Summary
تكنولوجيا الميكروويف تمكن توليف سريع للغاية من جزيئات أكسيد الحديد لتوصيف تصلب الشرايين اللوحة. استخدام وسيلة aminobisphosphonate في الجانب الخارجي للجسيمات متناهية الصغر يوفر تراكم سريع في مجال تصلب الشرايين.
Abstract
وقد تم وضع بروتوكول سريع ومتكرر يحركها الميكروويف لتوليف النانوية functionalized neridronate. بدءا من توليف النانوية مسعور، ويستند أسلوب لدينا على التكيف من طريقة التحلل الحراري لتركيب الميكروويف مدفوعة. منهجية جديدة تنتج انخفاضا في أوقات رد الفعل في مقارنة مع الإجراءات التقليدية. وعلاوة على ذلك، واستخدام تكنولوجيا الميكروويف يزيد من استنساخ ردود الفعل، شيء مهم من وجهة نظر من التطبيقات السريرية. حداثة هذا جسيمات متناهية الصغر أكسيد الحديد هو مرفق من Neridronate. استخدام هذا الجزيء يؤدي شاردة البايفوسفونيت نحو الخارج من جسيمات متناهية الصغر التي توفر الكالسيوم 2+ العقارات في المختبر، وتراكم انتقائية ملزمة في الجسم الحي في اللوحة عصيدة. يسمح البروتوكول التوليف والكشف عن اللوحة في حوالي 3 ساعات منذ التوليف الأولي من ORGANIالسلائف ج. تراكمها في مجال تصلب الشرايين في أقل من 1 ساعة يوفر عامل تباين مناسبة بشكل خاص للتطبيقات السريرية.
Introduction
تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن متعدد العوامل من جدران الشرايين الناتجة عن التمثيل الغذائي للدهون حررت والاستجابة الالتهابية المعيبة. نظرا لانتشار والتكاليف الاقتصادية والاجتماعية لهذا وما يتصل بها من أمراض القلب والأوعية الدموية هناك اهتمام متزايد في معالجة أمراض بأدوات جديدة، منها تكنولوجيا النانو هو واحد من أكثر واعدة. 1-3 ولكن هناك أمثلة قليلة جدا سريع إنتاج وتوصيف تحقيقات الذي هو أساسي للترجمة إلى العيادة 4 في هذا البروتوكول واستخدام توليفة الميكروويف من جسيمات متناهية الصغر أكسيد الحديد لمزيد من functionalization مع البايفوسفونيت وفي الكشف فيفو تصلب الشرايين في APOE - / - الفئران في 1 ساعة 5 الحديد النانوية أكسيد (IONP) هي المواد متناهية الصغر المعروفة واستخدامه كعامل النقيض للالتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) أنشئت للكشف عن أمراض مختلفةالصورة في السنوات الماضية. 6-8
تركيب الموجات الدقيقة (MWS)، يسمح تجميع الجسيمات النانوية في أوقات قصيرة للغاية مع استنساخ عالية وعوائد محسنة. 9،10 في بروتوكول لدينا نحصل على IONP مع لوحة تستهدف القدرات في ثلاث خطوات. واحد الأخير هو مرفق من aminobisphosphonate، Neridronate، وهو أمر أساسي في استراتيجيتنا نظرا لخصائص ملزم الكالسيوم لها. بسبب من بيروفوسفات التماثلية الطبيعية (نقطة في البوصة)، وقد استخدمت Neridronate في علاج تكون العظم الناقص (OI) ومرض باجيت (PDB) لتقارب عالية تجاه المعادن في العظام. 11-13
وتتلخص الخطوات الثلاث للبروتوكول في مخطط تتم 1. خطوات واحد واثنين من استخدام تكنولوجيا الميكروويف. الخطوة الأولى توفر جزيئات أكسيد الحديد المغلفة حمض الأوليك (OA-IONP) من خلال تعديل طرق نشرها. 14 البروتوكول هو التكيف مع التوليف الميكروويف من traditIONAL التوليف الحراري التحلل. 15،16 مزيج يحتوي على الحديد (ACAC) 3، حمض الأوليك، oleylamine و1،2-dodecanediol يذوب في الكحول البنزيل وتعرض في عمليتين التدفئة. ويتم تنقية من غسل مع ETOH وجمع الجسيمات مع المغناطيس بدون تاريخ، الحديد ب للقضاء على الفائض السطحي في طاف. ثم، واستقرت OA-IONP في CHCl 3. وكما كان متوقعا، ويرجع ذلك إلى تسخين سريع جدا، وأظهرت النتائج المتوقعة التي النانوية توليفها من قبل الميكروويف هي أصغر من حيث الأساسية (3.7 ± 0.8 نانومتر) وحجم الهيدروديناميكية (7.5 نانومتر) بالمقارنة مع التحلل الحراري التقليدي. ومع ذلك، لا يزال النانوية عرضا التبلور ممتازة.
وتتألف الخطوة الثانية في التعديل الكيميائي المباشر من الرابطة المزدوجة، موجودة في حمض الأوليك، وذلك باستخدام أكسدة قوية مثل برمنجنات 4، ومنهجية الأصلية وضعت في تم تعديل مجموعتنا لشروط ميغاواط.17 أ المرحلة الأولى تشكل المجمعات بين MNO 4 - والرابطة المزدوجة. ثم، والمرحلة الثانية في الظروف الحمضية، وإنتاج الانقسام من جزيء حمض الأوليك إعطاء Azelaic حامضي-IONP. بعد هاتين المرحلتين من 9 دقيقة لكل منهما، وتنقية العينة، غسل الأولى مع NaHSO 3 1٪ للحد من الزيادة في MNO 4 - إلى MNO 2 ثم مع هيدروكسيد الصوديوم 1٪ لتحييد الحامض.
بعد خطوة التنقية، واستقرت Azelaic-IONP في 10 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة = 7.2. هذا المخزن المؤقت هو أفضل بيئة للاستقرار الغروية من الجزيئات على غرار ما حدث في رد الفعل الأصلي، الحراري. 18 استخدام الميكروويف لأكسدة مباشرة من الرابطة المزدوجة الواردة في OA-IONP هو مثال جيد جدا من المزايا استخدام هذه التكنولوجيا في تركيب الجسيمات النانوية. مع أسلوب الكلاسيكية رد فعل يأخذ 24 ساعة، والاستفادة من الميكروويف يقلل من reactiفي الوقت المحدد إلى 18 دقيقة. وعلاوة على ذلك، ويبين بروتوكول يحركها الميكروويف لاستنساخ ممتازة إعطاء النانوية مع 30 ± 5 نانومتر من حجم الهيدروديناميكية بعد 4 التكرار. وبصرف النظر عن التغير في حجم الهيدروديناميكية، وإمكانات زيتا معلمة جيدة للتحقق بسرعة ناجحة للتفاعل. بسبب وجود مجموعات الكربوكسيل جديدة في Azelaic-IONP، القيمة المحتملة زيتا حول -44 بالسيارات، تشبه الى حد بعيد القيمة التي حصلت عليها نهج الحراري.
لإلحاق neridronate إلى Azelaic-IONP، يتم استخدام التقليدي EDC / سلفو NHS الاقتران. 19 وراسخة هذا النهج الاصطناعية منذ توظيف والكربوكسيل تفعيلها مع سلفو NHS يضمن الاستقرار الغروية أثناء التفاعل. بعد القضاء على العازلة الفوسفات ويتم التفاعل مع neridronate في 1 العازلة HEPES ملم (الرقم الهيدروجيني ~ 7). رد فعل يجعل Neridronate-IONP مع حجم الهيدروديناميكية 40 ± 4 نانومتر في حجم تنقيب الضيقibution و-24.1 بالسيارات من زيتا الإمكانات.
ووصف الإجراء لتخليق سريع من IONP في الجسم الحي التصور وحة تصلب الشرايين على الرغم من أن جدوى الأسلوب يسمح للمرفق من أي الببتيد / الأجسام المضادة مع الأمينات الحر، وذلك باستخدام نفس الظروف، لأغراض مختلفة داخل T 2 وكيل -weighted النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي حقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- إعداد 1 ملم HEPES العازلة بحل 23.8 ملغ من HEPES في 100 مل من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.
- إعداد 10٪ NaHSO 3 تذويب 10 غراما من NaHSO 3 في 100 مل من الماء المقطر. يحرك الخليط لمدة 15 دقيقة.
- تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم حل 1 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 100 مل من الماء. يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة.
- إعداد 10 ملي العازلة الفوسفات حل 600 ملغ من ناه 2 ص 4 في 1 لتر من الماء. إضافة بعناية 0.34 مل من حمض الفوسفوريك ويحرك المزيج لمدة 30 دقيقة. ضبط درجة الحموضة إلى 2.9 (قبول مجموعة 2،7-3،0).
- إعداد 10 ملي العازلة الفوسفات حل 269 ملغ من ناه 2 ص 4 و 1.09 غرام من نا 2 هبو 4 إلى الماء المقطر لجعل حجم 1 L. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2.
2. تخليق حمض الأوليك المغلفة النانوية (OA-IONP)
- في الميكروويف قارورة تكييفها إضافة 0.5 غرام من الحديد (ACAC) 3، 1.4 مل من OLEIحمض ج، 0.6 مل من oleylamine و1.19 غرام من 1،2-hexadodecanediol. إضافة 10 مل من الأثير فينيل بعناية من خلال جدار القارورة باستخدام ماصة تخرج.
- إدخال القارورة في مفاعل الميكروويف وبدء بروتوكول الميكروويف.
ملاحظة: البرنامج ميكروويف يمكن اختيار حجم لمعايير مختلفة مثل درجة الحرارة والضغط وسرعة اثارة وقوة وفترة رد الفعل. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه إمكانية لتحميل ثلاث مراحل مختلفة في نفس بروتوكول يسمح التوليف الانضباطي. بمجرد أن يبدأ بروتوكول الاصطناعية تحميل، الميكروويف تسخن العينة بأسرع وقت ممكن (التعلية العملية) ويحافظ عليه خلال فترة رد الفعل المختار (عملية التشغيل). انتخاب السلطة يحدد وقت التعلية. - تحميل دراسة ديناميكية في الميكروويف. ويتضمن البروتوكول ثلاث مراحل:
- المرحلة 1: تعيين درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية، الساعة 2 دقيقة، وضغط 250 رطل و 150 W السلطة. سرعة ضجة يجب أن تكون في مرتبة عالية وأقصى القوة في يوم.
- ظبيه 2: تعيين درجة الحرارة إلى 200 درجة مئوية، والوقت 20 دقيقة، وضغط 250 رطل و 300 W السلطة. سرعة ضجة يجب أن تكون في مرتبة عالية وأقصى القوة في يوم.
- المرحلة 3: تعيين درجة الحرارة إلى 250 درجة مئوية، والوقت 10 دقيقة، وضغط 250 رطل و 300 W السلطة. سرعة ضجة يجب أن تكون في مرتبة عالية وأقصى القوة في يوم.
- بعد الانتهاء من البروتوكول، والسماح للقارورة لتبرد في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن أن يتم التبريد أسفل العملية مع أو بدون تيار الغاز. توفر كلتا الحالتين نفس النتائج. تظهر المجاميع في بقضيب وفي جدار القارورة، أغسلها مع ETOH ووضعها على مخروطي. - نقل خليط التفاعل إلى مخروطي باستخدام ماصة الزجاج، وإضافة 10 مل من ETOH 98٪. وضع المغناطيس بدون تاريخ-NB-B أدناه القارورة، وانتظر 5 دقائق وإزالة طاف مع ماصة الزجاج.
- إضافة 10 مل من ETOH، يصوتن العينة في RT لمدة 2 دقيقة و 40 كيلو هرتز، ووضع العينة على المغناطيس والقضاء طاف. كرر هذه الخطوة في ياسر ثلاث مرات.
- تفريق النانوية الأوليك في 30 مل من CHCl 3 ويصوتن في 40 كيلو هرتز لمدة 5 دقائق على RT. التحقق من حجم الهيدروديناميكية في zetasizer حسب تعليمات الشركة الصانعة. ضع 0.5 مل من OA-IONP في كفيت والزجاج، وإضافة 0.5 مل من CHCl 3. مجموعة قبول أعرب 7-10 نانومتر كما زي متوسط الحجم في شدة.
ملاحظة: OA-IONP يمكن أن يكون فرقت جيدا في الهكسان.
3. توليف Azelaic حامضي النانوية (Azelaic حامضي-IONP)
- حل 44.3 ملغ من برمنجنات 4 و 150.4 ملغ من BTACl في خليط من H 2 O: CHCl 3 (3: 2 مل). إضافة محلول الناتجة إلى قسامة 5 مل من OA-IONP في الميكروويف تكييف قارورة.
- بدء تشغيل بروتوكول الميكروويف لمدة Azelaic حامضي-IONP. ضبط درجة الحرارة عند 105 درجة مئوية، الساعة 9 دقائق، ضغط 250 رطل والسلطة في 300 دبليو ضع 10 مل من درجة الحموضة عازلة الفوسفات = 2.9 في قارورة وكرر بروتوكول الميكروويف. بعد التبريد خطوة، واستعادة النانويةباستخدام مغناطيس والقضاء طاف.
- إضافة 5 مل من 10٪ NaHSO 3 إلى دورق مخروطي، يصوتن في 40 كيلو هرتز لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية، وجمع الجزيئات باستخدام مغناطيس والقضاء طاف. (الخطوة يتكرر 2 مرات.) غسل النانوية ثلاث مرات مع 1٪ هيدروكسيد الصوديوم وأخيرا إعادة تفريق في 5 مل من درجة الحموضة عازلة الفوسفات = 7.2.
- التحقق من حجم الهيدروديناميكية وإمكانات زيتا. ضع 0.7 مل من Azelaic-IONP في الخلية الشعرية مطوية يمكن التخلص منها وأدخله على zetasizer.
ملاحظة: النطاق القبول لحجم 25-35 نانومتر كما أعرب عن زي متوسط الحجم في شدة. مجموعة القبول ل-Z المحتملين -45 ± 5 بالسيارات. النانوية أكبر (~ 70 نانومتر) يمكن الحصول عليها مع الفوسفات درجة الحموضة عازلة> 7 بدلا من الرقم الهيدروجيني = 2.9 (المرجع علم يورو J 2008).
4. توليف Neridronate النانوية (Neridronate-IONP)
- إضافة 12 ملغ من EDC و 15 ملغ من سلفو NHS في أجهزة الطرد المركزي مع 2 مل قسامة من Azelaic-IONP. ضعالخليط في دوامة في RT لمدة 35 دقيقة.
- وضع المغناطيس أقل من أجهزة الطرد المركزي لزعزعة استقرار الجسيمات النانوية، ونضح طاف ويغسل الجسيمات مع 1.5 مل من HEPES 1 ملم درجة الحموضة = 7 العازلة. (كرر هذه الخطوة مرتين.) بعد ذلك، إضافة 5 ملغ من neridronate ويهز الخليط في دوامة لمدة 2 ساعة.
- النانوية منفصلة مع المغناطيس وغسل (3 × 2 مل) مع 1 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني = 7 العازلة. وأخيرا، تفريق Neridronate-IONP في 2 مل من 1MM HEPES العازلة الرقم الهيدروجيني = 7.
- التحقق من حجم الهيدروديناميكية وإمكانات زيتا. ضع 0.7 مل من Neridronate-IONP في الخلية الشعرية مطوية يمكن التخلص منها وأدخله على zetasizer (انظر إعداد المعدات).
ملاحظة: النطاق القبول لحجم 40-45 نانومتر كما أعرب عن زي متوسط الحجم في شدة. مجموعة القبول ل-Z المحتملين -20 ± 5 بالسيارات.
5. في الكشف فيفو من عصيدة اللوحة في APOE - / - الفئران بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي
- التحضير للتصوير بالرنين المغناطيسي اكتساب
ملاحظة: العديد من السابقهناك حاجة إلى أنظمة هيئة تنظيم الاتصالات لإجراء التجارب على الحيوانات. وهكذا، وسوف تتطلب ما يلي:- استخدام المعدات المناسبة لتخدير الحيوانات.
- الحصول على نظام وثيق-تعميم دائرة ماء دافئ مع جو دافئ الخارجي للحفاظ على درجة حرارة ثابتة الحيوانية.
ملاحظة: في هذه الحالة متوافق نظام للرصد والنابضة التصوير بالرنين المغناطيسي يسجل درجة حرارة الحيوان داخل المغناطيس التصوير بالرنين المغناطيسي. - رصد درجات الحرارة الخارجية في القرب من الحيوان، ودرجة حرارة الجسم (ترمومتر المستقيم) للحيوان، واستشعار التنفس تقع تحت جسم الحيوان بالقرب من القفص الصدري باستخدام واجهة متكاملة في وحدة التصوير بالرنين المغناطيسي.
- تجربة التصوير بالرنين المغناطيسي
- تخدير الحيوانات مع isoflurane المتبخرة (2٪ لتحريض خلال دقيقتين أو ثلاث دقائق و1-1.5٪ للصيانة خلال التجربة MRI) مع خط الأكسجين 100٪.
- وضع الحيوان في وسط المغناطيس مع مساعدة من الاستحواذ الشخصي.
- بعد الخطوة 5.2.2، وضبط لفائف RF إلى 300 ميغاهيرتز (7 T) تردد صدى، وتتناسب مع خاصية مقاومة من لفائف الى 50 أوم لاستقبال إشارة الأمثل.
ملاحظة: انتبه إلى الأسلاك الخارجية والاتصالات الذهاب الى نظام القياس عن طريق محول / التقسيم إلى كل جزء من لفائف الارسال بشكل فردي (في حالتنا كان لفائف التربيع). - بعد ضبط ومطابقة لفائف، والمكونات لفائف في الماسح الضوئي.
- لRF معايرة النبض (الشكل والطول) وتعديل التردد المركزي تنفيذ كل معايرة النبض ووسط تردد يدويا. إجراء تعديلات 90 ° معايرة النبض، الملئ الخشنة (أنظر أدناه)، وتواتر مركز وكسب المتلقي يدويا.
- أداء الموضع الدقيق باستخدام صدى التدرج (FLASH أو GRE) مسح كالايزر (3 طائرة الكشفية الاستحواذ: محوري، الاكليلية والسهمي، وتسمى أيضا tripilot.
- أداء الملئ المغناطيس لتحسين تجانس الحقل المغناطيسي في CENثالثا من المغناطيس. تنفيذ هذه الخطوة يدويا (انظر 5.2.3) باستخدام تسلسل ااا واحدة أو واحد نبض وضبط الأولى والثانية أوامر الحشوات أو أي تسلسل الملئ التلقائي المدرجة في النظام
ملاحظة: يتم إدراج الحقل المغناطيسي shimmed جيدا بسهولة عن طريق قياس T2 * (كما أكبر كلما كان ذلك أفضل) أو FWHM الضيق للالأطياف.
- التصوير بالرنين المغناطيسي الحصول على البيانات من 5 اللوحة
- ضخ 100 ميكرولتر (1 ملغ [الحديد] مل -1) النانوية neridronate عن طريق الوريد إلى الوريد الذيل والحصول على صور 1 ساعة حقن آخر. تحميل المعلمات للتصوير بالرنين المغناطيسي اكتساب وحة تصلب الشرايين النظر في الشريان الأورطي البطني (التشعب الكلوي).
- وضع متعددة شريحة، 10-20 شرائح في وضع تعشيق للحد من القطع الأثرية.
- الحصول عالية الدقة تدور بسرعة صدى التصوير بالرنين المغناطيسي في عرض الاكليلية أو محوري مع المعلمات التالية المرجحة T1: فوف 60 × 30 ملم (الاكليلية)، 30 × 30 ملم (المحوري)، شريحة سمك 0.8 ملم (مع التدرج صغير لفائف التعاونnfiguration هذا يمكن تخفيضها إلى 0.6 مم)، 400 TR ميللي ثانية، 8 ميللي ثانية TE، 256 × 256 اقتناء ومصفوفة إعادة الإعمار البيانات، 6 (التدرج كبير) إلى متوسطات 8 (التدرج الصغير) إشارة لمدة 5-8 دقيقة متوسط مدة التحصيل.
ملاحظة: TE أمر بالغ الأهمية وخاصة وجود إشارة تدفق الدم ووالتحف التحول الكيميائية التي يمكن أن تحد من التطبيقات. في هذه الحالات تتدفق حساسة تدور بسرعة صدى T2-IR يمكن أن يساعد على الحد من القطع الأثرية والحصول على البيانات التكميلية في نفس المكان المحدد يمكن أن تساعد على تميز هذه اللوحة. بالإضافة إلى ذلك، نبض presaturation يمكن استخدامها لتقليل الأنسجة الدهنية المحيطة جدران الشرايين لترسيم أفضل من الحدود الخارجية للجدار والتحول الكيميائي للحد من القطع الأثرية. - نقل الصور باستخدام شكل موحد مثل ديكوم وعرض في البرنامج المناسب (على سبيل المثال سيريكس التصوير البرمجيات أو أميد: التصوير الطبي ممتحن البيانات) 5. قياس تأثير تباين ترسيم فيس يدويامنطقة قانون حالة الطوارئ، وسمك الجدار، منطقة التجويف وعبء البلاك 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، وصفت تركيب ثلاثة IONP مختلفة. بدءا من مسعور OA-IONP، ويتم الحصول على الجسيمات النانوية مستقرة المائية بمساعدة من التوليف يحركها الميكروويف. كل الجسيمات النانوية عرض حجم الهيدروديناميكية الصغيرة جدا (درهم <50 نانومتر) في توزيع حجم الضيق جدا (الشكل 1C). استخدام تكنولوجيا الميكروويف يجعل الجسيمات النانوية الصغيرة جدا من حيث الأحجام الأساسية. منذ الميكروويف إنتاج التدفئة بسرعة، فإن معدل الزيادة التنوي بالمقارنة مع المنهجيات الآخرين إعطاء أصغر حجما في جوهر النانوية. ومع ذلك، فإن الجزيئات لا تزال تشكل التبلور ممتاز كما هو مبين في الصور تيم حيث هامش شعرية على النوى الحديد 3 O 4 يمكن رؤيتها بوضوح (الشكل 1A، ب). الجانب المهم الآخر من الأسلوب هو استنساخ. بعد أربعة تكرار تركيب Azelaic حامضي-IONP، نفس النتائجفي حجم الهيدروديناميكية والتوزيع تم الحصول عليها (1D الشكل).
بعد functionalization، كا 2+ خصائص بسبب البايفوسفونيت الحالية في الجسيمات النانوية neridronate ملزم تم فحص احتضان هذه الجسيمات النانوية مع كميات مختلفة من الكالسيوم 2+. فقد تبين أن الزيادات T 2 وقت الاسترخاء خطيا مع كمية من الكالسيوم 2+ والوقت من الحضانة ويرجع ذلك إلى تشكيل مجموعات من جسيمات متناهية الصغر في حين النانوية دون الكالسيوم 2+ ظلت مستقرة (الشكل 1E)، مطابقة لدينا فرضية أولية.
في التجارب المجراة التصوير بالرنين المغناطيسي وأجريت في 48 أسبوعا APOE القديم - / - الفئران. أخذت لأول مرة السباتية والبطن الصور القاعدية الشريان الأورطي. الآفة بسبب تشكيل وحة تصلب الشرايين يمكن رؤيتها بوضوح. ثم، 100 ميكرولتر (1 ملغ [الحديد] مل -1 (الشكل 2) (1)، آخر ساعة حقن إشارة تشكل اللوحة هي hypointense بالمقارنة إلى الصور القاعدية. اختيار اثنين من رويس (منطقة الفائدة) يسمح الكمي للإشارة كثافة في منطقة الآفة للمقارنة بين القاعدية و1 ساعة الصور حقن آخر. اللوحة إلى نسبة العضلات تختلف اختلافا كبيرا بينهما (ع <0.05، الشكل 2B).
وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد إشارة في الكبد في الفئران بعد حقن 100 ميكرولتر من النانوية neridronate لتقييم ما إذا كان الحد من كثافة يرجع إلى وقت الدورة الدموية في الدم وليس عن طريق تراكم انتقائية. كما يظهر في الرسم البياني (الشكل 2C)، تم تطهير النانوية تماما من التداول بعد 20 دقيقة تؤكد تراكم انتقائيةمن neridronate النانوية نحو وحة تصلب الشرايين. أجريت التصوير النهائي خارج الجسم والأنسجة. تمت التضحية الفئران وaortas استخراج. وأظهر تصوير aortas مع وبدون النانوية الاختلافات في إشارة بالاتفاق مع التجارب المجراة في (الشكل 2D).
مخطط 1: اتبعت الخطوات الاصطناعية في البروتوكول وتوصيف الأساسي في كل نقطة من دائرة الأراضي والمساحة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 1: شاراcterization النانوية (أ) وصور تيم، في اثنين من تكبير، لOA-IONP؛ (ب) وصور تيم، في اثنين من تكبير، لNeridronate-IONP. (ج) حجم الهيدروديناميكية للجسيمات الدقيقة OA-IONP، Azelaic حامضي-IONP وNeridronate-IONP. (د) حجم الهيدروديناميكية لAzelaic حامضي-IONP في أربعة التوليف مختلفة و (ه) تطور تي وقت 2 الاسترخاء في حل من Neridronate-IONP بوصفها وظيفة من الوقت وتركيز الكالسيوم (المرجع بروتوكول تيم: نيست - NCL بروتوكول الفحص المشتركة ، PCC-X، قياس حجم الجسيمات النانوية عن طريق نقل المجهر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات التصوير بالرنين المغناطيسيلوحة (أ) في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي من APOE - / - الماوس قبل (أعلى) وبعد ساعة من الحقن الرابع من Neridronate-IONP (القاع)؛ (ب) لوحة لعضلة كثافة إشارة النسبية قبل (القاعدية) وساعة واحدة بعد حقن الرابع من Neridronate-IONP. (ج) الكبد على العضلات شدة إشارة النسبية في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن Neridronate-IONP و (د) المجراة سابقا صور من الشريان الأورطي لاثنين من الفئران، مع وبدون حقن النانوية 5. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحديد النانوية أكسيد (IONP) هي واحدة من أهم المواد النانوية وقد تم استخدامها لمختلف التطبيقات من قبل وقت طويل. استخدام هذه المواد وكيل النقيض للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هو حقل راسخة. ومع ذلك، فإن طرق تركيب وعادة ما تستغرق عدة مرات ووضع معقد. بسبب الحد بشكل كبير من أوقات رد الفعل ويعزز استنساخ استخدام التوليف يحركها الميكروويف يبدو أن يكون بديلا جيدا لإنتاج الجسيمات النانوية ذات جودة عالية. في بروتوكول المذكورة أعلاه، وقد تم استخدام تكنولوجيا الميكروويف لتركيب اثنين من الجسيمات النانوية مختلفة. الميكروويف تسمح لصقل المعلمات الرئيسية التي يمكن أن تؤثر على الخصائص النهائية للجسيمات. من المهم أن نلاحظ أن الخصائص الفيزيائية للجسيمات النانو ستتغير إذا تم تغيير أي من الشروط المذكورة. منذ تستخدم بعض المواد الكيميائية في الإجراء الاصطناعية، وpurificatioن خطوات حاسمة لحصول الجسيمات النانوية ذات جودة عالية.
في OA-IONP يزيد من توتر السطحي تستخدم من أجل الحصول على ما يكفي من الاستقرار في النانوية. بعد التوليف، ثلاث خطوات تنقية إلزامية لحذفها. لتركيب Azelaic حامضي-IONP، يطلب من مرحلتين الميكروويف مختلفة. في المرحلة الثانية، والحجم النهائي للجزيئات يمكن ضبطها من IONP الصغيرة جدا (D ح <50 نانومتر) باستخدام الرقم الهيدروجيني = 2.9 إلى أكبر حجم الهيدروديناميكية (D ح> 50 نانومتر) باستخدام الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية. في تنقية Azelaic حامضي-IONP، كمية من هيدروكسيد الصوديوم المستخدم هو ضروري. كمية كافية من هيدروكسيد الصوديوم يجب أن تضاف إلى استقرار الجسيمات النانوية، ولكن الكثير من هيدروكسيد الصوديوم يمكن يلتفظ السطحي من الجسيمات النانوية تقديم مادة غير مستقرة.
عادة، IONP تملك الوقت تداول قصيرة في الدم والتي هي واحدة من أهم عيوب. لاستخدامها كعامل النقيض من ذلك، تحتاج إلى النانوية CIRculate ما يكفي من الوقت في الدم للوصول إلى المنطقة المرغوبة. لزيادة وقت التداول في الدم تتم كلاسيكي المناهج المختلفة بها. وتقوم هذه الاستراتيجيات أساسا على المرفق من شاردة مضاد للفيروسات هذا الحد الوقت تداول جسيمات متناهية الصغر. ومع ذلك، في حالة Neridronate-IONP، يتم إنتاج تراكم سريع جدا. استخدام وسيلة aminobisphosphonate كما جزيء حيوي على الجسيمات النانوية لاستهداف عصيدة اللوحة هو مفهوم جديد يستند إلى قدرات الكالسيوم من هذه الأنواع من المركبات. تراكمه في منطقة الآفة في أقل من ساعة يدل على قابلية عالية للNeridronate-IONP نحو الكالسيوم الموجود في لوحة عصيدة.
لرؤية لوحة عصيدة، وعادة ما يستخدم العديد من تقنيات التصوير المتقدمة. من بينها، التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي هي أكثر التقنيات موحدة. يوفر PET على أفضل النتائج من حيث المعلومات الوظيفية نظرا لحساسية عالية والتصوير بالرنين المغناطيسي أفضل النتائج في المعلومات التشريحية نظرا لارتفاع القرار. على الرغم من أن الحيوانات الأليفة يمكن أن يكون الخيار المثالي لمتابعة التحقيق الاصطناعية، وحل هذه التقنية في الحيوانات الصغيرة (~ 1 مم) يقيد استخدامه لتصور تكلسات صغيرة في آفات تصلب الشرايين. التصوير بالرنين المغناطيسي هو البديل المثالي توفير أفضل قرار (~ 0.1 ميكرومتر). حساسية أقل من هذه التقنية لا يتجنب التصور للعامل تباين في المنطقة الفائدة وأفضل قرار يسمح بتحديد تكلسات صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فقد بينت النتائج أن الجمع بين تراكم سريع فريد من Neridronate-IONP مع ارتفاع القرار من التصوير بالرنين المغناطيسي هو السيناريو المثالي للكشف عن لوحة عصيدة في الحيوانات الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 | CEM Corporation, USA | Any microwave for chemical synthesis can be used | |
| Disposable PD-10 desalting columns | GE Healthcare life sciences | 17-0851-01 | Any size exclusion column will work |
| Amicon®Ultra-0.5 ml | Merck Millipore Ltd | ||
| Calibrated pH meter | SI analytics | 285105127 | |
| Neodymium magnet | Aiman Gz | ND010B | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| ZetaSizer Nano ZS | Malvern Instruments | ||
| Standard (macro) cell Optical glass | Labbox | 11718 | |
| Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 | Malvern | ||
| Bruker Minispec mq60 | Bruker |
References
- Patel, D. N., Bailey, S. R.
- Zhao, X., Zhao, H., Chen, Z., Lan, M. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging contrast agent. J. Nanosci. Nanotechnol. 14, 210-220 (2014).
- Lee, D. E., et al. Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis. Chem. Soc. Rev. 41, 2656 (2012).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, (2012).
- Pellico, J., et al. Microwave-driven synthesis of bisphosphonate nanoparticles allows in vivo visualisation of atherosclerotic plaque. RSC Adv. 5, 1661-1665 (2015).
- Lin, M. M., Kim, D. K., El Haj, A. J., Dobson, J. Development of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONS) for translation to clinical applications. IEEE Trans. Nanobioscience. 7, 298-305 (2008).
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Liu, F., Laurent, S., Fattahi, H., Vander Elst, L., Muller, R. N. Superparamagnetic nanosystems based on iron oxide nanoparticles for biomedical imaging. Nanomed. 6, 519-528 (2011).
- Carenza, E., et al. Rapid synthesis of water-dispersible superparamagnetic iron oxide nanoparticles by a microwave-assisted route for safe labeling of endothelial progenitor cells. Acta Biomater. 10, 3775-3785 (2014).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, 215602 (2012).
- Gatti, D., Rossini, M., Viapiana, O., Idolazzi, L., Adami, S. Clinical development of neridronate: potential for new applications. Ther. Clin. Risk Manag. 9, 139-147 (2013).
- Drake, M. T., Clarke, B. L., Khosla, S. Bisphosphonates: mechanism of action and role in clinical practice. Mayo Clin Proc. 83, 1032-1045 (2008).
- Devogelaer, J. P. Treatment of bone diseases with bisphosphonates, excluding osteoporosis. Curr. Opin. Rheumatol. 12, 331-335 (2000).
- Pascu, O., et al. Surface Reactivity of Iron Oxide Nanoparticles by Microwave-Assisted Synthesis; Comparison with the Thermal Decomposition Route. J. Phys. Chem. C. 116, 15108-15116 (2012).
- Sun, S., Zeng, H.
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of highly crystalline and monodisperse maghemite nanocrystallites without a size-selection process. J. Am. Chem. Soc. 123, 12798-12801 (2001).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Vilar, R., Ruiz-Cabello, J. A new method for the aqueous functionalization of superparamagnetic Fe 2 O 3 nanoparticles. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 215-222 (2008).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Desco, M., Ruiz-Cabello, J. A new method for the rapid synthesis of water stable superparamagnetic nanoparticles. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 14, 9126-9130 (2008).
- Herranz, F., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles conjugated to a grass pollen allergen and an optical probe. Contrast Media Mol. Imaging. 7, 435-439 (2012).
