Abstract
Een robuuste, low-cost analytische apparaat moet gebruiksvriendelijk, snel en betaalbaar te zijn. Dergelijke apparaten moeten ook in staat zijn om te werken met schaarse samples en informatie te verstrekken voor follow-up behandeling. Hier tonen we de ontwikkeling van een katoen gebaseerde urineonderzoek (dwz, nitriet, totaal eiwit en urobilinogeen assays) analyse-inrichting met een laterale flow-gebaseerd formaat werken, en goedkoop, gemakkelijk gefabriceerd, snel, en kan worden gevolgd voor meerdere tests zonder kruisbesmetting zorgen. Katoen bestaat uit cellulosevezels met natuurlijke absorberende eigenschappen die kunnen worden benut voor stroomgebaseerde analyse. De eenvoudige maar elegante fabricageproces van onze katoen gebaseerde analyse-inrichting wordt beschreven in deze studie. De opstelling van de katoen structuur en testkussentje maakt gebruik van de hydrofobe en absorberende kracht van elk materiaal. Door deze fysische eigenschappen, kan colorimetrische resultaten voortdurend houden aan de proefpad. Dit apparaat maakt het mogelijk artsen om klinische informatie te ontvangen in een tijdig en toont een groot potentieel als een instrument voor vroegtijdige interventie.
Introduction
De ontwikkeling van de point-of-care (POC) diagnostische apparaten die zijn betaalbaar, robuust en gemakkelijk te gebruiken is absoluut noodzakelijk voor de verbetering van global health 1,2. In het bijzonder apparaten bestaat uit cellulose substraten (bijvoorbeeld, papier, draad en katoen) bieden veelbelovende analytische platforms voor low-cost analyse vanwege hun alomtegenwoordigheid, betaalbaarheid, gebruiksgemak, robuustheid, en het vermogen om snel resultaten 3-7 te verschaffen.
Hier, onthullen we de ontwikkeling van een katoen gebaseerde analyse apparaat met een laterale flow-based format gebruikt voor urineonderzoek. Dit katoen gebaseerde analytische apparaat biedt een alternatieve benadering detectie met een aantal belangrijke voordelen: i) vervaardiging met minimale menselijke inspanning; ii) lage kosten; iii) de capaciteit worden gebruikt om meerdere, verschillende assays zonder kruisbesmetting betreft voeren; . iv) apparaatonafhankelijkheid, dat wil zeggen de mogelijkheid om te worden uitgevoerd zonder extra apparatuur en / of elektriciteit; en v) Snelheid (colorimetrische assays kan worden voltooid binnen 10 min).
De structuur van dit katoen gebaseerde analytische apparaat kan worden onderverdeeld in vier delen: i) katoen dat van nature hydrofoob op haar externe hydrofobe laag; ii) Stoffen die intern hydrofiel en dient als een kanaal voor transport vloeibare wicking; iii) lamineren film die bindt en comprimeert katoen gebruikt maar bevat gaten geboord voor het plaatsen van reactie / testblokken; en iv) chromatografie papier testblokken, die bekleed / ingebed met reactieve reagentia, geplaatst op het buitenoppervlak van de katoen (met name in de ruimte geboord uit de laminaatfilm) als reactie gebieden colorimetrische assays (bijv nitriet, totaal eiwit, pH en urobilinogeen assays) en de resultaten worden weergegeven.
Het mechanisme van de test is als volgt. De katoen gebaseerde analytische apparaat wordt gescoord met lijnen die halverwege dringen door de depth van de katoenen materiaal om een stroom kanaal waarmee monstervloeistof bereikt de reactieve pads worden gebruikt creëren. De absorberende rand van de analyse-inrichting is ondergedompeld in het doelmonster, waarna de oplossing slecht langs het kanaal van het vloeibare absorptie einde de testblokken (figuur 1). Omdat het absorberende kracht van het testveld is groter dan die van katoen worden oplossingen geabsorbeerd door de testblokken stevig opgenomen in de test stootkussen zodat er geen terugvloeiing terug in de vloeibare kanaal en de colorimetrische resultaten raken vervolgens op het vaste testveld materiaal. Na afloop van de reactie worden colorimetrische resultaten opgenomen via een desktop scanner en via beeldanalyse software geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Een goede laboratorium hygiënepraktijken is vereist. Handschoenen en universele voorzorgsmaatregelen getroffen te worden bij gebruik van deze POC apparaat. Besmetting van de resultaten of infectie kan optreden als adequate sterilisatie procedures niet correct worden uitgevoerd.
1. Bereid teststrip Devices
- Bepaal de hydrofobiciteit van de buitenlaag van de reiniging katoen Contacthoekmeting 8 (figuur 3).
- Fabriceren de katoen gebaseerde analytische apparaat door te snijden reiniging katoen tot 5,5 cm x 1 cm stukken met een papiersnijder (Figuur 2A).
- Boorgaten (ø = 0,5 cm) in een standaard vel lamineren film in rijen van drie; de afstand tussen twee opeenvolgende openingen is 1 cm.
LET OP: Maar liefst 36 individuele teststrips met drie testgebieden elk kunnen worden gemaakt met behulp van een standaard vel lamineren film (5,5 cm x 2 cm) (figuur 2B). - Sandwich de reiniging katoen (characterized van hydrofobiciteit exterieur en interieur hydrofiliciteit) tussen twee stukken lamineerfolie, dat wil zeggen, het gat lamineringsvel film op één zijde en een ongeboorde lamineringsvel film (geen gaten) anderzijds. Plaats het geheel in een laminator om het apparaat te verpakken. Dit verhoogt de mechanische sterkte van het apparaat en verschaft een externe, gesloten laag.
LET OP: De diameters van de gaten zal krimpen van 0,5 cm tot ~ 0,47 cm na het lamineren. Sommige kleine openingen zal tussen de reiniging katoen en lamineren film rond de omtrek van elk gat blijven. Deze kleine spleten vergemakkelijkt de plaatsing van testveld cirkels in een volgende stap. - Gebruik een paar van schaar aan individuele 5,5 cm x 1 cm teststrip apparaten gesneden uit de vergadering, dat wil zeggen, de geboorde lamineren blad / wattenschijfje / ongeboord lamineren vel "sandwich" (figuur 2C). Maak 48 apparaten totaal standaard curves te creëren zoals later wordt beschreven (18 apparatenvoor nitriet test 15 inrichtingen voor de bepaling BSA en 15 middelen voor de urobilinogeen assay).
- Met een scherp mes of scheermes een sleuf gesneden (als kleine fluïde kanaal) vanaf het midden van elk testgebied (niet in lamineringsfilm), over en door de hydrofobe laag testgebied de hydrofiele laag van de longitudinale inrichting, zijn voorzichtig halverwege dwars door de diepte van de kern apparaat (figuur 2D).
- Solliciteer papier-test pads (ø = 0,5 cm) door te schuiven ze in de gaten aan de rand van elk gat in het lamineren (figuur 2E).
2. Bereid Normen en Indicator Oplossingen voor Urineonderzoek
- Bereid 10,0 mM voorraadoplossing nitriet door het oplossen van 69,0 mg natriumnitriet in 100 ml gedeïoniseerd (DI) water. Verdun het nitriet voorraadoplossing in DI water om een reeks nitrietconcentratie standaardoplossingen (2500, 1250, 625, 312, 156 en 78 pM) is (Figuur4A).
- Bereid 60 uM runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing door het oplossen van 415 mg BSA in 100 ml PBS-oplossing (10 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride en 0,137 M natriumchloride, pH 7,0). Verdun de BSA-voorraadoplossing in DI water om een reeks BSA concentratienorm oplossingen (30, 15, 7,5, 3,75 en 1,875 pM) (Figuur 4B).
- Bereid 25 g / l urobilinogeen voorraad oplossing door het oplossen van 2,5 g urobilinogeen in 100 ml DI water. Verdunde stock urobilinogeen oplossing in DI water om een reeks urobilinogeen concentratie standaardoplossingen (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 en 125 mg / L) (Figuur 4C) maken.
- Bereid nitriet indicatoroplossing bevattende 50 mM sulfanilamide, 330 mM citroenzuur en 10 mM N- (1-naftyl) ethyleendiamine dihydrochloride.
- Bereid BSA indicatoroplossing bevattende 250 mM citraatbuffer (pH 1,8) en 3,3 mM oplossing van tetrabromophenol blauw in 95% ethanol.
- Bereid urobilinogeen indicatoroplossing bevattende 0,1 M 4-dimethylamine benzaldehyde.
3. Bereid Indicator Pads
- Snijd drie cirkelvormige pads of schijven (ø = 0,5 cm) vanaf chromatografiepapier en plaats elk van hen (een voor elke test op de drie test strip) op elke teststrip apparaat aan een oplossing standaardkromme (hoofdstuk 4) te creëren.
- Bij elk van de drie lamineringsfilm gaten van het samenstel zich aan een kleine opening tussen de lamineringsfilm en katoen testkussentje op de randen van de uitgesneden gaten. Merk op, het gat in het laminaat film is iets kleiner in diameter dan het papier testkussentje.
OPMERKING: Samen vormen deze functies kan het papier testveld moet worden toegepast tegen de katoen testveld gedeelte van de inrichting, zodat de randen van het papier testveld slip in de smalle kloof genoemd, dat wil zeggen, in het kader van de randen van het lamineren film gat. Dit houdt het papier-test pads op hun plaats. - Bereid de Nitriet Assay deel van de inrichting.
- Smeer de nitriet test pad met 4 pl van nitriet indicator-oplossing (bereid in stap 2.4) en laat het dan volledig drogen bij omgevingstemperatuur.
- Bereid de Total Protein Assay Gedeelte van de detectie-inrichting.
- Smeer de totale hoeveelheid eiwit assay pad met 4 ul van BSA indicator-oplossing (bereid in stap 2.5) en laat het dan volledig drogen bij omgevingstemperatuur.
- Bereid de Uroblinogen Assay Gedeelte van de detectie-inrichting.
- Smeer de uroblinogen assay pad met 4 pl uroblinogen indicator (bereid in stap 2.6) en laat het dan volledig drogen bij omgevingstemperatuur.
4. Maak Standard Curves voor de Cotton gebaseerde analytische Device
- Voor elke standaard voorbereid, dompel de absorberende einde van een geprepareerde apparaat (voorgeladen met assay-indicatoren (zie paragraaf 3.4)) in de standaard oplossing voor 10 sec (de absorptie volume ~200-300 gl) (figuur 2F).
- Plaats de katoen-apparaat in een sfeervolle omgeving voor 10 min naar colorimetrische reacties (figuur 2F) te voltooien. Herhaal elk experiment in drievoud.
- Scan het apparaat aan op de colorimetrische verandering optreedt bij elke test pad (figuur 2G) te analyseren. Plaats resulterende testen pads op het glas van een desktop scanner en scan-test pads in de RGB-modus met 600 dpi van de beeldresolutie. Elke afbeelding opslaan in jpeg-formaat.
- Analyseer de gescande afbeelding op een computer met behulp van beeldanalyse software om respectievelijke kleur intensiteiten (figuur 2H) te bepalen.
- Download ImageJ software op http://imagej.nih.gov/ij/. Open de gescande beeldbestanden. Selecteer de afbeelding in het menu commando's, en selecteer "Type" om RGB beelden om te zetten naar 8-bits grijstinten.
- Gebruik de "Oval" tool in de werkbalk om het testveld analytische gebied te selecteren. Selecteer "Analyseer" in het menu commands, en kies "Measure" om kleurintensiteit analyseren. Record gemiddelde intensiteit resultaten.
- Bepaal de standaard curves van nitriet, totaal eiwit, en urobilinogeen assays (figuur 2I).
- Geven verschillende concentraties standaard nitriet, totaal eiwit en urobilinogeen oplossingen en gemiddelde intensiteit gecorreleerd resultaten op een tweedimensionaal coördinatensysteem gebruiken stastical software.
- Monteer de standaard curve voor een nitriet test door een kwadratisch model en de standaard curves voor totaal eiwit en urobilinogeen assays door lineaire regressie modellen.
5. Bepaal onbekende monster Concentraties behulp Opgericht Standard Curve Waarden
- Tot nitriet, totaal eiwit, en urobilinogeen concentraties in onbekende oplossingen te bepalen, gebruikt u het apparaat zoals beschreven voor het meten van de standaardoplossing concentraties en vervangende gemeten intensiteit resultaten voor nitriet, totaal eiwit, en urobilinogen assays in de vergelijkingen van de modellen aangemaakt in stap 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij hebben met succes de ontwikkeling van op katoen gebaseerde analytische apparaten aangetoond door standaard reini- katoen gekenmerkt door hydrofiele (binnenste gedeelte) en hydrofobe (buitendeel) eigenschappen (Figuur 1A). Figuur 3 toont de resultaten van de contacthoek gemeten. De hydrofobe-interface van het exterieur van katoen was 127,35 ° ± 4.73 °. Van een gebruiksvriendelijke perspectief kan colorimetrische assays hier toegepast direct met het blote oog, en verder gekwantificeerd door middel kleurintensiteit analyses (figuur 2F). Urine totaal eiwit in een normaal individu moet minder dan 150 mg / dl (4 uM) zijn. De waarde van urine nitriet ionen wordt geassocieerd met urineweginfecties of bacteriële infecties, zodat de analytische gevoeligheid van urine nitriet detectie zo laag mogelijk moet zijn wat betreft de ontwikkeling van analytische apparatuur voornitriet assay. Urobilinogeen wordt uitgescheiden door de ontlasting en teruggewonnen door de enterohepatische circulatie, maar sommige niveaus van urobilinogeen, ongeveer 1-4 mg / dag, is beschikbaar in de urine Figuur 4A -. C toont de resultaten van onze inspanningen om standaard curven voor elke assay doel. Deze standaard curves werden vastgesteld door onderzoeken gemiddelde colorimetrische intensiteit uitslagen en deze te vergelijken met de concentratie van standaardconcentraties die wij vastgesteld. Dit liet ons toe om de limiet van detecties (LOD) voor elke test te evalueren. De LOD nitriet, BSA en urobilinogeen in buffersystemen waren, 0,147 mmol, 3,672 pM en 4,861 mg / l. Dit gaf ons ook met een wiskundig kader voor het bepalen van de concentraties van nitriet, BSA en urobilinogeen in onbekende oplossingen.
Figuur 1 >. Schematische weergave van Cotton-gebaseerde analytische Device. Top en dwarsdoorsnede beelden weer te geven van de omvang van elke test pad (0,5 cm diameter) en katoen-apparaat (1 cm breed x 5,5 cm lengte). Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2. fabricageproces van katoen-gebaseerde analyse-inrichting, monstername en analyse Resultaten. (A) een papiersnijder werd gebruikt om stukken van reiniging katoen gesneden om de opgegeven grootte. (B) een pen gebruikt om de locaties te lamineren markeren film gaten in het samenstel. (C) Een laminator werd met daartussen het samenstel tussen twee lagen lamineerfilm door verhitting. (D) (E) De test pads werden geïnstalleerd op het katoen apparaat. (F) Urobilinogeen, BSA, en nitriet werden uitgevoerd met onze katoen gebaseerde analytische apparaat. (G) Images de resultaten werden ingevoerd in een computer met een scanner. (H) beeldanalyse software werd gebruikt om de beelden van grijswaarden contrast staat analyseer. (I) de verkregen intensiteit resultaten werden bevestigd in een standaardcurve. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Contact Hoek Resultaten voor het reinigen van katoen. DI water (1 pl) werd neergezet op de katoenindustrie van externeHydrofobe laag op contacthoek te bepalen.
Figuur 4. Analyse Resultaten voor Nitriet, Urobilinogen en BSA op katoen gebaseerde analyse-inrichting. De standaard curven voor (A) nitriet (0,156-2,5 mM), (B) BSA (1,875-30 uM), (C) urobilinogeen ( . 7,8-125 uM) voor elke concentratie, tests werden uitgevoerd in drievoud en van de R2-waarden voor de fitting curve waren nitriet: 0.99, BSA: 0,98, en urobilinogeen: 0,95. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in dit protocol opgenomen bepalen van de juiste combinatie van katoen materiaal (met variërende hydrofobiciteit / hydrofiliciteit) en filterpapier (chromatografie filter papier of kwantitatieve filter papier). Een goed gepland en uitgevoerd apparaat ontwerp maakt de beste prestaties kenmerken voor colorimetrische assays. Vanuit onze colorimetrische test resultaten, de katoen-gebaseerde analytische inrichting die hierin toont een groot potentieel als een platform voor meerdere detectie van de ziekte.
De meeste huidige laterale flow-base (bijv., Zwangerschapstest) bieden dan een enkele assay functon 14. Terwijl sommige peilstok tests uit te voeren met meerdere biomarkeranalyses 15, het gebruik ervan loopt het risico van onderpand monsterverontreiniging omdat assay reagentia direct contact op te nemen monsters. Onze inrichting overwint deze hindernis en kan worden gebruikt om meerdere colorimetrische assays implementeren in een laterale flow-based kanaalinrichting.
Deze methode wordt alleen beperkt door doelanalyt molecuulgrootte. R 2 en LOD waarden van nitriet zijn veel groter dan die van de andere testen (BSA en urobilinogen), wat suggereert dat onze zijn minder geschikt voor lage moleculaire analyse 5 (figuur 4).
Enkele verdere optimalisatie kan toch om de uitvoerbaarheid van deze inrichting voor de klinische praktijk verbeteren vereist. Deze optimalisatie omvat de betrouwbaarheid en stabiliteit van testreagentia bij blootstelling aan de buitenomgeving voor langere tijd. Desalniettemin zijn wij van mening dat deze uitvinding creëert een beslissende en waardevolle inval in de ontwikkeling van goedkope analytische inrichtingen die betrouwbaar kan worden gebruikt in de klinische praktijk, vooral met betrekking tot het vervullen behoefte aan snelle en nauwkeurige analyse en geschikte follow-up analyse van overdraagbare en infectieziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (MOST-104-2628 E-007-001-my3 (CMC)), en Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
