Abstract
一个强大的，低成本的分析设备应具有用户友好，快速，而且经济实惠。这样的设备也应该能够拥有稀缺的样品进行操作，并提供后续治疗的信息。在这里，我们证明基于棉花尿检的发展（ 即 ，亚硝酸盐，总蛋白，和尿胆素原测定），它采用一个侧流为基础的格式，并且价格便宜，容易制造，快速，并且可以被用来进行分析装置多个测试无交叉污染的担忧。棉是由与可以被利用为基于流的分析自然吸收性质的纤维素纤维。我们基于棉分析设备的简单而优雅的制作工艺在这项研究中描述。棉花结构和测试垫的配置需要的疏水性和各材料的吸收强度的优势。由于这些物理特性的，比色的结果可以持续粘附在测试垫。该器件使医生能够得到及时的临床信息，并显示出巨大的潜力，作为早期干预的工具。
Introduction
点护理的发展（POC）是价格实惠，功能强大且易于使用的当务之急是改善全球健康1,2诊断设备。特别是，设备由纤维素基材（ 如纸，丝，棉）提供，因为它们无处不在，承受能力，易用性，稳健性和能力，提供快速的结果3-7的低成本分析有前途的分析平台。
在这里，我们揭示了使用横向流动型格式尿检基于棉的分析装置的发展。这种基于棉分析设备提供了几个关键的优势，另一种检测方法：一）用最少的人的努力制作;二）成本低; ⅲ）将要使用的能力，以进行无交叉污染问题的多个，不同的测定; 。ⅳ）设备无关， 也就是说 ，要无额外的设备和/或电力运行的能力;并且，V）速度（比色分析可在10分钟内完成）。
这种基于棉的分析装置的结构可以分为四个部分：ⅰ）棉这是它的外部疏水层上天然疏水; ⅱ）棉即内部的亲水性和用作液体芯吸的输送通道;三）结合并压缩所用的棉花，但包含里钻出来的反应/测试垫放置孔复合膜;和，ⅳ）色谱纸检测垫，其上涂布/嵌入反应试剂，放置在棉（具体而言，在该空间钻出层叠膜），作为比色分析反应区的外表面上（ 即 ，亚硝酸盐，总蛋白，pH值，和尿胆素原测定）和结果的显示。
试验的基本机理如下。基于棉花分析装置，拿下那些通过部门穿透半路上行棉材料h的创建流动通道，允许样品流体到达所使用的反应垫。分析装置的吸收边缘浸入目标样品，随后溶液是沿从吸收端向测试焊盘（ 图1）的流体通道恶。因为测试垫的吸收强度比棉花时，由测试焊盘吸收溶液被牢固地容纳在测试垫纸内部，使得没有回流返回到流体通道，并且比色结果变成随后固定在测试垫材料。在反应结束时，比色结果经由桌面扫描器记录，并通过图像分析软件进行分析。
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Protocol
注意：需要正确的实验室卫生习惯。手套和通用的注意事项使用此POC设备时需要。如果适当的消毒程序不能正确执行，可能会出现的结果或感染的污染。
1.准备试纸条设备
- 确定由接触角测定8（ 图3）的清洗棉的外层的疏水性。
- 通过切割清洗棉成5.5厘米×1厘米的片用切纸机（ 图2A）制造的基于棉的分析设备。
- 钻孔（直径：= 0.5厘米），在三排层叠膜的标准用纸;两个后续的孔之间的距离为1厘米。
注：多达36个单独测试条具有三个测试区域每一个都可以使用层叠膜的标准片（5.5厘米×2厘米）（ 图2B）进行。 - 三明治清洁棉（characteriz由层压薄膜， 即 ，叠层膜的一侧的钻孔的片，以及层叠膜的另一侧的未钻孔片材（无孔）的两片外疏水性和内部亲水性）编放置组装成层压包装设备。这增强了设备的机械强度，并且提供了一个外部的，不可渗透层。
注意：通孔的直径从0.5cm到〜层压后0.47厘米收缩。一些轻微的间隙将保持清洁棉花和围绕每个孔的周边层压薄膜之间。这些微小间隙促进在后续步骤中制造的测试垫圈的位置。 - 使用一对剪刀的从组件， 即切个别5.5厘米×1cm的试片的设备，所钻的层压片/化妆棉/未钻孔层压片“三明治”（ 图2C）。让48个设备总数达到创建标准曲线如后文所述（18设备为亚硝酸盐测定中，15个设备的BSA的测定中，以及对尿胆素原试验15设备）。
- 用锋利的刀或剃刀从每个测试区域的中心（未覆盖层压薄膜）切割的狭缝（作为小流体通道），跨越并通过试验区于纵向元件的亲水层，疏水层，谨慎通过夹持装置（ 图2D）的深度中途切断。
- 通过滑入间隙在层叠（ 图2E），每个孔的周边申请纸检测垫（直径：= 0.5厘米）。
2.准备尿检标准和指示剂溶液
- 通过溶解在100毫升的去离子（DI）水69.0毫克亚硝酸钠制备10.0毫亚硝酸盐原液。在稀释用去离子水亚硝酸盐原液，创造出一系列的亚硝酸盐浓度标准溶液（2,500 1,250，625，312，156，和78μM）（ 图图4A）。
- 通过将415毫克的BSA在100ml PBS溶液制备60微米的牛血清白蛋白（BSA）原液（10磷酸盐缓冲液，0.0027氯化钾和0.137氯化物酸钠; pH 7.0）中。稀释在去离子水中的BSA原液以创建一系列BSA的浓度标准溶液（30，15，7.5，3.75，和1.875微米）（ 图4B）。
- 通过在100毫升去离子水2.5克尿胆素原溶解制备25克/ L的尿胆素原原液。稀释DI水股票尿胆原的解决方案，创造出一系列尿胆原浓度的标准溶液（7.8，15.6，31.2，62.5，和125毫克/升）（ 图4C）的。
- 制备含有50mM磺胺，330 mM柠檬酸和10mM N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐的亚硝酸盐指示剂溶液。
- 制备含有250mM的柠檬酸盐缓冲液（pH 1.8）和四溴蓝色的在95％乙醇3.3毫溶液的BSA指示剂溶液。
- 制备含0.1 M 4二甲胺甲醛尿胆原指示剂溶液。
3.准备指示灯垫
- 剪切从色谱纸三个圆形形状的垫或盘（直径= 0.5厘米），并插入他们每个人（一个用于在三测定条每个检测）的在每个测试条的设备来创建解决方案的标准曲线（第4节）。
- 在每个组件的三个层压薄膜孔的，观察层压薄膜，并在切孔的非常边缘棉测试垫之间的微小的间隙。注意，在层叠膜中的孔的直径比所述纸测试焊盘略小。
注：总之，这些特征允许对所述装置的棉测试焊盘部分所施加的纸测试垫使纸测试垫滑的边缘进入所述的超薄间隙， 即 ，层叠膜孔的边缘之下。此保持的纸张检测垫就位。 - 准备亚萨亚硝酸盐该装置的y-部分。
- 涂覆亚硝酸盐测定垫4微升亚硝酸指示剂溶液（在步骤2.4中制备），并允许它在环境温度下完全干燥的。
- 准备检测设备的总蛋白定量部分。
- 涂层的总蛋白测定垫4微升BSA指示剂溶液（在步骤2.5中制备），并允许它在环境温度下完全干燥。
- 准备检测设备的检测Uroblinogen部分。
- 涂覆uroblinogen测定垫4微升uroblinogen指示符（在步骤2.6中制备），并允许它在环境温度下完全干燥的。
4.创建基于棉分析装置标准曲线
- 对于准备每个标准，沾了制备的器件的吸收端（预装检测指标（见第3.4节））转换成标准的解决方案，持续10秒（吸收量〜200 - 300微升）（ 图2F）。
- 放置基于棉花的设备中的周围环境10分钟以完成比色反应（ 图2F）。重复一式三份每个实验。
- 扫描设备来分析每个测试垫（ 图2G）中发生的色度 的变化。在一个桌面扫描仪和在RGB模式与图像分辨率的600dpi的扫描测试垫的玻璃所得测试垫的地方。 JPEG格式保存每个图像。
- 利用图像分析软件来确定各颜色强度（ 图2H）的计算机上分析扫描的图像。
- 在http://imagej.nih.gov/ij/下载ImageJ的软件。打开扫描的图像文件。在菜单中选择命令的图像，然后选择“类型”为RGB图像转换为8位灰度。
- 使用“椭圆”工具，在工具栏中选择测试点分析区域。选择“分析”菜单中的COMMANDS，然后选择“测量”来分析颜色强度。记录平均强度的结果。
- 建立亚硝酸盐，总蛋白，和尿胆素原试验（ 图2I）的标准曲线。
- 表明不同浓度的标准亚硝酸盐，总蛋白，和尿胆素原的解决方案，并使用stastical软件的二维坐标系统上的相关的平均强度的结果。
- 由二次模型以及用于通过线性回归模型总蛋白和尿胆素原试验的标准曲线拟合为一个亚硝酸盐测定的标准曲线。
5.确定未知样品浓度来确定的标准曲线值
- 以确定亚硝酸盐，总蛋白，并在未知溶液尿胆素原的浓度，使用该设备作为测定标准溶液的浓度和亚硝酸代替被测强度的结果，总蛋白描述，并且urobilinogen测定到建在步骤2中的模型的公式。
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Representative Results
我们通过使用可商购的清洁棉特征在于亲水性（内部部分）和疏水性（外部部分）的属性（ 图1A）成功地展示了基于棉的分析装置的发展。 图3示出了接触角测量的结果。外棉的疏水界面是127.35°±4.73°。从一个用户友好的角度来看，这里采用比色分析可直接通过肉眼观测，并通过颜色强度进一步定量分析（ 图2F）。尿总蛋白在正常个体应低于150毫克/分升（4微米）。尿亚硝酸盐离子的值与尿路感染或细菌感染，当涉及到一个分析装置的发展相关联，因此尿亚硝酸盐的检测的分析灵敏度应尽可能低亚硝酸盐检测。尿胆素原是由粪便中排出，并通过肝肠循环恢复，但尿胆原的某些级别，大约1 - 4毫克/每天，可在尿液图4A找到- C说明了我们的努力，为每个实验创建标准曲线的结果目标。这些标准曲线通过检查平均比色强度的结果和他们相比，我们建立的标准浓度的浓度确定。这使我们能够评估检测（检测限），每个实验的极限。在缓冲系统为亚硝酸盐，BSA和尿胆素原的检测限为，分别0.147毫米，3.672微米，4.861毫克/升。这也为我们提供了一个数学框架确定未知溶液的亚硝酸盐，BSA和尿胆原的浓度。
图1 基于棉分析装置的 >。 示意图。顶部和横截面图图像显示每个测试焊盘（直径0.5厘米），并以棉为主设备（1毫升宽×5.5厘米长度）的尺寸。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
切纸机是用来切割清洗件棉衣指定大小的棉质分析设备，取样和分析结果图 2. 制作工艺。（A）（B）笔被用来标记层压的位置在装配薄膜孔（C）的层合机被用于夹心通过加热复合膜的两个层之间的组件（D） 。（E）的测试垫被安装到棉装置（F）的尿胆素原，BSA，并与我们的基于棉分析装置进行亚硝酸盐测定。（G）的图像的结果作了并导入到使用扫描仪的计算机。使用（H）的图像分析软件来分析由灰度对比状态分析图像。（Ⅰ）所获得的强度结果装入一个标准曲线。 请此处查看该图的放大版本。
图3. 接触角结果为卸妆棉。去离子水（1微升）滴到棉的外部，疏水层，以确定接触角。
图4. 分析结果为亚硝酸盐，尿胆原和BSA基于棉分析设备，标准曲线（A）亚硝酸盐（0.156-2.5毫米），（B）BSA（1.875-30μM），（C）尿胆原（ 7.8 - 125μM）对于每个浓度，测试一式三份进行并为拟合曲线的R 2值分别为亚硝酸盐：0.99，BSA：0.98，尿胆原：0.95。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这个协议中的关键步骤包括确定（有不同的疏水性/亲水性）和滤纸（色谱滤纸或定量滤纸）纯棉材质的适当组合。一个精心策划和执行装置的设计呈现了比色法的最佳性能属性。从我们的比色法测定结果，本文提出的基于棉分析设备演示的巨大潜力为多个疾病检测的平台。
目前大多数横向流动基制品（ 例如 ，妊娠试验）提供不超过一个单一测定functon 14以上。虽然一些试纸测试执行多个生物标记测定15，它们的使用运行抵押品样品污染的风险，因为检测试剂直接接触试验样品。我们的设备克服了这一障碍并可以用来实现在一个单一的横向流动型沟道器件的多个比色分析。
此方法仅由靶分析物分子大小的限制。亚硝酸盐的R 2和LOD值比其他试验（BSA和尿胆素原）的，这表明我们的设备更适合低分子量分析5（ 图4）大得多。
一些进一步的优化可能仍然以增强此设备用于临床实践的实用性是必需的。当暴露于外部环境中长时间这种优化包括改进分析试剂的可靠性和稳定性。尽管如此，我们认为，本发明创建了一个决定性的和有价值的侵害转变为可以在临床实践中可靠地使用低成本的分析设备的发展，特别是关于实现了快速，准确的分析和传染病的适当后续分析需求和感染性疾病。
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Acknowledgments
这项工作是由科学技术的台湾省补助的部分资助（MOST 104-2628-E-007-001-MY3（CMC）），台中荣民总医院（TCVGH-1056904C（MYH））。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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