Introduction
El sistema nervioso de los vertebrados emerge de la placa neural como una capa homogénea de células neuroepiteliales. La comprensión de cómo se inducen los programas de desarrollo, codificados, y establecieron durante la regionalización de la placa neural es, en la actualidad, una meta importante en la biología del desarrollo. En comparación con otros sistemas, el embrión Xenopus experimentalmente susceptible es un modelo de elección para el análisis de los primeros pasos de 1,2 desarrollo neural. Es fácil de obtener un gran número de embriones, y el desarrollo externo da acceso a los primeros pasos de neurulation 3. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) el desarrollo embrionario. Micro-inyección de ARNm o morfolinos (MO), incluyendo OMs inducibles, junto con herramientas bioquímicas y farmacológicas, permite ganancia de función (GOF) y pérdida de función (LOF) y la alteración específica de las vías de señalización 4,5 controlada. El blastocoel techo ectodermo, situado alrededor del polo animal de una blástula, o un embrión gástrula muy temprano, y se refiere como el "Cap Animal '(AC), es una fuente de células pluripotentes que puede ser programado por la manipulación de la expresión génica antes de la explantes preparación. En este manuscrito son protocolos detallados para utilizar X. explantes laevis AC para poner a prueba in vitro e in vivo mecanismos moleculares y procesos celulares desarrollo neuronal subyacente.
Una técnica se presenta, lo que permite la observación multa de patrones de expresión génica en un tubo neural renacuajo Xenopus, un paso preliminar en la identificación de señales de determinación de destino. Considerando que la observación de los tejidos planos montado se utiliza comúnmente en el estudio de embriones de pollo 6, no ha sido descrito adecuadamente en Xenopus. La manipulación de la expresión génica mediante la inyección de ARNm sintético o MO en los blastómeros de 2 o 4 embriones en fase celular permite la programación de ACexplantes 4. Por ejemplo inhibición de la vía proteína morfogenética ósea (BMP) por la expresión del anti-factor de BMP Noggin, da una identidad neural a las células de CA 3. El protocolo se detalla para llevar a cabo la exposición local y controlada en el tiempo de los explantes de corriente alterna a las señales extrínsecas a través de contacto directo con una perla de resina de intercambio aniónico. Finalmente se describe una técnica para el ensayo de características de desarrollo de los progenitores neurales in vivo mediante trasplante de explantes mixtos preparados a partir de células distintas programado disociados y re-asociados.
El embrión de rana es un poderoso modelo para estudiar el desarrollo neuronal temprana de los vertebrados. La combinación de la manipulación de la expresión génica con la explantación cultivos in vitro proporciona información importante en el estudio de la regionalización neuroepitelio, la proliferación, y la morfogénesis 7-12. La programación de los explantes de CA permitido el desarrollo de un corazón funcional ex vivo 13,14. El usoexplante de injerto 15 condujo a la identificación del interruptor transcripcional mínimo inducir el programa de diferenciación de la cresta neural 16. La zona limitante intratalámica (ZLI) es un centro de señalización que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar el crecimiento y la regionalización del prosencéfalo caudal. Cuando se expone continuamente a Shh, las células neuroepiteliales coexpressing los genes del factor de tres de transcripción - BARH-como homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) y iroquois-3 (Irx3) - adquieren dos características del compartimento ZLI: la competencia para expresar shh, y la capacidad para segregar a partir de células de la placa neural anterior. Como un sistema modelo, la inducción de un destino ZLI en células neuroepiteliales será presentado 8.
Estos protocolos tienen por objeto proporcionar y herramientas eficientes simples, baratas para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar el mec fundamentalhanisms de comportamientos clave de células neuronales. Estos protocolos son muy versátiles y permiten la investigación de una amplia gama de señales de determinación neuronales intrínsecos y extrínsecos. Permite a largo plazo en el análisis in vivo de compromiso de linaje neuronal, interacciones inductivas y comportamientos celulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos cumplen con la regulación nacional y europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento.
1.-montaje plana de Xenopus laevis renacuajos anterior Tubo Neural Después de todo el montaje hibridación in situ
- Obtener X. laevis embriones según los procedimientos estándar de 4 y los años hasta que alcancen neurula etapa 26 y más años (según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17.
- Fix X. laevis renacuajos mediante su incubación en una solución de 4% de paraformaldehído (PFA). Roca y rotar los embriones en un vial de vidrio de 2 ml, de 1 a 1.5 hr a RT durante la etapa 26 a la etapa 38 embriones, 2 horas a RT para los embriones en etapas posteriores.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxico por contacto y un posible carcinógeno. Debe ser manipulado bajo una campana.
NOTA: Uno X. laevis cría espor lo general fijado en un vial de vidrio de 2 ml, pero un vial de vidrio más grande puede ser utilizado. - Lavar los embriones en el mismo vial utilizando 1x PBS con 0,1% de Tween (PBT), 3 min a RT, dos veces.
NOTA: A menos que de otro modo especificar el PBS utilizado es con o sin calcio y magnesio. - Deshidratar los embriones en 100% de metanol (MeOH) durante al menos 12 horas a RT en el mismo vial. Cambie el MeOH 100% al menos dos veces bajo el capó con una micropipeta de plástico.
NOTA: El MeOH se vuelve ligeramente amarillo como lípidos disueltos en ella. Precaución al MeOH es tóxico por inhalación y debe manipularse bajo una campana. - Rehidratar los embriones utilizando el mismo vial a través de una serie graduada de baños de MeOH: MeOH 75% en PBS, MeOH 50% en PBS, MeOH 25% en PBS, PBS dos veces, cada baño de 5-10 minutos a TA. Las soluciones de MeOH se cambian bajo el capó con una micropipeta de plástico.
- Usando una pipeta de plástico, la transferencia del embrión a ser disecado en una placa de Petri de 60 mm lleno hasta el tope con PBT. El uso de dos pinzas finas cuidadoeliminar totalmente los ojos mediante la inserción de uno pinzas finas entre los ojos y el tubo neural, a nivel del tallo óptico. Separe los ojos del tubo neural. Introducir con cuidado la pinza por debajo del ectodermo que recubren el tubo neural. Con cuidado, retire el ectodermo partiendo de detrás de la cabeza y lo descarta.
- Realice una ISH doble o individual utilizando digoxigenina-etiquetados o sondas marcadas con fluoresceína como anteriormente descritos 18,19.
- Después de la ISH transferir los embriones de un nuevo 60 mm placa de Petri llena hasta el tope con PBT con una pipeta de plástico.
- Usando unas pinzas finas separar cuidadosamente el tubo neural del resto del embrión. En esta etapa, el tubo neural anterior se separa del tubo neural posterior. Separar cuidadosamente restantes partes del ectodermo que recubren el tubo neural, la notocorda que se adjunta suelta debajo del tubo neural, las vesículas óticas y restantes partes del mesodermo. Asegúrese de que el tubo neural está desprovisto de cualquier apéndiceen este punto.
NOTA: Para evitar daños en el tubo neural realizar todas las transferencias de tubo / embrión neuronal con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta si es necesario con un corte de punta en su extremo. El diámetro del extremo de la punta se ajusta al tamaño del tubo neural. - Transferir el tubo neural diseccionado (ver nota paso 1,9) en un tubo de 1,5 ml lleno con 50% de glicerol diluido en PBS. Espere hasta que los tubos neurales han caído a la parte inferior de la solución de glicerol, por lo general O / N a 4 ° C.
- Retirar la solución de 50% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000 y añadir en el mismo tubo de 1,5 ml de una solución de 90% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000. Espere hasta que los tubos neurales caen hacia el fondo de la solución de 90% de glicerol / PBS, por lo general O / N a 4 ° C.
NOTA: para almacenamiento a largo plazo, utilizar 90% de glicerol / PBS más antibióticos para prevenir el desarrollo de bacterias. - Transferir los tubos neurales en una placa de vidrio, o un portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico.
- Dissecta de los tubos neurales a lo largo de la dorsal y ventral líneas medias utilizando agujas de tungsteno. Durante ese paso de los tubos neurales se mantienen en 90% de glicerol / PBS.
- Montar los dos lados del tubo neural en 90% de glicerol / PBS utilizando anillos de refuerzo cubiertos con un cubreobjetos de vidrio.
- Fijar los cubreobjetos con barniz y mantener a 4 ° C.
2. Cap Animal explantes de inducción usando perlas de resina de intercambio de aniones
- Transferir 100 l de perlas de resina de intercambio aniónico en un tubo de 2 ml utilizando una micropipeta P1000. Lavar las perlas por lo menos cinco veces consecutivas con agua destilada estéril. Permitir que las perlas se sedimentan en la parte inferior del tubo y reemplazar el agua destilada estéril utilizando una micropipeta P1000. No toque las bolas.
- Deje que los granos en remojo O / N en un tubo de 2 ml llena de agua destilada estéril con albúmina de suero bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C.
- Dos horas antes de la recogida de las CCAA, coloque la mitad de los granos en un nuevo 1,5 mltubo usando una micropipeta P1000. Reemplazar el agua destilada estéril con 500 l de medio que contiene la molécula a ensayar por su potencial inductivo, o sabe que inducen un destino específico. Mantenga la otra mitad de las perlas, ya que se pueden utilizar como un control negativo.
- Incubar las perlas a 4 ° C durante al menos 2 hr.
- Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico y realizar todas las transferencias de CA con una micropipeta.
- Transferencia de embriones o blástula gástrula muy tempranas en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
NOTA: Los embriones en desarrollo a los 12 ° C blástula y gástrula etapas alcance de 20 a 24 horas. - Retirar membrana vitelina del embrión utilizando pinzas 20 como se describió anteriormente. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana, lentamente despegarlo del embrión. Realice este procedimiento en la venlado del embrión tral (vegetal). No dañe el lado animal del embrión.
- Aislar pequeñas CCAA como se describió anteriormente 21. El polo animal es parte pigmentada del embrión. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC contiene sólo las células ectodérmicas. Asegúrese de que el tejido es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis.
- Coloque cada CA en unos Terasaki placas de múltiples pocillos en 0.5x modificados de Barth salinos (MBS) 4. Coloque el AC en el pozo con su lado animal pigmentada abajo, en contacto con el fondo redondo del pozo.
NOTA: pipetas de recubrimiento con una solución de BSA 0,1% impide la adherencia de pequeños trozos de tejido adhesivo para el plástico. - Coloque una perla en cada tapa usando una micropipeta P20. Si es necesario, el uso de fórceps para colocar cuidadosamente la perla en el centro de la tapa.
NOTA: Cuando empapado en un medio acondicionado, las perlas son de color de rosa. Seleccione la mayor cantidad de coperlas lored. - Se incuba a RT (18 a 22 ° C) durante 6 horas sin mover la placa de múltiples pocillos Terasaki. El cordón se adhiere a la AC en menos de 2 hr.
- Coloque la placa de múltiples pocillos Terasaki en la parte superior de papeles empapados en agua. Cubra la placa con un recipiente de plástico.
NOTA: Este 'cámara de humedad' evita la evaporación prematura de los pozos. - Cultura de la CCAA en 0.5x MBS o 3.4 NAM (véase el paso 4.1) en la cámara de humedad a 15-20 ° C hasta que los embriones hermanos han llegado a la etapa correcta para probar el efecto de su factor.
- Fijar las CCAA durante 1 hora en el recién preparada PFA al 4%. Deshidratar las CCAA en 100% MeOH como se ha descrito previamente (Paso 1.4).
3. Animal Cap Disociación Celular y reagregación antes del injerto en un Xenopus laevis neurula
- Escudo placas de Petri (60 mm) o 12 pozos placas con 3% de agarosa en agua estéril o en PBS sin calcio y magnesio. Agregar suficiente agarosa para cubrir la bottom de la placa de Petri o el pozo. Pre-calentar las placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, almacenado las placas durante dos días a 4 ° C para evitar la deshidratación.
- Preparar libre de calcio solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) y solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. NOTA: la solución de CaCl 2 no puede esterilizarse en autoclave.
- Llene la agarosa recubiertas de bien en la parte superior con solución salina libre de calcio de Holtfreter.
- Prepare blástula o embriones gástrula muy tempranas para aislar sus CCAA como se describió anteriormente (pasos 2,5 a 2,7).
- Aislar al menos 15 o hasta 30, pequeña CCAA 21. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC sólo contiene células ectodérmicas y por lo tanto es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis.
NOTA: El polo animal es la Embryparte pigmentada del o. - Transferencia de las CCAA en una agarosa recubiertas de bien lleno hasta el tope con-calcio libre de solución salina de Holtfreter. Coloque las CCAA con el frente de su lado pigmentado hacia arriba.
NOTA: El proceso de disociación comienza rápidamente en libre de calcio salina de Holtfreter. - Espere unos minutos para que las células empiezan a disociar. Observar esto a través de la desagregación de los tejidos. Usando unas pinzas finas, separar la capa pigmentada desde el resto de la AC y desecharlos con una micropipeta P20. Completar el proceso de disociación celular indica separación de las células entre sí.
NOTA: Uno o dos capas pigmentadas se pueden dejar en el explante re-agregado para ayudar a la visualización durante el injerto. - Centrar las células usando movimientos circulares de la placa. Usando una micropipeta P1000 retire con cuidado todo medio posible. Tenga cuidado de no tocar las células.
- Añadir 1 ml de solución salina de Holtfreter con el calcio para el pozo. Transfiera las CCAA disociadasen un tubo de 1,5 ml.
NOTA: 2 ml tubos no se pueden utilizar debido a su fondo redondo. - Sedimentar las células por centrifugación, 5 min a una velocidad máxima de 2000 rpm para una centrífuga de mesa (500 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta P1000.
- Añadir a las células disociadas 20 l de solución salina de Holtfreter con calcio (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5.
- Mantenga las CCAA disociado, de 3 a 6 horas a temperatura ambiente (18-22 ° C).
NOTA: Este es tiempo necesario para que las células se re-agregado. El re-agregación es visible como las células forman una pequeña bola en la parte inferior del tubo. - Separar el explante cuidadosamente de la parte inferior del tubo mediante la adición de 1 ml de 0.5X MBS o de 1 ml de 3/4 NAM (véase el paso 4.1). Transferir el explante en una placa de un-revestido con una pipeta de transferencia de plástico.
- Etapa los explantes utilizando sus hermanos de control. Para utilizar la cultura antibióticos a largo plazo: kanamycin (50 g / ml), ampicilina (50 mg / ml) y gentamicina (50 mg / ml).
4. Injerto de Animal Caps explantes en la placa neural de X. laevis Embriones
- Preparar 3 cuartos NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO 3, 0,2x PBS, 50 mg / ml de gentamicina). No mantener durante más de 1 semana para la disección y se almacena a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo).
- Placas de Petri Escudo (60 mm) con un 3% de agarosa en 3.4 NAM en la que los pequeños agujeros se han realizado utilizando un molde de silicona, o la tapa de una raqueta de tenis de mesa.
NOTA: La agarosa cubre la parte inferior de la placa de Petri. Deje algo de espacio para que la placa de Petri se llene de 3/4 NAM. Alternativamente hacer platos de disección con la no-sequedad plastilina. Dentro de la arcilla, apretar los embriones ligeramente durante el procedimiento de disección. Dig pequeños agujeros en elagarosa utilizando pinzas redondeadas Este 'plato de disección' ayuda a mantener los embriones durante el procedimiento de disección. - Recoger herramientas de disección: pipetas de transferencia de plástico, un "cuchillo de la ceja '(hecho con pelo de las cejas embebidos en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio) 22, dos pinzas de disección finas, micropipeta P1000 y consejos, un stereosmicroscope con magnificación 8-40X, una fuente de luz brillante con guías de fibra óptica. Mantenga todas las herramientas de disección limpia; después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez con etanol al 100% y deje secar. Almacene lejos del polvo y si autoclave necesarias las herramientas de disección metal.
- Deje que la disociada y re-agregado CCAA (protocolo 3), y sus hermanos X. embriones laevis desarrollan hasta alcanzar la etapa 13 (neurula) según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17. Para el trasplante dentro de la etapa placa neural 13 a la etapa 15 embriones se utilizan.
- Llevar a cabo todasetapas subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico.
- Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA. Retirar membrana vitelina del embrión a lo descrito previamente 20. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana con firmeza, lentamente despegarlo del embrión.
NOTA: Realice este procedimiento en la parte ventral (vegetal) del embrión. No dañe los embriones placa neural. Si los embriones han sido dañados durante la etapa de eliminación de la membrana vitelina, la transferencia de los embriones en una placa de Petri de 60 mm que contiene 3/4 NAM utilizando una pipeta de transferencia de plástico y esperar 15 minutos, un tiempo suficiente para el proceso de curación que se produzca. - Rellene el plato de la disección a la cima con frescos 3.4 NAM.
- Con una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones sin su membrana vitelina en el plato de la disección. Coloca los embriones lado dorsal arriba enlos pozos. Durante el proceso de transferencia no permita que el embrión para entrar en contacto con la interfase aire-líquido desde X. laevis se lisan por la tensión superficial.
- Transferir el explante de CA para ser injertado en la placa de disección con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta P1000. Una vez que la pipeta está dentro del líquido, permitir que los explantes a hundirse lentamente hacia abajo por la gravedad, o empujar con mucha suavidad.
- Mantener los embriones con fórceps redondeadas. Con el cuchillo de la ceja hacer una incisión en la placa neural donde va a injertar pieza de su explante.
NOTA: En la etapa 14 la curvatura anterior de la placa neural se puede utilizar como punto de referencia, que marca el territorio diencéfalo (Figura 4). - Corte un pequeño trozo de neuroepitelio, utilizando pinzas redondeadas y un knive ceja. Corte un pequeño trozo del explante con el cuchillo de la ceja.
NOTA: La pieza de explante debe ser aproximadamente del mismo tamaño y forma que la zona de ablación neuroepitelio. Coloque la pieza de explante en la incisión neuroepitelio usando el cuchillo ceja y unas pinzas finas. Asegúrese de que el explante se une rápidamente al embrión. - Alternativamente coloque un pedazo de cubreobjetos de vidrio en el embrión injertada para mantener el injerto en su lugar. Para ello, cortar un cubreobjetos de vidrio fino en pedazos muy pequeños utilizando pinzas gruesas. Asegúrese de que el tamaño es de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumerja las piezas en una placa de Petri que contiene 3/4 NAM o PBS utilizando fórceps. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarlo. El embrión será un poco aplanada.
- Espere al menos 30 minutos sin moverse o sólo mover la placa de disección con suavidad. Deje el embrión recuperar durante 30 min a 2 hr y retire con cuidado el cubreobjetos si es necesario. Pipetear con cuidado los embriones injertadas en un plato limpio lleno de 03.04 NAM, usando la pipeta de transferencia de plástico.
NOTA: Injertado embriones tienden a desarrollar bacterias o contaminación de hongos. Para largo plazo cULTURA usar antibióticos: kanamicina (50 mg / ml), ampicilina (50 g / ml) y gentamicina (50 mg / ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En base a consideraciones morfológicas en diferentes especies, las manipulaciones embriológicas, y el patrón de expresión de genes reguladores, un modelo conceptual sostiene que la placa neural se divide en segmentos transversales y longitudinales que definen una rejilla de desarrollo generar campos histogenic distintas. En la placa neural, los primordios del prosencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y la médula espinal están todos ya establecidos a lo largo del eje antero-posterior (AP) durante la gastrulación (revisado en 23 a 25). Durante la neurulación, los campos histogenic pueden ser detectados como dominios espacialmente restringidas de la expresión génica. Basado en los patrones de expresión de genes reguladores, el primordio del cerebro anterior se divide en seis segmentos transversales que generan campos histogenic distintas llamadas prosomeres (P). Cada prosomere se divide en una ventral (basal) y una (alar) parte dorsal (Revisado en 26,27). En los anfibios, el prosomere 2(p2) da lugar a la epitálamo y el tálamo y a su organizador la Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (revisado en 28,29).
En la Figura 1 se muestran el montaje plana de X. laevis y X. tropicalis anterior tubos neurales en las etapas 30, 32, y 35 después de WM-plato. WM-ISH se realizaron según el protocolo 1, utilizando sondas para los factores de transcripción fezf2 que marca el telencéfalo y p3, barhl2 que marca p2, los dobladillos corticales y del mesencéfalo, iroquois-1 (Irx1) y iroquois-3 (Irx3) que, respectivamente, marca de caudal p2 y p2 alares y para el shh morfógeno que marca el ZLI, el cerebro anterior y cerebro medio basal (Figura 1E). Un análisis comparativo de los diferentes patrones de expresión de genes revela que el límite anterior de barhl2 expresión p2 hace tope con el límite de caudal de expresión fezf2 en p3 (Figura 1A). Irx3 es co-expresada con shh en el futuro ZLI (Figura 1B). Dentro de dominio de expresión Irx1 P2 es complementaria a la de shh (Figura 1C) 8. El patrón de expresión de barhl2 en X. tropicalis en la etapa 35 se muestra en la Figura 1D. Un diagrama esquemático de los territorios de expresión de estos genes en el cerebro anterior en desarrollo anfibio se proporciona en la Figura 1E.
Utilizando el protocolo 2 la capacidad de perlas de resina de intercambio de aniones empapados en Shh para inducir la expresión shh se investigó en explantes de ACS. X. laevis embriones fueron inyectados en los 4 blastómeras animales a las 4 y 8 células etapa con los ARNm que codifican para la anterior bocha inductor neuroepitelial junto con barhl2, otx2, Irx3 y GFP como un trazador de inyección. La expresión del factor anti-BMP Noggin inhibe la vía BMP y le da una identidad neural a las células de CA 3. Nos referimos a la CA expresando Noggin como Anteriorised Cap Animal (AAC). Explantes de techo blastocele se prepararon como se describe en el protocolo 2. La AACs se cultivaron durante 48 horas a 18 ° C en contacto con una perla de resina de intercambio aniónico empapado en un medio acondicionado (CM) que contiene, o no, la parte N-terminal secretada de el erizo morfógeno sónico de rata (N-Shh). La expresión de shh endógena se analizó por ISH (Figura 2). Se detecta expresión de Xenopus shh (Xshh) en las células en contacto con el cordón empapado en CM con N-Shh pero no en células en contacto con el cordón empapado en CM sin N-Shh (Figura 2B).
Utilizando el protocolo 3 la capacidad de los diferentes tipos de células para segregar de una another se investigó. X. embriones laevis fueron inyectadas en los 4 blastómeras animales a las 4 y 8 células etapa con los ARNm que codifica para la bocha con o sin Otx2, barhl2 y Irx3, como se indica, utilizando ßGal o GFP como trazadores (Figura 3A). Escenario 8/9 CCAA fueron disociadas y re-agregados para generar explantes compuestos por células neuroepiteliales mixtos que contienen tanto ßGal- y las células que expresan GFP. Los explantes se cultivaron durante reagregadas 48 horas a 18 ° C. actividad ßGal se reveló en rojo de acuerdo con la 30 (Figura 3A). El comportamiento de las células se observó siguiendo su localización dentro de los explantes de re-agregados. En explantes donde las células AACS se mezclan con las células que expresan Otx2 AACS (rojo), las células que expresan ßGal no segregan de las células que expresan GFP ambos tipos de células entremezcladas libremente (Figura 3B, 3C). En contraste, enexplantes donde las células (GFP) Otx2 expresan se mezclan con Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) células que expresan (ßGal), las células que expresan ßGal (rojo) forman parches cohesivos y no se extienden uniformemente dentro del explante re-agregado ( Figura 3D, 3E).
Utilizando el Protocolo nº 4, el comportamiento de las células AC programadas se investigó in vivo. X. laevis embriones fueron inyectados en los 4 blastómeros animal en el 4 y 8 de células etapas con mRNAs que codifican para noggin con Otx2 ya sea solo o junto con barhl2 y Irx3. ßGal se utilizó como trazador. En paralelo, los embriones fueron inyectados de manera similar con ARNm que codifican para noggin y la parte secretada N-terminal de la Shh morfógeno de rata (N-shh). En la etapa 8.9, explantes AC fueron disociadas e inmediatamente re-agregados para generar explantes mixtos compuestos por neuroepitcélulas helial ya sea expresando N-Shh y Otx2, o expresar N-Shh y Otx2, Barhl2 y Irx3 (BOI3). Pequeñas piezas de los explantes mixtos se injerta en la placa neural de X. laevis embriones en la etapa 14. Las células injertadas fueron marcados con tinción ßGal (rojo). En la etapa 35 la expresión de shh endógena se analizó por ISH. Cuando injertados en la placa neural anterior de X. laevis embriones, explantes mixtos compuestos por BOI3 y N-Shh células que expresan desarrollaron dos características específicas de las células ZLI: las células injertadas expresan Xshh y segregados de células neuroepiteliales anteriores (Figura 3C). En contraste, cuando los explantes mixto compuesto de Otx2 - y N-Shh- que expresan las células se injertan en el X. laevis placa neural, las células injertadas no expresaron shh y no segregan a sus vecinos (Figura 3B) 8.
Figura 1. tubos neurales planos montados de X. laevis y X. tropicalis embriones todo el montaje doble ISH (A - D). WM-ISH se realiza utilizando fezf2, barhl2, Irx1, Irx3 y shh como sondas en (A - C) X. laevis embriones en las etapas 30, 32, y 35 y (D) X. tropicalis embrión en la etapa 35, como se indica. Los tubos neurales de embriones representativos se diseccionaron y plana montada como se describe en el protocolo 1. Los tubos neurales disecados se muestran a partir de una vista lateral, dorsal hacia arriba, anterior izquierda. Los marcadores y las etapas se indican. Los límites rostral y caudal de p2 se indican con flechas. (AC) La barra de escala representa 0,5 mm. (D) Los scale barra representa 0,1 mm. . (E) Esquema de los marcadores del cerebro anterior en ST.30 dominio de expresión barhl2 está indicada en líneas rayadas; Ámbito de la expresión se muestran para fezf2 (rosa), shh (rojo), Irx3 (amarillo) y Irx1 (verde). p significa prosomere. La glándula pineal se encuentra en la parte superior de p2 se muestra. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La inducción de la expresión de shh en explantes programados a través de contacto con perlas de resina de intercambio de aniones. CCAA pequeños se preparan a partir de embriones inyectados con ARNm que codifica para la bocha, barhl2, Otx2 y Irx3, con GFP como trazador. AAC destaca fo Anteriorised Animal Cap. Los explantes AAC que expresan Barhl2, Otx2 y Irx3 (AAC BOI3) se cultivan durante 48 h en contacto con un cordón empapado en un medio acondicionado (CM), ya sea que contiene N-Shh, o no, como se indica. Los explantes son analizados por ISH para la expresión de Xenopus (X) shh. La barra de escala representa 0,5 mm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis del comportamiento de la segregación de células en explantes re-agregados. (A) X. laevis embriones son inyectados con ARNm que codifica para la bocha, Otx2, barhl2 y Irx3 como se indica. ßGal y GFP se utilizan como trazador. En la etapa se preparan 8/9 pequeñas ACs , Disociado y re-agregado para generar hechos de explantes / ßGal tipos de células mixtas GFP. Los explantes se cultivan durante 48 horas a 18 ° C y la actividad ßGal se revela (rojo). (B - E) explantes representativas compuestas de células mixtas que expresan proteínas como se indica se muestran. AAC significa Anteriorised Animal Cap. (B, C) células que expresan CCAA Noggin y Otx2 (ßGal) repartidas aleatoriamente cuando se mezcla con Noggin células expresando CCAA (GFP). (C) Vista ampliada de (B). Células (D) AACS expresan Barhl2, Otx2 y Irx3 (BOI3) (ßGal) se reagruparon y segregados de células que expresan Otx2 AACS (GFP). (E) Vista ampliada de (D). (B, D) La barra de escala representa 0,5 mm. (C, E) La barra de escala representa 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Programado explantes exhiben sus características de desarrollo cuando se injertan en la placa neural de un embrión etapa 14 (A) Esquema experimental. AACs se preparan a partir de embriones inyectados con ARNm como se indica. En la etapa 8/9 células del techo del blastocele se disocian y re-agregados para generar explantes hechos de tipos de células mixtas que expresan ßGal (rojo). Los explantes se cultivan hasta que sus hermanos llegaron a la etapa 14. Un pequeño trozo de explante mixto (rectángulo verde) se pone en una incisión dentro de la placa neural anterior. Operado embriones se cultivan hasta la etapa 35. embriones operados son analizados por WM-ISH usando X. laevis shh (Xshh) como sonda. actividad ßGal se revela en acc rojaording a 30. (B, C) Los lados injertadas de la etapa 35 tubos neurales representativos se muestran, la vista lateral, dorsal hacia arriba, anterior izquierda. (B) injertado con AACs mixtos expresan Otx2 y N-Shh. (C) injertado con AACs mixtas que expresan Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) y N-Shh. Células injertadas se indican con una estrella roja. La estrella de color rosa indica el diencéfalo prospectivo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desarrollo neuronal es orquestada por una compleja interacción entre los programas de desarrollo celulares y señales de los tejidos circundantes (revisado en 3,31,32). Aquí se describe un conjunto de protocolos que se puede utilizar en X. laevis embriones para explorar factores extrínsecos e intrínsecos que intervienen en la determinación del destino neural y la morfogénesis neuronal in vitro e in vivo. Estos protocolos pueden ser utilizados como tales en X. embriones tropicalis, sin embargo X. embriones tropicalis son cuatro veces más pequeño que X. laevis embriones. Tanto las pinzas y las agujas de tungsteno utilizados necesidad de ser más fino. Cuando sea posible, utilice X. laevis.
La visualización precisa de X. laevis y X. campos histogenic neuronales tropicalis se pueden lograr mediante el montaje plano histológico de tubos neurales disecados de WM-ISH. Esta técnica se realizó con éxito en X. laevis embriones de la etapa 26 aetapa 45 (Figura 1) y en X. tropicalis embriones de la etapa 30 a la etapa 45 de 8,33. Embriones de más edad son más fáciles de diseccionar embriones entonces más jóvenes. Esta técnica es fácil de realizar. Permite el análisis de patrones de expresión de genes, por separado o combinados, en los tubos neurales en diferentes etapas de desarrollo. Con este protocolo es fácil de comparar un lado de un tubo neural con la otra. Esto es muy útil en Xenopus GOF y LOF experimentos. Los defectos observados en la parte inyectada del tubo neural se pueden comparar directamente con los eventos de desarrollo normales observadas en el lado de control. Esta estrategia se ha utilizado para analizar GOF y LOF fenotipos en X. laevis embriones 8,33. Un paso importante en este protocolo es la correcta fijación de los tejidos embrionarios. Una fijación incompleta impide la separación eficiente del ectodermo del tubo neural. El pre-disección del tubo neural facilita la penetración de en sitsondas u. Sin embargo una vez aislado, es fácil perder los tubos neurales. Es aconsejable mantener parte del embrión durante el procedimiento ISH para evitar cualquier pérdida.
Los embriones utilizados para todos estos experimentos tienen que ser robusta y la necesidad de sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Con el fin de diseccionar CCAA y explantes de injerto entre la etapa 13 y la etapa 15 es posible crecer X. laevis explantes y embriones a diferentes temperaturas (desde 12 a 18 ° C y 18-20 de ° C). X. Cabe destacar laevis células embrionarias contienen suficiente yema para permitir su supervivencia durante varios días sin la adición de cualquier nutriente externo. Para no dañar los tejidos embrionarios, cualquier procedimiento de transferencia de embrión, AC, o explante se tiene que hacer con cuidado. Es recomendable utilizar una pipeta de transferencia de plástico o micropipeta si es necesario con un corte de punta en su extremo. El diámetro del extremo de la punta se ajusta al tamaño del embrión, o el tamaño del explante, a transferir.Es digno de nota, pipetas de recubrimiento con una solución de BSA 0,1% evita la adhesión de pequeños trozos de tejido en el plástico.
Explantes de CA se pueden programar a través de la expresión génica forzado, o por medio de la exposición a factores extrínsecos de una manera tiempo y espacio controlado. Describimos una técnica que permite la inducción local a través de un contacto directo entre un explante y un cordón. Si es necesario las perlas pueden fragmentarse aún más el uso de fórceps. En comparación con otras estrategias descritas anteriormente, esta técnica permite el ensayo de inducción local con factores puros, solos o en combinación, en una ventana de tiempo preciso.
Utilizando un enfoque descrito previamente de la disociación celular y la re-asociación 34, es posible investigar las capacidades de la motilidad celular, los comportamientos de segregación celular, y la formación de límites de compartimentos en intercaladas y AC mixta explantes 8. El proceso de disociación celular se inicia en menos de 15 min. Evite shaking la placa durante la etapa de disociación para prevenir la pérdida de células. Las capas pigmentadas de CA no se disocian también. Se recomienda para eliminarlos durante la etapa de disociación. Un par de AC capas pigmentadas se dejan en el explante re-agregado. Le ayuda en la visualización del injerto. No interfiere con el análisis en las etapas de desarrollo posteriores.
En este manuscrito un protocolo de trasplante explantes mixtos en una placa neural se detalla. En embriones de Xenopus, la placa neural está abierto entre la etapa 13 y la etapa 15. Estas etapas son, por tanto, adecuado para el trasplante en el neuroepitelio. X. laevis tejidos propiedades adhesivas cambian con el tiempo. Es importante para injertar explantes de CA en un anfitrión una etapa de desarrollo similar. En las etapas tempranas del desarrollo, X. laevis embriones cultivados en 3/4 reparación NAM extremadamente rápido. Si algunos embriones han sido dañados durante la extracción de la membrana vitelina, puede ser útil que esperar 15 min,que es el tiempo necesario para el proceso de curación que se produzca. La inserción puede ser favorecida por poner un trozo de cubreobjetos de vidrio en el tejido huésped injertado, pero no es un requisito. La fuerza generada por el proceso de curación puede extruir las células injertadas. Morfología del embrión de acogida se conserva mejor cuando el injerto se ve obligado en ella con presión externa, como con un cubreobjetos. Para evaluar el éxito del injerto, un trazador fluorescente se puede inyectar en los explantes. La presencia de células fluorescentes en el embrión injertado puede ser visualizado hasta que cierre el tubo neural. El gran inconveniente de la cultura y de injerto experimentos AC es la frecuencia de bacterias o contaminación de hongos. Utilice soluciones de materiales estériles y limpios o estériles tan a menudo como sea posible para evitar la contaminación del plato en cada paso del protocolo. Para el cultivo a largo plazo de los embriones injertados siempre usar antibióticos y una temperatura de 15 ° C. Evite el contacto prolongado de los explantes de CA o embriones con agarosa. Nos Observed que puede disminuir la esperanza de vida del explante. La técnica de injerto es de gran alcance, pero lleva mucho tiempo. No es recomendable para la detección de señales de determinación de destino con él, pero para adquirir suficiente información sobre su tejido de elección de antemano.
Además de sus ventajas tradicionales, los avances genéticos recientes en Xenopus abrieron el camino para que este sistema modelo para estudiar las redes reguladoras de genes utilizando el análisis genómico a gran escala mediante secuenciación de ARN profunda y cromátida inmunoprecipitación-secuenciación (chip-ss) 5,35. Hay excelentes RNAseq y conjuntos de datos de referencia-Chip Sec cubren el desarrollo embrionario temprano. Uno de los inconvenientes de análisis-chip ss es la necesidad de recopilar gran cantidad de material. Programación de explantes de corriente alterna permite la producción de una gran cantidad de un tejido neural específica, y al menos en parte, ayuda a superar este límite técnico.
Los programas de desarrollo subyacente órgano del tubo neuralogenesis se conservan en gran medida, especialmente en los vertebrados. La información obtenida mediante los anfibios ayuda en la comprensión de los procesos celulares y moleculares que subyacen el desarrollo de vertebrados 25,32,36-38. Los recientes progresos en el ámbito de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ha abierto las puertas de enlace para la investigación en medicina regenerativa y el descubrimiento de fármacos. CMPI se programan a partir de células somáticas usando una combinación de factores de transcripción. La búsqueda de señales de programación para las células madre está en curso. Los ensayos se describen aquí proporcionan un medio para generar tipos de células neuronales derivadas in vitro que podrían ser utilizados en la detección de drogas. También proporcionan una forma barata y rápida para la prueba de los factores determinantes del destino de los nervios que se pueden utilizar para su posterior reprogramación de iPSCs 39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J.
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S.
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
