Summary
微波技术使动脉粥样硬化斑块特征的氧化铁纳米颗粒极快的合成。在所述纳米颗粒的外部侧使用氨基二膦酸的提供了在动脉粥样硬化区快速积累。
Abstract
一种快速和可重复的微波驱动的协议已被开发用于奈立膦官能纳米粒子的合成。从疏水性纳米粒子的合成开始，我们的方法是基于从热分解法对微波驱动合成的适应。的新方法产生的反应时间与传统的程序相比的降低。此外，使用微波技术的提高了反应的再现性，一些从视图的临床应用的点重要。这种铁氧化物纳米颗粒的新颖性是奈立膦酸盐的附着。使用这种分子的引线朝提供钙在动脉粥样硬化斑块结合在体外和选择性积累特性体内纳米粒子的外侧的二膦酸盐部分。该协议允许在大约3小时的合成和斑块的检测，因为从organi最初的合成Ç前体。其在动脉粥样硬化区积累在不到1小时提供了对比剂特别适合于临床应用。
Introduction
动脉粥样硬化是动脉壁从失调的脂质代谢和有缺陷的炎症反应所得的一种多因素慢性炎性疾病。由于患病和这个和有关的心血管疾病的经济和社会成本有在处理新的工具，其中纳米是最有前途的之一的病理学越来越感兴趣。1-3然而有快速例子非常少生产和探针表征这是基本的翻译到诊所4在这个协议中，我们使用的氧化铁纳米颗粒的微波合成用于进一步官能化与双膦酸酯，并在对ApoE动脉粥样硬化的体内检测- / -小鼠在1小时5氧化铁纳米颗粒（IONP）是一个公知的纳米材料及其作为造影剂用于磁共振成像（MRI）使用已建立用于检测不同疾病的■在过去几年6-8
微波合成（MWS），允许具有高重复性和增强的产量合成纳米粒子在极短的时间9,10在我们的协议，我们得到IONP斑块三步定位功能。最后一个是氨基二膦酸，奈立，这是由于它的钙结合性能是我们战略的关键附件。由于它们的天然类似物焦磷酸（PPI），奈立已在成骨不全（OI）和骨的佩吉特氏病（PDB），用于其向骨矿物高亲和力的用于治疗11-13
三个步骤的协议概括在方案1的步骤一和二中进行使用微波技术。第一步公布的方法的修改提供油酸涂酸氧化铁纳米颗粒（OA-IONP）14的协议是一个适应的tradit的微波合成有理热分解合成15,16含有的Fe（ACAC）混合物3，油酸，油胺和1,2-十二烷二醇溶解于苄醇，并在两个加热过程进行。纯化进行用EtOH洗涤，并用的Nd-Fe-B磁体中收集颗粒，以消除过量上清液中的表面活性剂的。然后，OA-IONP都在CHCl 3中稳定化。正如预期的那样，由于非常快速的加热，预期的结果表明，通过微波合成的纳米颗粒的核心（3.7±0.8 nm），而与传统的热分解比较流体力学尺寸（7.5纳米）的角度更小;然而，纳米颗粒仍呈现优良的结晶度。
第二步包括在双键，存在于油酸的直接化学修饰，使用类似的KMnO 4，开发中的基团被修改为MW条件原始方法一种强氧化剂。17第一阶段形成的MnO 4之间的复合物-和双键。然后，在酸性条件下的第二阶段，产生使壬酸IONP油酸分子的切割。的每9分钟这两个阶段后，将样品进行纯化，第一次洗涤用加入NaHSO 3 1％至过量的MnO 4的减少-到的MnO 2，然后用NaOH的1％，以中和酸。
在纯化步骤之后，壬-IONP都在10mM磷酸盐缓冲液pH = 7.2稳定。这个缓冲区是粒子类似原，热反应发生了什么事胶体稳定性的最佳环境。18载于OA-IONP双键的直接氧化利用微波是的优势很好的例子在纳米颗粒的合成采用这种技术。与反应需要24小时的经典方法，微波的利用率降低reacti时间到18分钟。此外，微波驱动的协议表现出优异的再现性后4重复给予纳米颗粒流体动力学大小为30±5纳米。除了在流体动力学大小的变化的，ζ电位是一个很好的参数来快速检查成功反应。由于壬-IONP新羧酸基团的存在，对于ζ电位的值大约是-44毫伏，非常类似于由热的方法得到的值。
对奈立的对壬-IONP该附件中，使用传统的EDC /硫代NHS缀合。19这种合成方法是行之有效的，因为使用的活化羧酸与磺基-NHS反应期间确保胶体稳定性。磷酸盐缓冲液的消除与奈立膦反应在1毫米的HEPES缓冲液中进行后（pH约7）。该反应使奈立-IONP具有40±4毫微米在窄大小颇的流体动力学大小ibution和zeta电位的-24.1 mV的。
该过程为用于动脉粥样硬化斑块的体内可视IONP的快速合成T2加权对比剂的MRI中描述尽管该方法的可行性允许与游离胺的任何肽/抗体的附接，使用相同的条件下，用于不同的目的领域。
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Protocol
1.试剂的制备
- 制备1mM的HEPES缓冲液中溶解23.8毫克HEPES在100毫升蒸馏水中。将pH调节至7。
- 制备10％的硫酸氢钠3将10g加入NaHSO 3在100毫升蒸馏水中。搅拌15分钟该混合物。
- 制备NaOH溶液中溶解1g氢氧化钠在100毫升水中。搅拌10分钟。
- 制备的10mM磷酸盐缓冲液在1升水中溶解600毫克的NaH 2 PO 4的。加入仔细0.34毫升磷酸，搅拌30分钟。调整pH值至2.9（可接受的范围2.7-3.0）。
- 制备的10mM磷酸盐缓冲液中溶解269毫克的NaH 2 PO 4的和1.09克Na 2 HPO 4的蒸馏水，使1升的体积调整pH值至7.2。
2.纳米涂层油酸合成（OA-IONP）
- 在微波适应瓶中加0.5克铁（ACAC）3，1.4 olei毫升C酸，0.6毫升油胺和1.19将1,2- hexadodecanediol的。用刻度吸量管加入10 mL苯基醚通过精心的瓶壁。
- 介绍在微波反应器中的烧瓶中，并启动微波协议。
注：微波软件使选择像温度，压力，搅拌速度，功率和反应时间不同的参数的大小。此外，它在相同的协议，允许调谐合成加载三个不同阶段的可能性。一旦装合成协议启动，微波炉加热快样本尽可能（斜坡过程中），在所选择的反应时间（运行进程）维护它。功率选举决定斜坡的时间。 - 装载在微波炉动态研究。该协议包含三个阶段：
- 第1阶段：将温度设定为60℃，时间2分钟，压力250psi的150瓦的功率。搅拌速度必须处于很高的位置，并在最大功率。
- 麈e 2的：温度设定为200℃，时间20分钟，压力250磅和300瓦的功率。搅拌速度必须处于很高的位置，并在最大功率。
- 第3阶段：将温度设定为250℃，时间10分钟，压力250磅和300瓦的功率。搅拌速度必须处于很高的位置，并在最大功率。
- 完成该协议后，让烧瓶在室温下冷却。
注：冷却下来的过程可以具有或不具有气流来完成。这两种情况都提供了相同的结果。骨料出现在搅拌棒，并在烧瓶壁上，用乙醇洗，并把它放到锥形。 - 使用玻璃吸管将反应混合物转移至锥形并加入10毫升EtOH中98％。把一个钕 - 铌 - B系磁铁烧瓶下面，等待5分钟，并用玻璃吸管除去上清液。
- 加入10 mL EtOH中，超声处理在RT样品2分钟，40千赫，将样品上的磁铁和消除上清液。在重复执法机关这一步吨三次。
- 分散油酸纳米颗粒在30毫升CHCl 3中，声处理的，在40千赫兹，在室温5分钟。检查流体力学尺寸的激光粒度仪按照制造商的说明。把0.5毫升的OA-IONP在玻璃比色杯中，并添加0.5 氯仿的溶液中。验收范围7-10纳米表现为强的Z平均大小。
注：OA-IONP可以很好地分散于己烷中。
3.壬二酸纳米颗粒的合成（壬酸IONP）
- 溶解44.3毫克的KMnO 4的和在H 2 O的混合物150.4毫克BTACl的：三氯甲烷（3:2）溶液中。加所得到的溶液，以OA-IONP的5ml的等分试样在微波适于烧瓶中。
- 启动壬酸IONP微波协议。设定温度为105℃，时间9分钟，压力250磅和功率在300W。放10毫升磷酸盐缓冲液的pH = 2.9到烧瓶中并重复微波协议。冷却步骤后，恢复纳米粒子使用磁铁和消除上清液。
- 在40千赫溶于5ml 10％硫酸氢钠3添加到Erlenmeyer烧瓶中，超声处理2分钟，在25℃，收集用磁铁粒子和消除上清液。 （该步骤重复2次。）三次，用1％的NaOH洗涤纳米颗粒和在5ml磷酸盐缓冲液pH的= 7.2最后再分散它。
- 检查流体动力学大小和ζ电位。把0.7毫升壬-IONP成一次性折叠毛细血管细胞并将其插入到激光粒度仪。
注：验收范围大小25-35纳米表现为强的Z平均大小。验收范围Z-潜在-45±5 mV的。较大的纳米颗粒（〜70纳米），可以用磷酸盐缓冲液pH> 7代替pH值= 2.9（参照化学欧元J 2008）获得。
4.奈立纳米颗粒的合成（奈立-IONP）
- 在离心机添加12毫克EDC和15毫克硫代NHS的2毫升等分壬-IONP的。放在在RT涡旋35分钟该混合物。
- 把离心机下方的磁铁动摇纳米颗粒，吸出上清液，并用1.5的HEPES 1mM的pH值为7的缓冲毫升洗涤颗粒。 （重复此步骤两次。）之后，加入5毫克奈立和动摇旋涡混合物2小时。
- 单独的纳米颗粒与用1mM HEPES pH值为7的缓冲磁铁和洗涤（3×2毫升）中。最后，分散奈立-IONP在2ml 1mM的HEPES pH值为7的缓冲。
- 检查流体动力学大小和ζ电位。把0.7毫升奈立-IONP成一次性折叠毛细血管细胞并将其插入到激光粒度仪（见设备安装）。
注：验收范围大小40-45纳米表现为强的Z平均大小。验收范围Z-潜在-20±5 mV的。
5. 在 ApoE基因粥样硬化斑块的体内检测- / -小鼠通过MRI
- 对于MRI收购准备
注：前几个所需的动物实验TRA系统。因此，这将需要：- 使用合适的设备，麻醉动物。
- 获得与外部暖空气一闭路循环的温水系统，以保持动物稳定的温度。
注意：在这种情况下，MRI兼容的监测和浇注系统注册该MRI磁体内部的动物的温度。 - 监测该动物的附近的外部温度，所述动物，在MRI控制台使用集成接口位于胸部附近的动物的身下的呼吸传感器的主体（直肠温度计）的温度。
- MRI实验
- （在两，三分钟，为MRI实验过程中维持1-1.5％的感应2％）与100％氧气麻醉线与蒸发异氟醚的动物。
- 放置动物在与配置文件获取的帮助下磁体的中心。
- 步骤5.2.2之后，调谐RF线圈300兆赫（7 T）的共振频率与匹配线圈的特性阻抗50欧姆为最佳的信号的接收。
注：需要注意的是外部接线和连接将通过适配器/分路器的测量系统，发射线圈的每个部分单独（在我们的情况下，它是一种正交线圈）。 - 调整和匹配线圈后，将线圈放入扫描仪。
- 射频脉冲校准（形状和长度）和中心频率调整执行这两个脉冲校准和手动频率的中心。手动执行90°脉冲校准，粗匀场（见下文），中心频率和接收器的增益的调整。
- 执行使用梯度回波（FLASH或GRE）定位扫描（3飞机侦察获取准确位置：轴向，冠状位，也被称为tripilot。
- 执行磁铁垫补优化磁场均匀的岑磁体之三。手动执行此步骤中，使用一种或单脉冲FID序列（见5.2.3），调整包括在系统中的第一和第二订单垫片或任何自动匀场序列
注：还有匀磁场容易认可和T2 *测量（如越大越好）或光谱窄FWHM。
- 斑块5 MRI数据采集
- 注入100微升（1毫克的[Fe]毫升-1）奈立纳米粒子进入静脉注射尾静脉图像采集后1小时注射。加载MRI收购粥样硬化斑块的看着腹主动脉（肾分叉）的参数。
- 放多片，10〜20片在交错模式，以尽量减少工件。
- 获得高分辨率的快速自旋回波T1加权的MRI在冠状或轴向视图，其参数如下：FOV 60×30毫米（冠状），30×30毫米（轴向），切片厚度一般在0.8毫米（与小梯度线圈共nfiguration这可以减小到0.6mm），400毫秒TR，8毫秒的TE，256×256采集和重建矩阵数据，6（大梯度）至8（小梯度）信号的平均值为5-8分钟平均采集时间。
注：TE是尤其关键的，血液信号和流量和化学位移的工件，可以限制应用程序的存在。在这种情况下不区分大小写流快速自旋回波T2-IR可以帮助减少文物和补充数据在相同的位置收购可以帮助表征牌匾。另外，预饱和脉冲可以用于减少周围动脉壁的壁和化学位移伪像减少的外边界的更好的圈定的脂肪组织。 - 传输的标准格式，如DICOM和查看图像在适当的软件（ 如 Osirix成像软件或酰胺：医学影像数据考官）5。量化对比效果手动划定VESSEL区域，壁厚，管腔面积和斑块负荷5。
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Representative Results
在这个协议中，三个不同的IONP的合成进行说明。从疏水OA-IONP开始，用微波驱动综合的帮助下获得稳定的水性纳米。在一个非常窄的尺寸分布（ 图1c）中的所有纳米颗粒呈现超小流体力学尺寸（DH <50纳米）。利用微波技术的呈现在核心规格方面超小的纳米粒子。由于微波产生一个快速加热，在与其他的方法在纳米颗粒的核心给予较小的尺寸比较成核增加率。然而，颗粒仍然呈现良好的结晶性如在上所述的 Fe 3 O 4的芯的晶格条纹可以清楚地看到的TEM图像示出（ 图1a，b）中 。该方法的另一个重要方面是可重复性。后四次重复壬酸IONP的合成，结果一样在流体动力学尺寸和分布，获得（ 图1d）。
官能后，钙离子结合由于存在于奈立纳米双磷酸盐性能进行了检查孵育这些纳米颗粒具有不同量的 Ca 2+的。它表明，Ť2弛豫时间增量线性Ca量2+和温育的时间，由于纳米粒子的簇的形成，而不含Ca 2+纳米颗粒保持稳定（ 图1E），符合我们的最初的假设。
- / -小鼠体内的MRI实验48周龄的ApoE进行。颈动脉与腹主动脉基础图像是首先被带到。由于病变的粥样硬化斑块的形成，可以清楚地看到。然后，将100微升（1毫克的[Fe]毫升-1 图2），1小时后喷射信号形成斑块相比于基础影像低信号。两个ROI（关注区域）的选择允许在基底和1小时后喷射的图像之间的比较的病变区域的强度信号的量化。斑块肌肉比为他们（P <0.05， 图2b）之间显著不同。
另外，在肝脏中的信号在小鼠中监测100微升奈立纳米颗粒的注射后，以评估是否强度的减少是由于在血液中，而不是通过选择性积累的循环时间。如该图所示（ 图2c），纳米颗粒被完全从循环20分钟，确认选择性积累后清除奈立的纳米颗粒对粥样硬化斑块。进行最终离体成像和组织学。处死小鼠，主动脉萃取。使用和不使用纳米颗粒主动脉的成像显示在体内实验（ 图2d）协议中的信号的差异。
方案1： 合成步骤遵循的协议和基本特征在通过DLS每个点 请点击此处查看该图的放大版本。
图1：甜心cterization纳米颗粒（a）的TEM图像，在两个倍数，为OA-IONP。 （ 二 ）的TEM图像，在两个倍数，对奈立-IONP; （c）在纳米粒子OA-IONP，壬酸IONP和奈立膦酸盐，IONP流体动力学尺寸; （ 四 ）在四个不同的合成和（e）在奈立-IONP中的溶液作为时间和钙浓度（参照TEM协议的功能效应的T 2弛豫时间演化流体力学尺寸为壬酸IONP：NIST - NCL联合测定方案，PCC-X，测量纳米粒子的使用透射电子显微镜的大小）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：MRI数据斑块的（a） 在 ApoE基因的体内 MRI - / -小鼠前（上）和奈立-IONP（底部）的静脉注射后一小时。 （ 二 ）牌匾肌肉相对信号强度前（基础）和奈立-IONP的静脉注射后一小时; （ 三 ）肝在不同时间点的肌肉相对信号强度奈立-IONP和（d） 离体主动脉的两只老鼠，有和没有的纳米粒子5的注入图像的注射后， 请点击这里查看大图版本这个数字。
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Discussion
氧化铁纳米颗粒（IONP）是最重要的纳米材料之一，它已被用于从很久以前不同的应用。使用这些材料作为造影剂用于磁共振成像（MRI）是一种行之有效的字段。然而，合成路线往往需要几个时间，设置复杂。由于极大地降低反应时间，并提高再现性利用微波驱动的合成似乎是为生产高品质的纳米颗粒的一个很好的选择。另外，在上述协议中，微波技术已被用于两个不同的纳米粒子的合成。微波允许，可以影响颗粒的最终特性的主要参数的微调。要注意，如果任何所描述的条件改变纳米颗粒的物理性质会发生变化是很重要的。由于某些化学物质在合成过程中使用的purification步是至关重要的，以获得高质量的纳米颗粒。
在OA-IONP多余的表面活性剂，以用于获取在纳米粒子足够的稳定性。合成后，三级净化步骤是强制性将其删除。对于壬酸IONP的合成中，需要两个不同的微波阶段。在第二阶段中，颗粒的最终尺寸可从超小IONP使用生理pH <用pH = 2.9到更大的流体动力学尺寸（D 小时 （50纳米50纳米）天小时 ）>进行调整。在壬酸IONP的纯化，氢氧化钠的使用量是至关重要的。的NaOH足够量必须增加以稳定纳米颗粒，但是过多的NaOH能解吸从纳米颗粒呈现不稳定的材料的表面活性剂。
通常，IONP具有在血液短循环时间，这是主要的缺点之一。对于其作为造影剂使用，纳米粒子需要承诺速率culate足够的时间在血液中，以达到所需的区域。为了提高血液中不同的方法古典开展了循环时间。这些策略主要是基于聚乙二醇化的部分，其程度的纳米颗粒的循环时间的附件。然而，在奈立-IONP的情况下，积累非常快生产。使用氨基二膦酸的作为生物分子的纳米颗粒定位到动脉粥样硬化斑块是基于这些种化合物中的钙的能力的新概念。它在病变区聚集在不到一个小时的演示对钙包含在动脉粥样硬化斑块奈立-IONP的高亲和力。
对于动脉粥样硬化斑块的可视化，很多先进的成像技术通常使用。其中，正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像是最规范的技术。 PET提供的功能信息方面的最佳结果，由于高灵敏度和MRI在解剖信息最好的结果，由于高的分辨率。虽然PET可以遵循的合成探针的理想选择，这种技术在小动物的分辨率（〜1毫米）限制了它的使用在粥样硬化病变的可视化小钙化。 MRI是提供更好的分辨率（〜0.1微米）的理想替代品。该技术的较低的灵敏度不可避免在感兴趣区域中的造影剂的可视化和更好的分辨率允许鉴定小钙化。此外，结果表明，奈立-IONP的独特的快速积累与高分辨率的MRI的组合对于在小动物的检测动脉粥样硬化斑块的理想情形。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 | CEM Corporation, USA | Any microwave for chemical synthesis can be used | |
| Disposable PD-10 desalting columns | GE Healthcare life sciences | 17-0851-01 | Any size exclusion column will work |
| Amicon®Ultra-0.5 ml | Merck Millipore Ltd | ||
| Calibrated pH meter | SI analytics | 285105127 | |
| Neodymium magnet | Aiman Gz | ND010B | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| ZetaSizer Nano ZS | Malvern Instruments | ||
| Standard (macro) cell Optical glass | Labbox | 11718 | |
| Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 | Malvern | ||
| Bruker Minispec mq60 | Bruker |
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