Introduction
Omurgalı sinir sistemi nöroepitelyal homojen bir hücreler katmanı olarak nöral plaka ortaya çıkar. Gelişimsel programlar nöral plaka bölgeselleşme sırasında, uyarılan kodlanmış, ve kurulan nasıl anlamak, şu anda, gelişim biyolojisi önemli bir hedeftir. Diğer sistemlere göre, deneysel müsait Xenopus embriyo sinir gelişim 1,2 erken adımları analiz için tercih edilen bir modeldir. Bu embriyoların çok sayıda elde etmek kolaydır ve dış gelişme nörülasyon 3 ilk adımlar erişim sağlar. Birçok araç deneysel Xenopus laevis (X. laevis) embriyonik gelişim işlemek için kullanılabilir. Mikro enjeksiyon birlikte biyokimyasal ve farmakolojik araçlar ile indüklenebilir MOS dahil mRNA veya morpholinos (MO), bir, fonksiyon kazanç (GOF) ve fonksiyon (LOF) kaybı ve yolları 4,5 sinyal belirli değişiklik kontrollü verir. Blastocoel çatı ektoderm, bir blastulanın veya çok erken gastrula embriyo hayvan kutup etrafında yer alan ve "Hayvan Cap '(AC) olarak adlandırılır, gen ekspresyonunun önce manipülasyonu ile programlanabilir pluripotent hücreler kaynağıdır hazırlık eksplant. Bu yazıda X. kullanmak için ayrıntılı protokoller laevis AC eksplantları vitro ve in vivo moleküler mekanizmalar ve hücresel süreçleri altta yatan nöral gelişim test etmek.
Bir teknik Xenopus iribaş nöral tüp içinde gen ekspresyonu ince gözlem, kader tayini ipuçları belirlenmesinde bir ön adımı izin sunulmuştur. Düz monte dokuların gözlenmesi yaygın piliç embriyoları 6 çalışmada kullanılan Oysa, düzgün Xenopus tarif edilmemiştir. 2 veya 4 hücreli dönem embriyoların blastomer içine sentetik mRNA veya MO enjekte ederek gen ifadesinin Manipülasyon AC programlanmasına olanak tanır4 eksplant. Anti-BMP faktörü Noggin sentezlenmesiyle Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) yolunun, örneğin inhibisyonu için, AC hücreleri 3 için bir sinir kimlik vermektedir. Protokol bir anyon değiştirme reçinesi boncuk ile doğrudan temas yoluyla dışsal uyaranlara AC eksplant yerel ve zaman kontrollü pozlama gerçekleştirmek için ayrıntılı. Son olarak bir teknik ayrılmış ve yeniden ilişkili programlanan farklı hücrelerden hazırlanan karışık eksplant nakli in vivo sinir progenitörlerin gelişim özelliklerini test etmek için bir işlem açıklanmaktadır.
Kurbağa embriyo erken omurgalı nöral gelişimini incelemek için güçlü bir modeldir. Gen ifadesinin manipülasyonu birleştiren in vitro kültürleri eksplantasyona için neuroepithelium bölgeselleşme, çoğalması ve morfojenezinin 7-12 çalışmada önemli bilgiler sağlar. AC eksplant programlama ex vivo 13,14 fonksiyonel kalp gelişimini izin verdi. Kullanımaşılama eksplant 15 nöral tepe farklılaşma programı 16 indükleyici az transkripsiyonel anahtarın tanımlamasına yol açmıştır. Zona limitans intrathalamica (ZLI) kaudal ön beyin gelişimini ve bölgeselleşme kontrol sonik kirpi (Sus) salgılar bir sinyal merkezidir. Sürekli Shh maruz kaldığında, üç transkripsiyon faktör genleri coexpressing nöroepitelyal hücreler - barH benzeri homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) ve Iroquois-3 (irx3) - ZLI bölmenin iki özelliklerini kazanmak: yeterliğinin şşş ifade ve ön nöral plak hücrelerden ayırmak yeteneği. Bir model sistem olarak, nöroepitelyal hücrelere bir ZLI kaderin indüksiyonu 8 sunulacaktır.
Bu protokoller temel mec keşfetmek için gelişimsel biyologlar ve diğer araştırmacılar için basit, ucuz ve verimli araçlar sağlamayı amaçlıyorAnahtar nöral hücre davranışları hanisms. Bu protokoller çok yönlü ve dışsal ve içsel nöral belirleme ipuçları geniş bir ürün yelpazesi soruşturma izin verir. Bu sinir soy bağlılığı, endüktif etkileşimleri ve hücre davranışlarının in vivo analizlerde uzun vadeli izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler bilimsel amaçlarla ve yedek, azaltılması ve arıtma uluslararası kurulan ilkeleri ile kullanılan hayvanların korunması konusunda ulusal ve Avrupa yönetmelik ile uyumlu.
Xenopus 1. Düz montaj sonrası Tadpoles Anterior Sinir Tube laevis in Situ Hibridizasyon Tüm montaj
- X edinin standart prosedürler 4 ve 26 ve üzeri (Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 neurula sahne ulaşana kadar onları yaş göre embriyolar laevis.
- Fix X. % 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi içinde inkübe edilerek kurbağa yavrularını laevis. 38 embriyolar, daha sonraki aşamalarda embriyolar için oda sıcaklığında 2 saat sahne sahne 26 için, 1 saat oda sıcaklığında 1.5 Kaya ve 2 ml cam şişe embriyolar döndürün.
DİKKAT: PFA temas ve şüpheli karsinojen tarafından toksiktir. Bir başlık altında manipüle edilmelidir.
NOT: Bir X laevis damızlık olduğunugenellikle 2 ml'lik bir cam şişe içinde sabit, ancak daha büyük bir cam şişe kullanılabilir. - Iki kez,% 0.1 Tween (PBT) ile 1x PBS kullanarak aynı şişe içinde embriyolar, oda sıcaklığında 3 dakika yıkayın.
NOT: Aksi kullanılan PBS belirtmek sürece veya kalsiyum ve magnezyum olmadan. - Aynı şişe içinde oda sıcaklığında en az 12 saat süre ile 100% metanol (MeOH) içerisinde embriyolar kurutmak. Plastik mikropipet kullanarak başlık altında en az iki kez MeOH% 100 olarak değiştirin.
NOT: MeOH içinde çözündürülmüş lipitlerin hafif sarı bir döner. MeOH Solunduğunda toksik ve bir başlık altında manipüle edilmelidir Dikkat. - PBS, MeOH PBS içinde% 50, iki kez PBS, PBS içinde% 25 MeOH, oda sıcaklığında her banyo 5-10 dakika içinde MeOH 75:% kademeli MeOH banyolarının dizi, aynı şişeyi kullanarak embriyolar rehidrate. MeOH çözümleri plastik mikropipet kullanarak başlık altında değiştirilir.
- Plastik bir pipet kullanarak, embriyo PBT üstüne dolu bir 60 mm Petri kabındaki disseke transfer. İki ince forseps bakım kullanmaTamamen optik sapı düzeyinde, gözler ve nöral tüp arasındaki tek ince forseps takarak gözlerini çıkarın. Nöral tüp gözleri ayırın. Dikkatle nöral tüp örten ektoderm altında forseps tanıtmak. Bakım ile, başın arkasında başlayarak ektoderm soyulabilir ve atın.
- Kullanarak bir çift veya tek ISH gerçekleştirme digoksigenin işaretli ya da daha önceden olarak fluoresan etiketli problar 18,19 tarif.
- ISH PBT plastik pipet kullanarak üstüne dolu yeni bir 60 mm Petri kabındaki embriyoların transferi sonrasında.
- Ince forseps kullanarak dikkatlice embriyo geri kalanından nöral tüp ayırın. Bu aşamada, ön nöral tüp posterior nöral tüp ayırır. Dikkatle nöral tüp, gevşek nöral tüp, otik veziküller ve mezodermin kalan parçaları aşağıda bağlı olduğu Notokordun örten ektoderm kalan kısımlarını ayırın. Nöral tüp herhangi ekler yoksun olduğundan emin olunbu aşamada.
NOT: Gerekirse ucunda bir uç kesim ile plastik transfer pipet yardımıyla tüm nöral tüp / embriyo transferi veya bir mikropipet gerçekleştirmek nöral tüp zarar görmesini önlemek için. Burun ucunun çapı nöral tüpün büyüklüğü ayarlanır. - Parçalara nöral tüp transfer PBS içinde seyreltilmiş 50% gliserol ile doldurulmuş, 1.5 ml bir tüp içinde (not adım 1.9). Nöral borular gliserol çözeltisi altına düşene kadar 4 ° C 'de, genellikle O / N, dur.
- % 50 gliserol çözeltisi kaldır / PBS mikropipet P1000 ile aynı 1.5 ml tüp içinde bir mikropipet P1000 olarak% 90 gliserol / PBS çözeltisi ilave edilir. Nöral tüpler 4 ° C'de, genellikle,% 90 gliserol / PBS çözeltisi altına O / N düşene kadar bekleyin.
NOT: Uzun süreli depolama için, bakteri gelişimini önlemek için% 90 gliserol / PBS artı antibiyotik kullanımı. - Bir cam plaka, ya da bir plastik transfer pipet yardımıyla bir mikroskop lamı üzerinde sinir tüpleri aktarın.
- Disdorsal ve tungsten iğneler kullanılarak ventral midlines boyunca sinir tüpleri mezhep. Bu adım sırasında sinir tüpleri% 90 gliserol / PBS tutulur.
- Bir cam lamel ile kaplı takviye halkaları kullanılarak% 90 gliserol / PBS nöral tüpün iki tarafını monte edin.
- Vernikle lamelleri düzeltmek ve 4 ° C'de tutun.
Anyon Değişim Reçine Boncuk kullanma 2. Hayvan Cap Eksplantlar İndüksiyon
- Mikropipet P1000 kullanılarak 2 ml tüp içine anyon değiştirici reçine boncuk 100 ul aktarın. Steril damıtılmış su ile boncuk en az beş ardışık kez yıkayın. Boncuk tüpün dibinde tortu ve mikropipet P1000 kullanılarak steril distile su yerine izin verin. Boncuk dokunmayın.
- Boncuklar, 4 ° C'de Sığır Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) ile steril damıtılmış su ile dolu bir 2 ml tüp içinde, O / N ıslatın.
- İki saat yeni bir 1.5 ml komisyonlarda, boncuk yeri yarısını toplayarak öncemikropipet P1000 kullanılarak tüp. Molekülünü içeren bir maddenin 500 ul de endüktif potansiyeli için test ya da belirli bir kaderi indüklediği bilinen steril damıtılmış su değiştirin. Bir negatif kontrol olarak kullanılmak gibi, boncukların diğer yarısını tutun.
- En az 2 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin boncuklar.
- Stereomicroscope altında sonraki tüm adımları uygulayın ve bir mikropipet ile tüm AC transferini gerçekleştirmek.
- Plastik bir transfer pipeti kullanılarak% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyum ile PBS içine Blastula ya da çok erken gastrula embriyolar aktarın.
NOT: Embriyolar 20 ila 24 saat içinde 12 ° C ulaşmak blastula ve gastrula aşamalarında geliştirilmesi. - Daha önce açıklandığı gibi 20 forseps kullanarak embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Zarının Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın. Ven bu yordamı gerçekleştirmekEmbriyonun tral (bitkisel) taraf. Embriyonun hayvan tarafını zarar vermeyin.
- Daha önce açıklandığı gibi 21 küçük komisyonlarda izole edin. Hayvan kutup embriyonun pigmentli bir parçasıdır. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusu sadece ektodermal hücreler içerir. Doku muntazam kalınlıkta olduğundan emin olun. Değilse, analize AC kaldırın.
- Barth'ın Salin (MBS) 4 Değiştirilmiş 0.5x bir Terasaki multiwell plakalarda her ac yerleştirin. Iyi yuvarlak alt ile temas halinde, aşağı pigmentli hayvan tarafı ile kuyunun içine ac yerleştirin.
NOT: Bir% 0.1 BSA çözeltisi ile kaplama pipetler plastik yapışkan doku küçük parçalara yapışmasını önler. - Mikropipet P20 kullanarak her kapakta tek boncuk yerleştirin. Gerekirse, dikkatle kapağın ortasına boncuk yerleştirmek için forseps kullanabilir.
NOT: klimalı ortamda batırılmış zaman boncuk pembe renklidir. En co Seçinlored boncuklar. - Terasaki oyuklu bir plaka hareket RT'de 6 saat boyunca (18 22 ° C) inkübe edin. Boncuk az 2 saat ac yapışıyor.
- Su ile ıslatılmış kağıt üstünde Terasaki çukurlu bir levha yerleştirin. Plastik bir kap ile plaka örtün.
NOT: Bu 'nem odası' kuyuların erken buharlaşmasını önler. - Kardeş embriyolar senin faktörün etkisini test etmek doğru aşamaya kadar Kültür 0.5x MBS veya 3/4 NAM ACs 15-20 ° C'de nem odasında (adım 4.1).
- Taze hazırlanmış% 4 PFA 1 saat komisyonlarda düzelt. Daha önce (Adım 1.4) açıklandığı gibi% 100 MeOH içinde komisyonlarda kurutmak.
3. Hayvan Cap Hücre Ayrılma ve reaggregation bir Xenopus laevis neurula içinde Aşılama önce
- Kaplama petri kaplarına (60 mm) ya da kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS, steril su içinde ya da% 3 agaroz ile 12 kuyucuklu plak. B karşılamak için yeterli agaroz eklepetri veya kuyunun ottom. RT (18-22 ° C) plakaları ön ısıtmak. İsteğe bağlı olarak, su kaybını önlemek için 4 ° C'de birkaç gün için tabak saklı.
- Hazırlama kalsiyum içermeyen Holtfreter tuz (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA (A-7888 Sigma pH 7.6)) ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCl2, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA, pH 7.6) 5. Not: CaCI2 çözeltisi Otoklava.
- Agarozun kaplı Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üstüne de doldurun.
- Daha önce açıklandığı gibi kendi komisyonlarda izole etmek blastula veya çok erken gastrula embriyolar hazırlayın (2.7 2.5 adımları).
- En az 15 ya da 30, küçük bir ACs 21 kadar izole edin. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusunun sadece ektodermal hücreler içerir ve bu nedenle aynı kalınlığa sahip olan. Değilse, analize AC kaldırın.
NOT: Hayvan kutup Embry olduğunuo'in en pigmentli kısmı. - Bir içine komisyonlarda aktarın iyi Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üst dolu agaroz kaplı. Onların pigmentli tarafı yukarı bakacak şekilde komisyonlarda yerleştirin.
NOT: ayrışma süreci kalsiyum ücretsiz Holtfreter tuzlu su içinde hızla başlar. - Hücreler dissociating başlamak için birkaç dakika bekleyin. Dokuların ayrıştırma ile bu gözlemleyin. Ince forseps kullanarak, AC geri kalanından pigmentli tabakayı ayırmak ve bir mikropipet P20 ile atın. Tam hücre ayrışma işlemi birbirinden hücrelerinin ayrılmasını belirtir.
NOT: Bir veya iki pigmentli katmanları aşılama sırasında görselleştirme yardımcı olmak için yeniden toplanmış eksplant içinde bırakılabilir. - Plaka dairesel hareketler kullanarak hücreleri merkezi. Bir mikropipet kullanarak dikkatle mümkün olduğunca orta kaldırmak P1000. Hücreleri dokunmamaya özen gösterin.
- Çukuruna kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su 1 ml ilave edilir. Ayrışmış komisyonlarda aktarın1.5 ml tüp içine.
NOT: 2 ml tüpler da yuvarlak tabanlı nedeniyle kullanılamaz. - Bir tezgah santrifüj (500 xg) için 2000 rpm maksimum hızda santrifüj, 5 dakika ile pelet hücreleri. Mikropipet P1000 ile dikkatlice süpernatantı.
- Ayrışmış hücrelere kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCI2, 4.6 mM HEPES 20 ul ekle,% 0.1 BSA (Sigma A-7888 pH 7.6) 5.
- Ayrışmış komisyonlarda, 3 (18-22 ° C) oda sıcaklığında saat 6 tutun.
NOT: Bu hücreler yeniden agrega için gerekli zamandır. Hücreler tüpün dibinde küçük bir top form olarak yeniden toplanma görülebilir. - 0.5x MBS ya da 3/4 NAM 1 ml 1 ml ekleyerek tüp alt dikkatle ayırın eksplant (adım 4.1). Plastik transfer pipet kullanarak bir un kaplı levhada eksplant aktarın.
- Kendi kontrol kardeşleri ile eksplantlar Sahne. Uzun süreli kültür kullanımı antibiyotik: kanamycin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml).
Animal 4. Tırnak X'in Sinir Plate eksplantlar Caps laevis Embriyo
- 3/4 NAM hazırlanması (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0.2x PBS, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C'de diseksiyon ve mağaza için fazla 1 hafta tutmayın. Yaşlı NAM agaroz kaplı diseksiyon yemekler (aşağıda) hazırlanması için kullanılabilir.
- Coat petri küçük delikler silikon kalıp veya bir masa tenisi raketi kapağını kullanarak yapılmış içine 3/4 NAM% 3 agaroz ile (60 mm).
NOT: Agaroz petri alt kapsar. Petri 3/4 NAM ile doldurmak, böylece biraz boşluk bırakın. Alternatif kurutmayan modelleme kil ile diseksiyon yemekleri yapmak. Kil içinde diseksiyon işlemi sırasında hafifçe embriyolar sıkın. Küçük delik kazmakagaroz yuvarlak forseps Bu 'diseksiyon çanak' kullanarak diseksiyon işlemi sırasında embriyoların tutmak için yardımcı olur. - Diseksiyon araçları toplayın: plastik transferi pipetler, 22, iki ince diseksiyon forseps, P1000 mikropipet ve ipuçları, büyütme 8-40X bir stereosmicroscope (cam Pasteur pipeti ucundaki parafin gömülü kaş saç ile yapılan) bir 'kaş bıçak', fiber optik kılavuzları ile parlak bir ışık kaynağı. Temiz bütün kesme aletleri tutun; Her deneyden sonra, bir kez% 100 etanol ile, distile su ile iki kez yıkayın ve kurumaya bırakın. Metal kesme aletleri tozdan ve gerekli otoklav eğer uzakta saklayın.
- Let ayrışmış ve yeniden toplanan Klimalar (protokol 3) ve onların kardeşleri X. Onlar sahne 13 (neurula) ulaşana kadar laevis embriyoların Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 gelişir. 15 embriyolar sahne nöral plak aşamasında 13 içinde nakil için kullanılır.
- Tüm yürütmekstereomicroscope altında sonraki adımlar.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak,% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyumlu PBS içine embriyo aktarımı. Daha önce açıklandığı gibi 20 embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Sıkıca zarı Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın.
NOT: Embriyonun ventral (bitkisel) tarafında bu yordamı yapın. Embriyolar nöral plakayı zarar vermeyin. Embriyolar Vitellin zar çıkarma aşaması sırasında zarar görmüş ise, plastik bir transfer pipet kullanarak 3/4 NAM içeren 60 mm petri kabına embriyo transferine ve 15 dakika, iyileşme süreci gerçekleşmesi için yeterli bir süre bekleyin. - Taze 3/4 NAM üstüne diseksiyon çanak doldurun.
- Plastik bir transfer pipet kullanarak, diseksiyon çanak içine kendi vitellin membran olmadan embriyo transferi. Içine embriyolar dorsal yüzü koyunkuyular. Transfer işlemi sırasında embriyo X beri hava-sıvı arayüzü ile temas girmesine izin yok laevis yüzey gerilimi ile lize edilmiştir.
- AC eksplant aktarın plastik transfer pipet veya mikropipet P1000 kullanılarak diseksiyon plaka içine aşılı olması. Pipet sıvı içinde sonra, eksplantlar yavaş yavaş yerçekimi tarafından aşağı lavabo, ya da çok hafifçe itin izin verir.
- Yuvarlak forseps ile embriyolar koruyun. Kaş bıçak ile size eksplant taşının greft niyetinde sinir tabak içine bir kesi yapmak.
NOT: Nöral plakasının ön bükme bir dönüm noktası olarak kullanmak olabilir aşamada 14 anda, diencephalon toprakları (Şekil 4) işaretler. - , Neuroepithelium küçük bir parça kesip yuvarlak forseps ve bir kaş knive kullanarak. Kaş bıçakla eksplant küçük bir parça kesin.
NOT: eksplant parçası neuroepithelium ablasyon alanı olarak aynı boyut ve şekil konusunda olmalıdır. Kaş bıçak ve ince forseps kullanarak neuroepithelium kesi içine eksplant parçası yerleştirin. Eksplant hızla embriyo verdiği emin olun. - Alternatif yerinde greft korumak için aşılı embriyo üzerine cam lamel bir parça yerleştirin. Bunu yapmak için, kaba forseps kullanarak çok küçük parçalar halinde ince bir cam lamel kesti. Boyutu yaklaşık 1,5 mm 2 olduğundan emin olun. 3/4 NAM veya PBS kullanarak forseps içeren bir Petri kabı içine parçaları bırakın. Hasar görmesini önlemek için embriyo daha büyük bir cam parçası seçin. Embriyo biraz basık olacaktır.
- Taşımadan en az 30 dakika bekleyin, ya da sadece hafifçe diseksiyon plakasını taşıyın. Embriyo 2 saat 30 dakika için kurtarmak ve gerekirse yavaşça lamel kaldırmak edelim. Dikkatle plastik transfer pipet kullanarak, 3/4 NAM dolu temiz bir çanak içine aşılı embriyolar pipetle.
NOT: Aşılı embriyolar bakteri veya mantar kontaminasyonu geliştirmek eğilimindedir. Uzun vadeli ckanamisin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml ug): ulture antibiyotik kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı türler, embriyolojik manipülasyonları ve düzenleyici genlerin ifade deseninde morfolojik değerlendirmeler dayanarak, bir kavramsal model nöral plak farklı histogenez alanları üreten bir gelişimsel ızgara tanımlayan enine ve boyuna parçalara bölünür savunur. Nöral plaka olarak, ön beyin, orta beyin, Beyin ve omurilik taslakları tüm zaten (23-25 gözden) gastrulasyon sırasında ön-arka (AP) ekseni boyunca kurulmuştur. Nörülasyon sırasında histogenez alanları gen ifadesinin uzamsal sınırlı etki alanları olarak tespit edilebilir. Düzenleyici genlerin ekspresyonu üzerine dayalı olarak, ön beyin taslaklarının prosomeres (p) olarak adlandırılan ayrı bir histogenez alan oluşturan altı tane çapraz parçalara bölünür. Her prosomere bir ventral (bazal) ve (26,27 olarak yorum) dorsal (alar) kısmına ayrılmıştır. Amfibialarda, prosomere 2(p2) epithalamus ve talamus ve onun organizatör (28,29 gözden) Z ona L imitans ben ntrathalamica (ZLI) 8 doğurur.
Şekil 1 X'in düz montaj gösterilir laevis ve X. tropicalis anterior sinir aşamalarda 30 32 tüpler ve WM-DISH sonra 35. WM-ISH protokolü bu telencephalon ve p3 işaretler fezf2 transkripsiyon faktörleri için problar kullanılarak 1, P2, kortikal hems ve beynin, Iroquois-1 (irx1) Iroquolar-3 (irx3) işaretler barhl2 göre gerçekleştirilmiştir bu, sırasıyla mark kaudal p2 ve alar p2 ve zli, bazal ön beyin ve Ortabeyin (Şekil 1E) işaretler morfojen Shh için. Çeşitli gen ekspresyonu karşılaştırmalı bir analiz ortaya koyuyor ön sınırının olduğunu barhl arasında2 p2 sentezleme P3 fezf2 ifade kaudal sınırı dayanır (Şekil 1A). Irx3 birlikte ifade gelecekteki ZLI (Şekil 1B) Shh ile. P2 irx1 sentezleme etki içinde Shh (Şekil 1C), 8 edilene tamamlayıcıdır. X. barhl2 ifade şablonu aşamada 35 tropicalis Şekil 1D gösterilmiştir. Gelişmekte olan amfibi önbeyin bu genlerin ekspresyon bölgelerin bir şematik diyagramıdır Şekil 1E'de sağlanır.
Protokol 2 Klimalar eksplantlar araştırıldı shh ifade ikna etmek için Shh batırılmış anyon değiştirici reçine boncuk yeteneği kullanma. X. sahne embriyolar barhl2 ile birlikte ön nöroepitelyal indükleyici noggin için kodlayan mRNA'ların 4 ve 8-hücre 4 hayvan blastomerlerin içine enjekte edilmiştir laevis obir enjeksiyon izleyici olarak tx2, irx3 ve gfp. Anti-BMP faktörü Noggin ifadesi BMP yolunu inhibe eder ve AC hücrelerine 3 nöral kimlik verir. Biz Anteriorised Hayvan Cap (AAC) olarak Noggin ifade ac bakın. Blastocoel tavan eksplantlar salgılanmış N-terminal parçası, bir koşullu ortam (CM), batırılmış bir anyon değişim reçinesi boncuk ile temas içinde 18 ° C 'de 2 saat süre ile 48 AACS kültürlenmiştir Protokol tarif edildiği gibi hazırlanabilir ihtiva eden ya da değil sıçan morfojen sonik kirpi (N-Shh). Endojen Shh'nin ekspresyonu ISH (Şekil 2) ile analiz edildi. Xenopus Shh'si (Xshh) sentezlenmesi N-Shh (Şekil 2B) olmayan CM batırılmış boncuk ile temas içindeki hücrelere N Shh ancak modlu batırılmış boncuk ile temas içindeki hücrelere saptanır.
Protokolü kullanma 3 farklı hücre tiplerinin yeteneği biri anoth dan ayırmaker araştırıldı. X. laevis embriyolar mRNAlar veya otx2, barhl2 ve irx3 olmadan noggin kodlayan ile sahne 4 ve 8-hücreli 4 hayvan blastomer içine enjekte belirtildiği gibi, kullanmakta olduğunuz ßGal ya Gfp izleyiciler (Şekil 3A) elde edilir. Evre 8/9 ACs ayrışmış ve ßGal- ve Gfp sentezleyen hücrelerin hem de içeren karışık nöroepitelyal hücrelerden oluşan eksplantlar oluşturmak için yeniden toplanmış. Reaggregated eksplantlar 18 ° C 'de 48 saat süre ile kültüre edildi. ßGal aktivitesi 30 (Şekil 3A) 'e göre kırmızı ortaya çıktı. Hücre davranışını yeniden birleştirilmiş eksplantlarında kendi localisation izlenerek gözlemlenmiştir. AACS hücreleri Otx2 (kırmızı) eksprese eden AACS hücrelerle karıştırılır eksplantlar olarak, ßGal-eksprese eden hücreler GFP-ifade eden hücrelerden serbest karışmış hücrelerin her iki tip (Şekil 3B, 3C) ayırmak yoktur. Bunun zıttı olarak,hücreler (GFP) Otx2 eksprese eden eksplantlar Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) -expressing hücreleri (ßGal) ile karıştırılmaktadır, ßGal-ifade eden hücreler (kırmızı) kohezif yamalar şeklinde ve (yeniden toplanmış eksplant içinde eşit yaymazlar Şekil 3D, 3E).
Protokol 4 kullanılarak programlanabilir AC hücrelerinin davranışı in vivo araştırılmıştır. X. Embriyolar barhl2 ve irx3 tek başına ya da birlikte otx2 ile noggin için kodlayan mRNA'ların 4 ve 8 hücreli aşamada 4 hayvan blastomerlerin enjekte edildi laevis. ßGal izleyici olarak kullanılmıştır. Buna paralel olarak, embriyolar aynı şekilde mRNA'lar noggin için kodlayan ve sıçandan morfojen Shh'nin salgılanan N-ucu kısmı (N-shh) enjekte edilmiştir. Aşamasında 8/9 'de AC eksplantlar ayrıştırılmış ve hemen neuroepit oluşan karışık eksplantlar oluşturmak için toplanmış yenidenHelial hücreleri eksprese eden N-Shh ve Otx2 veya eksprese N-Shh ve Otx2, Barhl2 ve Irx3 (BOI3). karma eksplant Küçük parçalar X nöral plaka aşılanmıştır aşamasında aşılanmış hücreler ßGal boyama (kırmızı) ile işaretlenen 14 embriyolar laevis. Aşamasında 35 'de endojen Shh'nin ekspresyonu ISH ile analiz edilmiştir. X ön nöral plakasına aşılandığında Embriyolar, BOI3 ve N-Shh'nin ifade eden hücreler oluşan karışık eksplantlar ZLI hücrelerinin spesifik özellikleri, iki gelişmiş laevis: aşılanmış hücreler Xshh ifade ve ön nöroepitelyal hücreleri (Şekil 3C) için ayrılmış. Hücreleri ifade ve N-Shh- X'te aşılanmış - karışık Otx2 oluşan eksplantlar aksine, Nöral plaka laevis, aşılı hücreler sus ifade vermedi ve komşuları (Şekil 3B) 8 ila ayırmak vermedi.
X Şekil 1. Düz monte nöral tüp laevis ve X. tropicalis tüm montaj çift ISH embriyolar (A - D). WM-ISH kullanılarak yapılır fezf2, (A - C) üzerinde prob olarak barhl2, irx1, irx3 ve şşş X aşamalar 30, 32 embriyolar laevis ve 35 ve (D) X. aşamada 35 tropicalis embriyo belirtildiği gibi. Örnek embriyoların nöral tüpler kesilir ve çıkartılan sinir tüpleri bir yan görünümü, dorsal kadar, ön soldan gösterilmektedir protokol 1'de tarif edildiği gibi, düz monte edilmiştir. Belirteçler ve aşamaları belirtilmiştir. P2 rostral ve kaudal sınırları oklarla gösterilir. (AC) ölçek çubuğu 0.5 mm için duruyor. (D) s-cale bar 0,1 mm için duruyor. . St.30 de ön beyin işaretlerinin (E) şematik barhl2 sentezleme etki taralı çizgilerle gösterilmiştir; İfade Alanı fezf2 (pembe), sus (kırmızı), irx3 (sarı) ve irx1 (yeşil) için gösterilmiştir. p prosomere anlamına gelir. P2'nin üstünde bulunan epifiz bezi gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Anyon değiştirme reçine boncukları ile temas ile programlanabilir eksplantlarında shh ifade Şekil 2. indüksiyonu. Küçük ACs tracer olarak GFP ile, noggin, barhl2, otx2 ve irx3 için mRNA kodlaması ile enjekte edilen embriyolar hazırlanır. AAC f duranveya Anteriorised Hayvan Cap. Barhl2, Otx2 ve Irx3 (AAC BOI3) ifade AAC eksplantlar koşullandırılmış ortam içinde ıslatılmış bir boncuk (CM), ya da N-ihtiva eden Shh, veya gösterildiği şekilde, ile temas halinde 48 saat boyunca kültürlenir. Eksplantlar Xenopus (X) Shh'nin ekspresyonu için ISH ile analiz edilir. Ölçek çubuğu 0,5 mm. Duran bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Yeniden toplanan eksplant hücre tecrit davranışının Şekil 3. Analizi. (A) Belirtildiği gibi X laevis embriyolar noggin, otx2, barhl2 ve irx3 için mRNA kodlaması ile enjekte edilir. ßGal ve GFP işaretleme maddesi olarak kullanılır. Aşamada 8/9 küçük ACs hazırlanır , Ayrışmış ve Gfp / ßGal karışık hücre tiplerinin yapılan eksplantlar oluşturmak için yeniden toplanmış. Eksplantlar, 18 ° C'de 48 saat boyunca kültürlenir ve ßGal aktivitesi (kırmızı) ortaya çıkar. (B - E) gösterilir belirtildiği gibi proteinleri ifade karışık hücrelerden oluşan Temsilcisi eksplantlar. AAC Anteriorised Hayvan Cap duruyor. ACs hücreleri eksprese eden Noggin (GFP) ile karıştırıldığında (B, C) ve Noggin Otx2 (ßGal) ifade ACs hücreleri rastgele yayıldı. (C) (B) Genişletilmiş görünümü. Barhl2, Otx2 ve Irx3 (BOI3) (ßGal) ifade (D) AACS hücreleri yeniden bir araya ve Otx2 (GFP) ifade AACS hücrelerinden ayrılmış. (E) (D) büyütülmüş bir görünümüdür. (B, D) ölçek çubuğu 0.5 mm için duruyor. (C, E), ölçek çubuğu 0,2 mm anlamına gelir.g "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir sahne 14 embriyo nöral plakasında aşılanmış Resim 4. Programlanan eksplantlar gelişim özellikleri sergiler (A) Deneysel şeması. Gösterildiği gibi AACS mRNA enjekte edilmiş embriyolar hazırlanır. Aşamada blastocoel çatısından 8/9 hücreleri kesilerek ve ßGal (kırmızı) eksprese eden karışık hücre tiplerinin imal eksplantlar oluşturmak için toplanmış yeniden. Onların kardeşleri ön nöral plaka içinde bir kesi içine konur sahne 14. karışık eksplant (yeşil dikdörtgen) küçük bir parça ulaşana kadar eksplantlar kültür. Evre 35. Kumandalı embriyolar X kullanarak WM-ISH ile analiz edilinceye kadar işletilen embriyolar yetiştirilen laevis sus (Xshh) prob olarak. ßGal aktivite kırmızı acc ortaya çıkıyor30 Ording. (B, C) sahnenin aşılı kenarları 35 temsilci sinir tüpleri gösterilir, yan görünüm, dorsal yukarı, ön sol. Otx2 ve N-Shh eksprese karışık AACS ile aşılanmış (B). Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) ve N-Shh eksprese karışık AACS ile aşılanmış (C). Aşılı hücreler kırmızı yıldız ile gösterilir. Pembe yıldız adaylarının diensefalonu gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöral gelişim (3,31,32 yılında yorum) çevre dokulardan hücresel gelişim programları ve sinyaller arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. Burada X kullanılabilecek protokoller kümesini tarif dışsal ve sinirsel kader tayini ve in vitro ve in vivo nöral morfogenez katılan içsel faktörlerin keşfetmek için embriyolar laevis. Bu protokoller, X'te gibi kullanılabilir tropicalis embriyolar, ancak X. tropicalis embriyolar X sonra dört kat daha küçüktür embriyolar laevis. Hem ihtiyaç kullanılan forseps ve tungsten iğneler ince olması. Mümkün olduğunda, X kullanın laevis.
X hassas görüntüleme laevis ve X. tropicalis sinir histogenez alanlar WM ISH disseke nöral tüp histolojik düz montajını kullanılarak elde edilebilir. Bu teknik X'te başarıyla gerçekleştirildi evre 26 ila embriyolar laevisevre 45 (Şekil 1) ve X üzerinde tropicalis 45 8,33 sahneye sahneye 30 embriyolar. Eski embriyolar daha sonra genç embriyoları incelemek için daha kolaydır. Bu teknik gerçekleştirmek kolaydır. Farklı gelişme aşamalarında nöral tüpler üzerinde gen ekspresyonu, ayrı ayrı ya da bir arada, analiz edilmesini sağlar. Bu protokol sayesinde diğer bir nöral tüpün bir tarafı karşılaştırmak kolaydır. Bu Xenopus GOF ve LOF deneylerinde yararlıdır. Nöral tüp enjekte tarafında gözlenen kusurlar doğrudan kontrol tarafında gözlenen normal gelişimsel olaylar ile mukayese edilebilir. Bu strateji, X. GOF ve LOF fenotipleri analiz etmek için kullanılmıştır laevis 8,33 embriyolar. Bu protokolde önemli bir adım embriyonik dokuların doğru tespiti olduğunu. Eksik tespit nöral tüp ektoderm verimli çıkmasını engeller. Nöral tüp öncesi diseksiyonu oturma içinde aşılmasını kolaylaştıranu sondaları. Ancak bir kez izole, o sinir tüpleri kaybetmek kolaydır. Herhangi kaybını önlemek için ISH prosedürü sırasında embriyonun kısmını tutmak için tavsiye edilir.
Tüm bu deneyler için kullanılan embriyolar sağlam olması ve iyi iyileşmek için gereken gerekir. Sağlıksız embriyoların herhangi toplu atın. Evre 13 ve evre 15 arasında komisyonlarda ve aşı eksplantlar incelemek amacıyla bu X. büyümek mümkün (12-18 ° C ve 18-20 ° C) çeşitli sıcaklıklarda eksplantlar ve embriyolar laevis. Kayda değer X. Embriyonik hücreler herhangi bir harici bir besin ilavesi olmadan birkaç gün boyunca hayatta kalma sağlayacak kadar yumurta sarısı içeren laevis. , Embriyo, AC veya eksplant herhangi bir transfer prosedürü embriyonik dokulara zarar değil dikkatli yapılmalıdır. Bu Gerekirse ucunda bir uç kesim ile plastik transfer pipet veya mikropipet ya kullanılması tavsiye edilir. Burun ucunun çapı embriyo boyutu veya eksplant boyutuna ayarlanır, transfer edilecek.Bu kayda değer olduğunu% 0.1 BSA çözeltisi ile kaplama pipetler plastik doku küçük parçalara yapışmasını önler.
AC eksplantlar zorla gen ekspresyonu yoluyla ya da bir zaman ve uzay-kontrollü bir şekilde dış faktörlerin maruz kalma ile programlanabilir. Biz eksplant ve boncuk arasındaki doğrudan temas yoluyla yerel indüksiyon sağlayan bir teknik açıklar. Gerekirse haplar ayrıca forseps kullanılarak fragmanlara ayrılabilir. Diğer daha önce tarif edilen stratejiler ile karşılaştırıldığında, bu teknik olarak saf faktörlere kesin bir zaman penceresinde, tek başına ya da kombinasyon halinde, yerel indüksiyon test edilmesine izin verir.
Hücre ayrılma ve yeniden örgütlenme 34 daha önce tarif edilen yaklaşımı kullanarak, bu sıkıştırılmış ve karışık AC eksplantlar 8 hücre motilite kapasiteleri hücre ayrımı davranışları ve kompartman sınırlarının oluşumunu belirlemek mümkündür. Hücre ayrılma sürecinin az 15 dakika içinde başlar. Tir tir titremeye kaçınıng ayrılma aşamasında plaka hücreleri kaybını önlemek için. AC pigmentli katmanlar iyi ayırmak yok. Bu ayrışma aşamasında bunları kaldırmak için tavsiye edilir. AC pigmentli katmanlarla bir çift yeniden birleştirilmiş eksplant bırakılır. Bu grefti görselleştirmek yardımcı olur. Daha sonra gelişim aşamalarında analizi ile karışmaz.
Bir nöral plak detaylı içine bu yazıda bir protokol karışık eksplantlar nakli. Xenopus embriyolarda, nöral plak evre 13 ve evre 15. Bu aşamalar neuroepithelium içinde nakil için bu nedenle uygun arasında açıktır. X. yapışkan özellikleri zamanla değişiklik dokuları laevis. Benzer bir gelişim aşamasında, bir konakçıya AC eksplantlar graft önemlidir. Erken gelişim aşamalarında, X. Son derece hızlı 3/4 NAM onarım yetiştirilen embriyolar laevis. Bazı embriyolar vitellin membran çıkarılması sırasında zarar görmüş ise 15 dakika beklemek yararlı olabilir,bu iyileşme sürecinin gerçekleşmesi için gerekli zamandır. Ekleme aşılı konak doku üzerine cam lamel bir parça koyarak tercih edilebilir, ancak bu bir gereklilik değildir. Iyileşme süreci tarafından üretilen kuvvet aşılı hücreleri a'ya olabilir. Greft bir lamel ile olduğu gibi, dış basınç ile içine zorlandığı zaman ev sahibi embriyo morfolojisi daha iyi korunur. Greft başarısını değerlendirmek için, bir floresanlı işaret ley ic eksplantlar enjekte edilebilir. Nöral tüp kapatana kadar aşılı embriyonun içinde floresan hücrelerin varlığı görüntülenebilir. AC kültür aşılama deneylerinde önemli dezavantajı bakteri ya da mantar kirlenme frekansıdır. Protokolün her adımında çanak kirlenmesini önlemek için mümkün olduğunca sık temiz veya steril malzeme ve steril çözümleri kullanın. Aşılanmış embriyo uzun vadeli kültürü için her antibiyotik ve 15 ° C arasında bir sıcaklık kullanılır. AC eksplantlar veya agaroz ile embriyoların uzun süre temasından kaçınınız. Biz gözlemlemebu eksplant ömrünü azaltabilir olduğunu ed. Aşılama tekniği güçlü ama zaman alıcıdır. Bu onunla kader tayini ipuçları için ekran, ama önceden seçtiğiniz doku üzerinde yeterli bilgi elde etmek tavsiye edilmez.
Geleneksel avantajları yanında, Xenopus son genetik gelişmeler bu yolunu açtı model sistem derin RNA sıralama ve kromatidi Immunoprecipitation-sıralama (ChIP-seq) 5,35 ile büyük ölçekli genomik analizi kullanılarak gen düzenleyici ağlar keşfetmek için. Mükemmel RNAseq ve erken embriyonik gelişmeyi kapsayan Chip-Seq referans veri setleri vardır. ChIP seq analizi sorunlardan biri malzeme büyük miktarda toplamak için ihtiyaç vardır. AC eksplantlar programlanması belirli bir nöral dokunun büyük bir miktarda üretimine izin verir, ve kısmen, en azından, bu teknik limiti aşmak için yardımcı olur.
Gelişimsel programlar altında yatan nöral tüp organıogenesis büyük ölçüde, özellikle omurgalılarda, korunmaktadır. Amfibileri kullanılarak elde Bilgi omurgalı gelişimi 25,32,36-38 altında yatan hücresel ve moleküler süreçler anlayış yardımcı olur. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) alanında son gelişmeler rejeneratif tıp ve ilaç keşfi araştırmaları için ağ geçitleri açtı. iPSCs transkripsiyon faktörlerinin bir kombinasyonu kullanılarak somatik hücrelerden programlanır. Kök hücrelerin programlama ipuçları arama çalışmaları devam etmektedir. Deneyler, ilaç taraması kullanılabilecek in vitro nöral türetilmiş hücre türleri oluşturmak için bir ortalama sağlar Burada tarif eder. Onlar da iPSCs 39,40 daha fazla yeniden programlama için kullanılabilir nöral kaderi belirleyicileri test etmek için ucuz ve hızlı bir yol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
