Abstract
En robust, billig analytisk enhed skal være brugervenlig, hurtig og økonomisk overkommelig. Sådanne enheder bør også være i stand til at operere med knappe prøver og give oplysninger til opfølgende behandling. Her udviser vi udviklingen af en bomuld-baserede urinanalyse (dvs., nitrit, total protein, og urobilinogen assays) analytisk anordning, der anvender en lateral flow-baseret format, og er billig, let fremstilles, hurtig, og kan bruges til at udføre flere tests uden krydskontaminering bekymringer. Bomuld er sammensat af cellulosefibre med naturlige absorberende egenskaber, der kan udnyttes til flow-baseret analyse. Den enkle men elegante fremstillingsproces vores bomuld-baserede analytiske anordning er beskrevet i denne undersøgelse. Arrangementet af bomuld struktur og testpuden drager fordel af hydrofobicitet og absorberende styrken af hvert materiale. På grund af disse fysiske egenskaber, kan kolorimetriske resultater vedvarende holde sig til testenpad. Denne enhed gør det muligt for læger at modtage kliniske oplysninger i tide og viser stort potentiale som et redskab til tidlig intervention.
Introduction
Udviklingen af point-of-care (POC) diagnostiske enheder, der er overkommelig, robust, og nemt bruges er bydende nødvendigt for at forbedre den globale sundhed 1,2. Især enheder bestående af cellulose-substrater (fx papir, tråd, og bomuld) giver lovende analytiske platforme for billig analyse på grund af deres allestedsnærværelse, overkommelige priser, brugervenlighed, robusthed og evne til at levere hurtige resultater 3-7.
Her afslører vi udviklingen af en bomuld-baserede analytiske enhed, der bruger en lateral flow-baseret format for urinanalyse. Denne bomuld-baserede analytiske enhed giver en alternativ afsløring tilgang med flere vigtige fordele: i) fabrikation med minimal menneskelig indsats; ii) lav pris; iii) evnen til at blive brugt til at udføre flere, forskellige analyser uden krydskontaminering bekymringer; . iv) enhed uafhængighed, dvs evnen til at køre uden ekstra udstyr og / eller elektricitet; og, v) Hastighed (kolorimetriske assays kan være afsluttet inden for 10 minutter).
Opbygningen af bomuld-baserede analytiske enhed kan opdeles i fire dele: i) bomuld, som er naturligt hydrofobt på sin udvendige hydrofobe lag; ii) bomuld, som er internt hydrofile og tjener som en transport kanal for væske vægevirkning; iii) laminering film, der binder og komprimerer bomuld, der anvendes, men indeholder boret ud huller til placering af reaktion / testpuder; og iv) kromatografi papir testpuderne, som er belagt / indlejret med reaktive reagenser, placeret på den ydre overflade af bomuld (specifikt i rummet boret ud af laminering film) som reaktionsprodukter områder for kolorimetriske assays (dvs. nitrit, totalt protein, pH og urobilinogen assays) og visning af resultater.
Den underliggende mekanisme for testen er som følger. Bomulden-baserede analytiske enhed er scoret med linjer, der trænger halvvejs gennem depth af bomuld materiale til at skabe en strømningskanal, der tillader prøvefluid for at nå de reaktive puder, der anvendes. Den absorberende kant af den analytiske enhed nedsænkes i målprøven, hvorefter opløsningen er onde langs strømningsmæssig kanal fra absorption ende til testpuderne (figur 1). Fordi absorberende styrke testpuden er større end den for bomuld, er løsninger absorberes af testpuderne fast indeholdt i testpuden papiret, så der er ingen reflow tilbage i strømningstekniske kanal, og de kolorimetriske resultater bliver efterfølgende fastgjort på testpude materiale. Ved slutningen af reaktionen er kolorimetriske resultater registreret via en desktop scanner, og analyseret via billede analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ADVARSEL: Der kræves Korrekt laboratorium hygiejne praksis. Handsker og universelle forholdsregler er påkrævet, når du bruger denne POC enhed. Forurening af resultater eller infektion kan opstå, hvis passende procedurer sterilisering ikke gennemføres korrekt.
1. Forbered Test Strip Devices
- Bestem hydrofobicitet ydre lag af den rensende bomuld ved kontakt vinkelmåling 8 (figur 3).
- Fabrikere bomuld-baserede analytiske enhed ved at skære udrensning bomuld i 5,5 cm x 1 cm stykker med et papir cutter (figur 2A).
- Bor huller (ø = 0,5 cm) i en standard ark laminering film i rækker af tre; afstanden mellem to på hinanden følgende huller er 1 cm.
BEMÆRK: Så mange som 36 individuelle teststrimler med tre testområder hver kan foretages ved hjælp af en standard ark laminering film (5,5 cm x 2 cm) (Figur 2B). - Sandwich udrensning bomuld (characterized ved udvendig hydrofobicitet og indvendig hydrofilicitet) mellem to stykker laminering film, dvs. hullet boret ark af laminering film på den ene side, og en uborede ark af laminering film (ingen huller) på den anden side. Placer samlingen i en lamineringsmaskine at emballere enheden. Dette øger enhedens mekaniske styrke og tilvejebringer en ekstern, uigennemtrængeligt lag.
BEMÆRK: diametre huller vil skrumpe fra 0,5 cm til ~ 0,47 cm efter laminering. Nogle små huller forbliver mellem udrensning bomuld og laminering film omkring omkredsen af hvert hul. Disse små huller lette placeringen af testpuden kredse fremstillet i et efterfølgende trin. - Brug et par saks til at skære individuelle 5,5 cm x 1 cm test strimler enheder fra forsamlingen, dvs boret laminering ark / bomuld pad / uborede laminering ark "sandwich" (Figur 2C). Lav 48 enheder i alt at skabe standardkurver som beskrevet senere (18 enhederfor nitrit assay 15 anordninger til BSA-assay, og 15 anordninger til urobilinogen assay).
- Brug en skarp kniv eller barbermaskine til at skære en slids (som en lille strømningsteknisk kanal) fra centrum af hvert testområde (ikke omfattet af laminering film), på tværs af og gennem det hydrofobe lag af testområdet til den hydrofile lag af den langsgående indretning, være forsigtig at skære halvvejs gennem dybden af klemt indretningen (figur 2D).
- Påfør papir testpuder (ø = 0,5 cm) ved at skubbe dem ind i sprækker ved omkredsen af hvert hul i lamineringen (Figur 2E).
2. Forbered Standarder og Indikator Løsninger til Urinanalyse
- Forbered 10,0 mM nitrit stamopløsning ved at opløse 69,0 mg natriumnitrit i 100 ml deioniseret (DI) vand. Fortynd nitrit stamopløsning i DI-vand at skabe en række af nitrit koncentration standardopløsninger (2.500, 1.250, 625, 312, 156, og 78 uM) (figur4A).
- Forbered 60 uM bovint serumalbumin (BSA) stamopløsning ved at opløse 415 mg BSA i 100 ml PBS-opløsning (10 M phosphatpuffer, 0,0027 M kaliumchlorid og 0,137 M natriumchlorid; pH 7,0). Fortynd BSA stamopløsning i DI-vand at skabe en række BSA-koncentration standardopløsninger (30, 15, 7,5, 3,75, og 1,875 pM) (figur 4B).
- Forbered 25 g / L urobilinogen stamopløsning ved at opløse 2,5 g urobilinogen i 100 ml DI-vand. Fortynd stock urobilinogen opløsning i DI vand for at skabe en række urobilinogen koncentration standardopløsninger (7,8, 15,6, 31,2, 62,5, og 125 mg / L) (figur 4C).
- Forbered nitrit indikator opløsning indeholdende 50 mM sulfanilamid, 330 mM citronsyre og 10 mM N- (1-naphthyl) ethylendiamin-dihydrochlorid.
- Forbered BSA indikator opløsning indeholdende 250 mM citratbufferopløsning (pH 1,8) og 3,3 mM opløsning af tetrabromophenol blå i 95% ethanol.
- Forbered urobilinogen indikator opløsning indeholdende 0,1 M 4-Dimethylamingas benzaldehyd.
3. Forbered Indikator Pads
- Skær tre cirkulære formede puder eller diske (Ø = 0,5 cm) fra kromatografi papir og indsætte hver af dem (én for hver analyse på de tre-assay strimmel) på hver teststrimmel enhed til at skabe en løsning standardkurve (afsnit 4).
- På hvert af de tre laminering film huller i samlingen, observere et lille mellemrum mellem laminering film og bomuld test pad på den meget kanter skåret hul. Bemærk, hullet i laminering filmen er lidt mindre i diameter end papiret testpuden.
BEMÆRK: Tilsammen udgør disse funktioner giver papiret testpuden, der skal anvendes over for bomuld testpuden del af indretningen, således at kanterne af papiret testpuden glide ind i slanke mellemrum nævnt, dvs. under kanterne af laminering film hul. Dette holder papir test puder på plads. - Forbered Nitrit Assay del af indretningen.
- Smør nitrit assay pad med 4 pi nitrit indikatoropløsning (forberedt i trin 2.4) og lad det tørre helt ved stuetemperatur.
- Forbered Total Protein Assay Portion af Detection Device.
- Coat det samlede proteinindhold assay pad med 4 pi BSA indikatoropløsning (forberedt i trin 2.5) og lad det tørre helt ved stuetemperatur.
- Forbered Uroblinogen Assay Portion af Detection Device.
- Smør uroblinogen assay pad med 4 pi uroblinogen indikator (forberedt i trin 2.6) og lad det tørre helt ved stuetemperatur.
4. Opret Standard Kurver for Cotton-baserede Analytisk Device
- For hver standard forberedt, dyppe absorberende ende af en forberedt enhed (præinstalleret med assay indikatorer (se afsnit 3.4)) i det standardløsning til 10 sek (absorptionen volumen ~200 - 300 pi) (Figur 2F).
- Placer bomuld-baserede enhed i en omgivende miljø for 10 minutter til at fuldføre kolorimetriske reaktioner (figur 2F). Gentag hvert eksperiment tre gange.
- Scan enheden til at analysere den kolorimetriske ændring på hver test pad (figur 2G). Place resulterer test pads på glas en desktop scanner og scan test pads i RGB-tilstand med 600 dpi billedernes opløsning. Gem hvert billede i JPEG-format.
- Analyser det scannede billede på en computer med billede analyse software til at bestemme respektive farve intensiteter (Figur 2H).
- Hent ImageJ software på http://imagej.nih.gov/ij/. Åbn de scannede billedfiler. Vælg Billede i menukommandoer, og vælg "Type" til at konvertere RGB-billeder til 8-bit gråtoner.
- Brug "Oval" værktøj i værktøjslinjen for at vælge den test pad analytiske område. Vælg "Analyser" i menuen commands, og vælg "Mål" for at analysere farveintensiteten. Optag betyde resultater intensitet.
- Etablere standard kurver nitrit, total protein, og urobilinogen assays (Figur 2i).
- Angiver forskellige koncentrationer af standard nitrit, total protein, og urobilinogen løsninger og korreleret gennemsnitsresultaterne intensitet på et todimensionalt koordinatsystem ved hjælp stastical software.
- Monter standardkurve for et nitrit assay af en kvadratisk model og standard kurverne for den samlede protein- og urobilinogen analyser ved lineær regression modeller.
5. Bestem ukendte prøve Koncentrationer Brug Etablerede standardkurve Værdier
- For at bestemme nitrit, total protein, og urobilinogen koncentrationer i ukendte løsninger, bruge enheden som beskrevet for måling standardløsning koncentrationer og erstatte målte intensitet resultater for nitrit, total protein, og urobilinogen analyser i ligningerne af modellerne bygget i trin 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi succes demonstreret udviklingen af bomuld-baserede analytiske anordninger ved anvendelse af kommercielt tilgængelige udrensning bomuld kendetegnet ved hydrofil (indre del) og hydrofobe (ydre del) egenskaber (figur 1A). Figur 3 viser resultaterne af kontaktvinklen måling. Den hydrofobe interface udvendige bomuld var 127,35 ° ± 4,73 °. Fra en brugervenlig perspektiv, kunne kolorimetriske assays ansat her observeres direkte med det blotte øje, og yderligere kvantificeret gennem farveintensitet analyser (figur 2F). Urin totalt protein i et normalt individ bør være mindre end 150 mg / dl (4 uM). Værdien af urin nitritioner er forbundet med urinvejsinfektioner eller bakterieinfektioner, så den analytiske følsomhed af urin nitrit detektering bør være så lav som muligt, når det gælder udvikling af analytiske anordninger til ennitrit assay. Urobilinogen udskilles af fæces og tilbagesøges af den enterohepatiske cirkulation, men nogle niveauer af urobilinogen, ca. 1 - 4 mg / dagligt, kan findes i urin Figur 4A -. C viser resultaterne fra vores bestræbelser på at skabe standardkurver for hver analyse mål. Disse standard kurver blev etableret ved at undersøge gennemsnitlige resultater kolorimetrisk intensitet og sammenligne dem med koncentrationerne af standard koncentrationer, som vi etablerede. Dette tillod os at vurdere detektionsgrænser (Lods) for hver analyse. Bestemmelsesgrænseværdierne for nitrit, BSA og urobilinogen i puffersystemer var, 0,147 mM, 3,672 uM, og 4,861 mg / L. Dette gav os også med en matematisk ramme til bestemmelse af koncentrationen af nitrit, BSA, og urobilinogen i ukendte løsninger.
figur 1 >. Skematisk diagram af bomuld-baserede Analytisk Device. Top og tværsnit se billeder viser dimensionerne af hver test pad (0,5 cm i diameter) og bomuld-baseret enhed (1 cm bredde x 5,5 cm længde). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Fabrikation Processen med bomuld-baserede Analytical enhed, Sampling, og resultater Analyse. (A) Et papir kutter blev brugt til at skære stykker af udrensning bomuld til den angivne størrelse. (B) En pen blev brugt til at markere de steder for laminering film huller i samlingen. (c) et laminator blev anvendt til sandwich samlingen mellem to lag laminerende film ved opvarmning. (D) (E) testpuderne blev installeret på bomuld enhed. (F) urobilinogen, BSA og nitrit-assays blev udført med vores bomuld-baserede analytiske enhed. (G) Images af resultaterne blev foretaget og indført i en computer ved hjælp af en scanner. (H) Billedanalyse software blev anvendt til at analysere billeder ved grå-skala kontrast state analyse. (i) de opnåede resultater intensitet blev monteret i en standard kurve. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kontakt Angle Resultater for Cleansing Cotton. DI vand (1 pi) blev droppet på bomuld eksterne, Hydrofobe lag for at bestemme kontaktvinklen.
Figur 4. Analyseresultater for nitrit, urobilinogen, og BSA på Cotton-baserede Analytisk enhed. Standard kurver for (A) nitrit (0,156 til 2,5 mM), (B) BSA (1,875 til 30 uM), (C) urobilinogen ( . 7,8-125 uM) for hver koncentration, blev tests udført i tre eksemplarer og R 2 værdier for montering kurve var nitrit: 0,99, BSA: 0,98, og urobilinogen: 0,95. klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i denne protokol omfattede bestemmelse af den rigtige kombination af bomuld materiale (med varierende hydrofobicitet / hydrofilicitet) og filtrerpapir (kromatografi filtrerpapir eller kvantitativ filterpapir). Et godt planlagt og udført enhed design gør den bedste ydeevne attributter for kolorimetriske assays. Fra vores kolorimetriske analyseresultater, bomuld-baserede analytiske apparat præsenteret heri viser stort potentiale som platform til påvisning af flere sygdomme.
De fleste nuværende lateral flow-base produkter (f.eks., Graviditet test) giver ikke mere end en enkelt assay functon 14. Mens nogle oliepinden test udføre flere biomarkør assays 15, deres brug løber risiko for forurening sikkerheder prøve fordi assayreagenser direkte kontakt testprøver. Vores enhed overvinder denne hindring og kan bruges til at gennemføre flere kolorimetriske assays i en enkelt lateral flow-baserede kanal enhed.
Denne fremgangsmåde er kun begrænset af målanalyt molekylstørrelse. R 2 og LOD værdier af nitrit er meget større end de andre assays (BSA og urobilinogen), hvilket antyder, at vores enheder er mere velegnede til lav molekylær analyse 5 (figur 4).
Nogle yderligere optimering kan være nødvendig for at øge den praktiske gennemførlighed af denne enhed for klinisk praksis. Denne optimering herunder større pålidelighed og stabilitet assayreagenser når de udsættes for det udendørs miljø i længere tid. Alligevel mener vi, at denne opfindelse skaber en afgørende og værdifuld indhug i udviklingen af billige analytiske enheder, der kan bruges som pålideligt i klinisk praksis, især med hensyn til at opfylde behovene for hurtig og præcis analyse og passende opfølgning analyse af smitsomme og infektionssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Taiwans Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MEST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), og Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
