet spektrometerns kommer nu uppträda som en 1: 1 avbildningssystem.
- Montera den vertikala masken.
- Använd ställskruvar för att fästa den vertikala masken på ett inlägg. Dra ett inlägg i en rät vinkel efter klämadapter. Dra en andra inlägg i den vinkel adapter och lägg den i en befattningshavare. Montera befattningshavare på en vertikal translationell skede allowing masken för att glida vertikalt in och ut ur strålgången. (Figur 1)
- Använd skruvarna för att dra den vertikala translations scenen på den optiska bordet så att den vertikala masken avbildas kraftigt på EMCCD kameran 200 mm framför S1.
- Montera och justera den cylindriska linsen C1 (f = 200 mm) 600 mm framför den vertikala masken.
- Skruva den cylindriska linshållaren på ett inlägg. Dra åt tjänst till en befattningshavare. Försiktigt placera C1 i linshållaren och dra åt skruvarna för att fixa det på plats.
- Montera två iris, såsom beskrivs i 1.5.1. Innan du placerar C1 i strålgången, infoga en iris före och en iris efter önskat S1 läge (600 mm framför den vertikala masken). Justera höjden på iris så att strålen passerar rent genom dem båda.
- Plats C1 600 mm framför den vertikala masken (Figur 1). Justera noggrant höjd, lutning och sidoläge C1 tillsbåda, återreflektion bort från linsen och ut kommande strålen är centrerad på iris. Dra åt befattningshavare håll C1 på den optiska tabell med tabell klämmor.
- Mount VIPA1 i fokalplan cylindrisk lins (200 mm framför C1).
- Montera VIPA hållare på ett inlägg med skruven som medföljer hållaren. Dra åt tjänst till en befattningshavare. Dra åt stolpen hållare på en vertikal translationssteg. (Figur 1)
- Placera VIPA1 försiktigt i VIPA hållaren med ingångsslitsen orienterad horisontellt. (Figur 1)
- Finjustera positionen för VIPA montera placera VIPA1 exakt fokalplan C1. (Kontrollera genom att spåra strålmidja med ett vitt kort.)
- Använd skruvarna för att dra den vertikala translations scenen på den optiska bordet och skjut VIPA1 ur strålen med hjälp av graden av frihet translationell scenen.
- Montera och justeracylindrisk lins C2 (f = 200 mm) 200 mm efter VIPA1 och 200 mm framför den vertikala masken, efter det förfarande som beskrivs i 3.3.1-3.3.3. I stället för att fästa stolpen hållare på den optiska bordet, montera den på en translationell stadium med dess frihetsgrad orienterad längs den optiska axeln. (Figur 1) Använd skruvarna för att dra åt translationell scenen på den optiska bordet.
- Använd översättningsstadiet (3.4.4) att skjuta VIPA1 inträde i strålgången. Följ horisontella linjer på kamerabilden.
- Finjustera C2 använder translationell scenen monterade i 3,5 tills de horisontella linjerna på kamerabilden skarpa.
- Justera spektrum med vertikal lutning grad av frihet på VIPA hållaren och translationell scenen. Använd vertikal translation grad av frihet att ställa ingången läget för strålen i etalonen. Använd den lodräta-luta frihetsgrad att avstämma ingångsvinkeln för strålen in i etalpå.
- Mät finess och genomströmning.
- Följ stegen 2.7.1 -2.7.2 att generera en linjediagram vertikalt över en bild av kameraskärmen.
- Använd linjediagram för att mäta finess genom att dividera avståndet mellan två horisontella linjer genom sin halvvärdesbredd (FWHM). Sikta på> 40.
- Mät genomströmning genom att mäta kraften med en effektmätare omedelbart före och efter VIPA1. Sikta på> 30%.
- Ställ den vertikala ingångsvinkeln för strålen i etalonen med vertikal lutning grad av frihet på VIPA hållaren (3.7). Observera avvägningen mellan finess och genomströmning.
- Om finess och genomströmning är inte tillfredsställande gå tillbaka och fina justera inriktningen. Se till VIPA1 är i fokalplanet C1. Upprepa steg 3.4.3-3.8.
4. Kombination av de två stegen och Final Alignment
- Glida i VIPA2. Observera horisontellt och vertikalt åtskilda punkter. Dessa punkter enre spektrala undertecknandet av enda frekvens laser. Justera translationella stadier av VIPAs tills punkterna är i skarpt fokus.
- Mät finess och genomströmning av spektrometern.
- Följ steg 2.7.1.-2.7.2 för att generera en linjediagram diagonalt över två laserpunkter.
- Använd linjediagram för att mäta finess genom att dividera det diagonala avståndet mellan två punkter av deras halvvärdesbredd (FWHM). Sikta på> 30.
- Bygg en svart låda för att innesluta spektrometern.
- Använd konstruktionsskenor för att bygga lådan skelett, som måste omfatta hela spektrometern från fiber kollimator till CCD-kameran (63 tum x 9 tum x 15 tum).
- Täck lådan skelett med Blackout tyg och tejpa fast den i hörnen. Se till att masker och de VIPAs är lätt åtkomliga.
- Anslut fibern till en standard optisk sond, såsom en reflektans konfokalmikroskop 4. Standard optisk pkläder som används för att samla upp spridda ljuset kommer att bära en Brillouin signal.
5. Mätning av Brillouin Shift
- Stäng både vertikala och horisontella masker tills lasers signaturen försvinner. Flytta stegen översättnings därefter.
- Aktivera förstärkningen och öka integrationstiden för kameran så mycket som möjligt utan att mätta EMCCD kameran.
- Observera Brilloiun förskjutning av ett prov.
- Placera ett prov i fokus för en konfokalmikroskop (eller annan optisk sond). Den rumsliga upplösningen kommer att bero på objektivlinsen som används i det konfokala mikroskopet. Använd en plastskål eller en kyvett för vätskor. Använd Metanol för den första mätningen.
- För att optimera spektrometern genomströmning, öppna en mask åt gången och skanna igenom spektrometern order genom att luta VIPA och justera sin översättningsstadiet. Hitta den ordning i vilken signalen visas den starkaste. Stäng mask igen förrän the lasersignalen försvinner. Upprepa med den andra masken och VIPA (beskrivs i 2.6 och 3.7).
- Ta en mätning av provet.
- Ta en bild av spektrumet efter steg 2.7.1.
- Skaffa kalibreringsmätningar genom att ta en bild av det spektrum av vatten och glas (eller annat prov med känd Brillouin skift). Spara bilden genom att klicka på "file" i övre vänstra hörnet och välja alternativet "spara som". Spara bilden i ".sif" format om dataanalysen utförs i kamerans mjukvara. Spara bilden i ".tif" format om dataanalys utförs i ett annat beräknings program.
6. Kalibrering och analys av Brillouin Spectrum
- Bestäm den fria spektralområdet (FSR) och EMCCD pixel till optiskt frekvensomvandlande förhållande (PR) i Brillouin-spektrometer.
- Ladda data i kamerans mjukvara eller annan computationella program.
- Följ steg 2.7.2 för att generera en linjediagram över hela spektrumet av vattenkalibreringsbild.
- Montera de två topparna av spektrumet med Lorentz kurvor för att fastställa toppositioner i form av pixelposition (P Vatten S, P Vatten AS). Alternativt utläses topposition manuellt genom att ta den högsta punkten av topparna.
- Upprepa steg 6.1.2-6.1.3 med spektret för glaskalibreringsbild.
- Alternativt till 6.1.1-6.1.4, lägga till både EMCCD ramar och passar alla fyra toppar på en gång. (Figur 2)
- Beräkna PR användning av ekvation 1. Koppla in värdena för P Vatten AS och P Glas som fastställs i 6.1.3 och 6.1.4. Ω Glas såsom är känt för att vara 29,3 GHz. I detta fall, eftersom den fria spektralområdet är bara 20 GHz kommer att visas alias med frekvensförskjutningen på 9,3 GHz. För enkelhetens skull använder 9,3 GHz för Ω Glass-AS. Använd 7,46 GHz för ΩVatten AS.
- Beräkna FSR användning av ekvation 2. Koppla in värdena för P Glas S, P Glass-AS och PR, beräknade i 6.16. Använd 9,3 GHz för Ω Glass-AS.
Figur 2. spektrometer kalibrering. (A) EMCCD kameraramen som erhålls från kalibreringsprov. (B) Lorentz kurvpassning (röd) till mätdata (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Bestäm Brillouin förskjutning avett prov.
- Följ steg 2.7.2 för att generera en linjesvep över hela spektrumet av provet.
- Montera de två topparna av spektrumet med Lorentz kurvor för att fastställa toppositioner i form av pixelläge. Alternativt utläses topposition manuellt genom att ta den högsta punkten av topparna.
- Använd följande ekvationer 4 och 5 och de tidigare beräknade värdena för FSR och PR för att beräkna Brillouin förskjutning av provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar representativa Brillouin spektra och deras passar för olika material. De VIPAs båda ha en tjocklek av 5 mm, vilket resulterar i en FSR av ungefär 20 GHz. Att integrationstiden för dessa mätningar var 100 ms. 100 mätningar gjordes och medelvärdet. En kalibrerings mätningen gjordes innan förvärva spektra.
Figur 3. Brillouin Spectra av olika material. Lorentzisk kurvpassning (röd) till mätdata (blå). (A) Brillouin spektrum av metanol. Den uppmätta Brillouin skift är 5,59 GHz. (B) Brillouin spektrum av etanol. Den uppmätta Brillouin skift är 5,85 GHz. (C) Brillouin spektrum av polystyren. Den uppmätta Brillouin skift är 14.12 GHz.ad / 53468 / 53468fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De erhållna Brilloiun skift överens med tidigare publicerade data 3,6,7. För att bestämma om anpassningen av spektrometern är optimal, kan många spektrala mätningar av samma material tas sekventiellt, och standardavvikelsen för topposition kan beräknas. Fig 4A visar ett tidsspår av 250 Brillouin mätningar av metanol tas i sekvens ; ett histogram över de utvärderade Brillouin skift visas i figur 4B. En väl i linje spektrometer med 5 mW av ljus vid provet och en integrationstid på 100 millisekunder kommer att ha en standardavvikelse σ ~ 10 MHz. Förändringar i Brillouin skifte inom hornhinnan och linsen vävnad har mätts vara i storleksordningen 1 GHz 9,10,11. Därför kommer Brillouin skift avläsningar med variabilitet ≤10 MHz möjliggöra mätning av relevantamekaniska variationer i vävnad.
Figur 4. Avvikelse i Brillouin skift över 250 metanol mätningar. (A) Tids spår av 250 Brilloiun mätningar av metanol. (B) Histogram av Brillouin skift avvikelse över 250 mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En viktig konstruktionsegenskap av denna spektrometer konfiguration är att de två stegen kan inriktas självständigt. När en VIPA etalon skjuts ut från den optiska vägen, de återstående linser av spektrometern steget bilda en 1: 1 avbildningssystem, så att den spektrala mönstret från varje steg avbildas på CCD-kameran. Därför är det enkelt att gå tillbaka till endera av stegen för att förbättra sina resultat utan att påverka inriktningen av den andra etappen. Uppsättningen translationella stadier och frihetsgrader som föreslås i protokollet följer denna filosofi att upprätthålla förmågan att självständigt optimera båda stegen i spektrometern.
Det är svårt att montera VIPA etalons sådan att lutningsfrihetsgraden roterar runt inmatningsfönstret axeln. Därefter, när de använder kommersiellt tillgängliga optomekaniska komponenter, luta etalonen oundvikligen introducerar en liten översättning av inmatningsfönstret. Den translation längs den optiska strålaxeln bör inte framkalla negativa effekter på grund av den stora Rayleigh området ingångslinsen (~ 3 mm). Å andra sidan, kan översättningen på axeln vinkelrätt mot balken förökning signifikant minska genomströmningen i spektrometern. Detta är anledningen till att translationell och lutningsfrihetsgrader på VIPA innehavaren måste drivas tillsammans för att maximera finess och genomströmningen. Det föreslås att starta inriktningsförfarandet med relativt hög lutningsvinkel (~ 3-5 grader) så att kopplings ljus i VIPA etalonen är nästan förlustfri. Eftersom anpassningen förbättras, kan lutningsvinkeln minskas för att förbättra finess. Optimeringen av finess och genomströmningen är en viktig del av inriktnings protokoll, särskilt för applikationer inom biologiska material där integrationstid och lasereffekten måste hållas så låg som möjligt.
I protokollet, har det föreslagits att extrahera Brillouin övergången från than analys av två spektraltoppar, nämligen Stokes och anti-Stokes toppar från två närliggande diffraktionsordningar. Detta är en inneboende stabilt förfarande som minimerar artefakter på grund av laserfrekvens drivor, eller förändringar etalon temperaturväxlingar. Dock kan mäta toppar med signifikant olika spektrala skift har nackdelar. I själva verket är den medföljande förfarandet för spektral kalibrering baserad på antagandet om konstant spektral spridning över spektrala mönstret. I själva verket ökar spektral dispersion i de lägre klasserna av diffraktion. Som ett resultat, regionerna av spektrumet som analyseras (dvs., Stokes och anti-Stokes toppar från två angränsande diffraktionsordningar) kan ha olika spektrala dispersioner. I detta fall kommer den spektrala kalibreringen skrivits här ger felaktiga Brillouin skift. Det föreslås att flera material med känd Brillouin skifte ska användas i den här situationen för att bygga en spektral kalibreringskurva med polynomanpassning. Detta är särskilt viktigt om det absoluta värdet av Brillouin skift måste jämföras snarare än den relativa förändringen av Brillouin-förskjutning mellan två villkor.
Typiskt, finess av fri-space etalons, inklusive VIPA beskrivs här, inte överträffa ~ 50. Som en följd av detta kommer det att finnas en kompromiss att överväga mellan hög spektral upplösning och fri spektralområdet. I detta protokoll ett fritt spektralområde 20 GHz föreslås för grön (532 nm) laseroperation eftersom de flesta biomaterial har Brilloiun förskjutningar av mindre än 10 GHz. Endast hälften av FSR är tillgänglig för Brillouin-analys på grund Stokes och anti-Stokes-frekvens skiftar större än halv FSR kommer att visas alias i spektrumet.
Om svårigheter uppstår i observera Brillouin signalen, är det viktigt att känna igen om de frågor som är relaterade till en överdriven mängd ströljus, eller ett lågt antal Brilloiun fotoner. Överdriven strö light bör elimineras effektivt. Se till att den svarta lådan inneslutningen är ljustätt. Utan prov, sätta på rummet ljus eller stänger av lasern bör inte nämnvärt förändra EMCCD kamerabakgrundsfotonräkning. För att eliminera laserljus reflekteras från provets yta, något luta provet, och starta observation med rumsliga masker stängda så mycket som möjligt utan att blockera signalen. Dessa två förfaranden gör det möjligt att öka integrationstiden för att möjliggöra observation av en mycket mörk Brillouin signal. Om det fortfarande finns det ingen signal, är det troligt att Brillouin signalen är för svag. Använd ett annat prov med stark Brillouin signal såsom Metanol, eller kontrollera anpassningen av uppsamlingsoptiken i konfokalmikroskop. Efter att framgångsrikt observera en signal, optimera den ytterligare genom att följa steg 5,4 beskrivs i protokollet.
Förlust av det infallande ljuset på grund av absorption eller spridning kommer att öka förvärvstiden rbligatoriskt för provanalys. Som ett resultat, de bästa resultaten erhålles vanligen i genomskinliga eller tunna material. En väl i linje spektrometer ska kunna få en hög fotonräkning (> 1000 på toppen) med 5 mW av ljus vid provet och 100 ms av integrationstiden för flytande material eller klar plast prover. Detta är betydligt snabbare än traditionella skanning spektrometrar. På grund av sin låga förvärvs tid och belysning makt, har en sådan spektrometer aktiveras med Brillouin-spektroskopi för in vivo imaging -Mekanisk 3,10,11,12. Med användning av denna typ av spektrometer har flera grupper visat en mängd olika tillämpningar, såsom mätning av de reologiska egenskaperna hos ögats lins 13, detektera bakteriell meningit i spinalvätska 4, och analysera hornhinnans elasticitetsmodulen 14.
Ytterligare förbättringar spektrometern väntas inom en snar framtid, särskilt om låga förluster ultra-smalt bandpassera och / eller notchfilter kan införlivas för att lätta på släckkraven på VIPA spektral dispersionen. Eftersom spektrometern kan användas i kombination med en mängd olika standard optiska sönder, exempelvis konfokala mikroskop 3,4,5, endoskop, och spaltlampa oftalmoskop kunde VIPA spektrometern vara en instrumental komponent i flera biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
