Abstract
Un dispositif d'analyse robuste, à faible coût devrait être rapide et abordable et facile à utiliser. De tels dispositifs devraient également être en mesure de fonctionner avec des échantillons rares et fournir des informations pour le suivi du traitement. Ici, nous démontrons le développement d'une analyse d' urine à base de coton (c. -à- nitrite, protéines totales, et urobilinogène essais) dispositif d' analyse qui utilise un format basé sur l' écoulement latéral, et est peu coûteux, facile à fabriquer, rapide, et peut être utilisé pour effectuer plusieurs tests sans soucis de contamination croisée. Coton se compose de fibres de cellulose possédant des propriétés absorbantes naturelles qui peuvent être mises à profit pour l'analyse basée sur les flux. Le processus simple mais élégante fabrication de notre dispositif d'analyse à base de coton est décrite dans cette étude. L'agencement de la structure de coton et de test de tampon tire profit de l'hydrophobie et la résistance d'absorption de chaque matériau. En raison de ces caractéristiques physiques, les résultats colorimétriques peuvent adhérer constamment à l'épreuvetampon. Ce dispositif permet aux médecins de recevoir des informations cliniques en temps opportun et montre un grand potentiel comme outil d'intervention précoce.
Introduction
Le développement du point-of-care (POC) Les dispositifs de diagnostic qui sont abordables, robuste et facile à utiliser est impératif pour l' amélioration de 1,2 mondiale de la santé. En particulier, des dispositifs constitués de substrats de cellulose (par exemple, papier, fil, et coton) fournir des plates - formes analytiques prometteuses pour l' analyse à faible coût en raison de leur omniprésence, l' abordabilité, la facilité d'utilisation, la robustesse et la capacité à fournir des résultats rapides 3-7.
Ici, nous dévoilons le développement d'un dispositif d'analyse à base de coton qui utilise un format basé sur des flux latéral pour urinalysis. Ce dispositif d'analyse à base de coton fournit une approche de détection alternatif avec plusieurs avantages clés: i) la fabrication avec l'effort humain minimal; ii) un faible coût; iii) la capacité à utiliser pour effectuer de multiples dosages différents sans contamination croisée des préoccupations; iv . ) l' indépendance du dispositif, à savoir la capacité à fonctionner sans l' équipement et / ou d' électricité supplémentaire; et v) Vitesse (essais colorimétriques peut être complété en 10 min).
La structure de ce dispositif d'analyse à base de coton peut être divisé en quatre parties: i) le coton qui est naturellement hydrophobe sur sa couche externe hydrophobe; ii) coton hydrophile qui est à l'intérieur et sert de canal de transport pour évacuation de liquide; iii) un film de stratification qui se lie et comprime le coton utilisé, mais qui contient des trous forés pour le placement de tampons de réaction / test; et iv) des tampons d'essai du papier de Chromatographie, qui sont revêtues / intégrés avec les réactifs, placés sur la surface extérieure du coton ( plus précisément, dans l'espace foré sur le film de lamination) en tant que zones de réaction pour les essais colorimétriques ( par exemple, un nitrite, la protéine totale, le pH et des tests de urobilinogène) et l'affichage des résultats.
Le mécanisme sous-jacent de l'essai est le suivant. Le dispositif d'analyse à base de coton est marqué avec des lignes qui pénètrent à mi-chemin à travers le départementh du matériau en coton pour créer un canal d'écoulement qui permet au fluide d'échantillon pour atteindre les tampons réactifs utilisés. Le bord d' absorption du dispositif d' analyse est immergée dans l'échantillon cible, après quoi la solution est mauvais le long du canal fluidique depuis l'extrémité d'absorption aux plots de test (figure 1). Parce que la force d'absorption du tampon d'essai est supérieure à celle du coton, des solutions absorbés par les plots de test sont bien contenus à l'intérieur du papier de tampon d'essai de sorte qu'il n'y a pas de refusion dans le canal fluidique, ainsi que les résultats colorimétriques deviennent ensuite fixés sur la matière de tampon de test. A la fin de la réaction, les résultats colorimétriques sont enregistrés au moyen d'un scanner de bureau, et analysées au moyen du logiciel d'analyse d'images.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ATTENTION: la pratique de l'hygiène de laboratoire appropriée est requise. Les gants et les précautions universelles sont nécessaires lors de l'utilisation de ce dispositif de POC. La contamination des résultats ou l'infection peut se produire si les procédures de stérilisation adéquates ne sont pas effectuées correctement.
1. Préparer dispositifs de bandelettes de test
- Déterminer le caractère hydrophobe de la couche extérieure du coton de nettoyage par une mesure d'angle de contact 8 (figure 3).
- Fabriquez le dispositif d' analyse à base de coton en coupant le nettoyage coton dans 5,5 cm x 1 cm avec un coupe-papier (figure 2A).
- Percer des trous (ø = 0,5 cm) dans une feuille standard de film de lamination en rangées de trois; la distance séparant deux trous suivants est de 1 cm.
NOTE: Jusqu'à 36 bandelettes de test individuelles avec trois zones d'essai chacun peuvent être réalisés en utilisant une feuille standard de film de plastification (5,5 cm x 2 cm) (figure 2B). - Sandwich du coton de nettoyage (characterized par hydrophobie extérieur et hydrophilie intérieur) entre deux morceaux de film de lamination, à savoir, la feuille de trou percé d' un film de lamination sur un côté, et une feuille non forée du film de lamination (pas de trous) de l'autre côté. Placez l'ensemble dans une plastifieuse pour emballer l'appareil. Cela améliore la résistance mécanique de l'appareil, et fournit, une couche imperméable externe.
NOTE: Les diamètres des trous se contracteront de 0,5 cm à 0,47 cm ~ après stratification. Quelques légers écarts demeurent entre le coton de nettoyage et le film de stratification sur le pourtour de chaque trou. Ces légères lacunes facilitent la mise en place de cercles de plaquettes de test réalisés dans une étape ultérieure. - Utilisez une paire de ciseaux pour couper des appareils individuels de bandelettes de test 5,5 cm x 1 cm de l'ensemble, à savoir, la feuille de lamination foré / coton / feuille de lamination non forée "sandwich" (figure 2C). Faire 48 appareils au total pour créer des courbes standards comme décrit plus loin (18 appareilspour l'essai de nitrite, de 15 dispositifs pour l'essai de BSA, et 15 dispositifs pour le dosage de l'urobilinogène).
- Utilisez un couteau ou un rasoir tranchant pour couper une fente (comme un petit canal fluidique) à partir du centre de chaque zone d'essai (non couvert par le film de lamination), à travers et à travers la couche hydrophobe de la zone d'essai à la couche hydrophile du dispositif longitudinal, être prudent pour couper la moitié de la profondeur de l'appareil pris en sandwich (figure 2D).
- Appliquer des plages d'essai de papier (ø = 0,5 cm) en les faisant glisser dans les fentes sur le périmètre de chaque trou dans la tôle (figure 2E).
2. Préparer les normes et indicateurs Solutions pour Urinalysis
- Préparer 10,0 mM solution mère nitrite en dissolvant le nitrite de sodium 69,0 mg dans 100 ml d'eau désionisée (DI). Diluer la solution de nitrite de stocks dans de l' eau DI pour créer une série de solutions de nitrite standard de concentration (2.500, 1.250, 625, 312, 156, et 78 uM) (Figure4A).
- Préparer l'albumine de sérum bovin (BSA) solution mère de 60 pM bovine en dissolvant 415 mg de BSA dans 100 ml d'une solution de PBS (tampon phosphate 10 M, 0,0027 M de chlorure de potassium et 0,137 M de chlorure de sodium; pH 7,0). Diluer la solution mère de BSA dans de l' eau DI pour créer une série de solutions BSA standard de concentration (30, 15, 7,5, 3,75 et 1,875 uM) (figure 4B).
- Préparer 25 g / L urobilinogène solution mère en dissolvant 2,5 g urobilinogène dans 100 ml d'eau DI. Diluer la solution stock urobilinogène dans l' eau DI pour créer une série de solutions de concentration de urobilinogène standard (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 et 125 mg / L) (figure 4C).
- Préparer une solution contenant du nitrite d'indicateur sulfanilamide 50 mM, acide citrique 330 mM, et 10 le N- (1-naphtyl) éthylènediamine.
- Préparer une solution d'indicateur BSA contenant 250 mM de solution de citrate de tampon (pH 1,8) et une solution 3,3 mM de bleu de tétrabromophénol dans 95% d'éthanol.
- Préparer une solution d'indicateur contenant urobilinogène 0,1 M benzaldéhyde 4-diméthylamine.
3. Préparer Pads Indicateur
- Couper trois plaquettes de forme circulaire ou disques (ø = 0,5 cm) de papier chromatographique et insérer chacun d'eux (un pour chaque essai sur la bande de trois test) sur chaque dispositif de bande de test pour créer une courbe standard de la solution (section 4).
- A chacun des trois trous de film de stratification de l'ensemble, observer un léger décalage entre le film de stratification et le tampon de test de coton sur les bords mêmes du trou découpé. A noter, le trou dans le film de stratification est légèrement plus petit en diamètre que le tampon de test de papier.
NOTE: Ensemble, ces caractéristiques permettent au tampon d'essai de papier à appliquer contre la partie de tampon de test de coton de l'appareil afin que les bords de l'essai de papier pad glisser dans la fente mince mentionnée, à savoir, sous les bords du trou de film de lamination. Cela maintient les plots de test de papier en place. - Préparer le Nitrite Assay partie du dispositif.
- Enduire le tampon de dosage de nitrite avec 4 pi de solution de nitrite d'indicateur (préparé à l'étape 2.4) et laisser sécher complètement à température ambiante.
- Préparer le total Portion Protein Assay de l'appareil de détection.
- Enduire le pad totale d'essai de protéine avec 4 pi de solution BSA indicateur (préparé à l'étape 2.5) et laisser sécher complètement à température ambiante.
- Préparer la Portion Uroblinogen Dosage de l'appareil de détection.
- Enduire le tampon de dosage uroblinogen avec 4 pi d'indicateur de uroblinogen (préparé à l'étape 2.6) et laisser sécher complètement à température ambiante.
4. Créer des courbes standard pour l'appareil d'analyse à base de coton
- Pour chaque norme préparée, trempez la fin d'absorption d'un dispositif préparé (préchargé avec des indicateurs d'essai (voir section 3.4)) dans la solution standard pendant 10 secondes (le volume d'absorption ~200 - 300 pi) (figure 2f).
- Placez le dispositif à base de coton dans un environnement ambiant pendant 10 min pour compléter les réactions colorimétriques (Figure 2F). Répétez chaque expérience en triple.
- Balayez l'appareil pour analyser le changement colorimétrique se produisant à chaque plot de test (Figure 2G). Lieu résultant plots de test sur la vitre d'un scanner de bureau et de plots de test de numérisation en mode RVB avec 600 dpi de résolution d'image. Enregistrer chaque image au format jpeg.
- Analyser l'image numérisée sur un ordinateur en utilisant un logiciel d'analyse d'image pour déterminer les intensités de couleur respectives (figure 2H).
- Télécharger le logiciel ImageJ à http://imagej.nih.gov/ij/. Ouvrez les fichiers d'images numérisées. Sélectionnez l'image dans les commandes de menu, puis sélectionnez "Type" pour convertir les images RVB à 8 bits en niveaux de gris.
- Utilisez l'outil "Oval" dans la barre d'outils pour sélectionner la zone d'analyse de tampon d'essai. Sélectionnez "Analyser" dans le menu commands, et sélectionnez "Mesure" pour analyser l'intensité des couleurs. Enregistrement signifie résultats d'intensité.
- Établir les courbes standard de nitrite, des protéines totales, et des essais de urobilinogène (figure 2I).
- Indiquer différentes concentrations de nitrite standard, les protéines totales et les solutions de corrélation urobilinogène et les résultats moyennes d'intensité sur un système de coordonnées à deux dimensions en utilisant un logiciel stastical.
- Monter la courbe standard pour un essai de nitrite par un modèle quadratique et les courbes standard pour protéines et urobilinogène totaux des essais par des modèles de régression linéaire.
5. Déterminer inconnu exemples Concentrations Utilisation établi des valeurs standard Courbe
- Pour déterminer le nitrite, des protéines totales, et les concentrations de urobilinogène dans des solutions inconnues, utiliser l'appareil comme décrit pour la mesure des concentrations de solution standard et de substitution mesuré les résultats d'intensité pour le nitrite, les protéines totales, et urobiessais de linogen dans les équations des modèles construits à l'étape 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons démontré avec succès le développement de dispositifs d' analyse à base de coton à l'aide disponible dans le commerce de coton de nettoyage caractérisée par hydrophile (partie intérieure) et (partie extérieure) des propriétés hydrophobes (Figure 1A). La figure 3 montre les résultats de mesure d'angle de contact. L'interface hydrophobe de coton extérieur était 127,35 ° ± 4,73 °. Du point de vue conviviale, les tests colorimétriques utilisés ici peuvent être observées directement à l'oeil nu, et encore quantifiées par l' intensité des couleurs analyses (Figure 2F). Urine de protéines totales dans un individu normal devrait être inférieure à 150 mg / dl (4 uM). La valeur des ions nitrite d'urine est associée à des infections des voies urinaires ou des infections bactériennes, de sorte que la sensibilité analytique de la détection d'urine de nitrite doit être aussi faible que possible en ce qui concerne le développement de dispositifs d'analyse pour unessai de nitrite. Urobilinogène est éliminée par les matières fécales et récupéré par la circulation entéro - hépatique, mais certains niveaux d'urobilinogène, environ 1 - 4 mg / par jour, peut être trouvée dans l' urine , la figure 4A. - C illustre les résultats de nos efforts pour créer des courbes d' étalonnage pour chaque essai cible. Ces courbes d'étalonnage ont été établies en examinant les résultats moyens d'intensité colorimétrique et en les comparant aux concentrations des concentrations standard que nous avons établi. Cela nous a permis d'évaluer la limite de détection (LOD) pour chaque essai. Les limites de détection pour le nitrite, le BSA, et urobilinogène dans des systèmes tampons sont, 0,147 mM, 3,672 pm et 4,861 mg / L, respectivement. Cela nous a également pourvu d'un cadre mathématique pour déterminer les concentrations de nitrites, de BSA et d'urobilinogène dans des solutions inconnues.
Figure 1 >. Diagramme schématique du dispositif d' analyse à base de coton. Top et en coupe vue images montrent les dimensions de chaque tampon d'essai (0,5 cm de diamètre) et un dispositif à base de coton (1 cm largeur x 5,5 cm de longueur). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Processus de fabrication de dispositif à base de coton analytique, échantillonnage et analyse des résultats. (A) Un coupe-papier a été utilisé pour couper des morceaux de nettoyage du coton à la taille spécifiée. (B) Un stylo a été utilisé pour marquer les emplacements pour la stratification trous de film dans l'ensemble. (C) Une plastifieuse a été utilisé pour prendre en sandwich l'assemblage entre deux couches de film de stratification par chauffage. (D) (G) d' images coupées. (E) Les tampons de test ont été installés sur le dispositif de coton. (F) , urobilinogène, BSA, et les dosages de nitrite ont été réalisées avec notre appareil d' analyse à base de coton. des résultats ont été faites et importé dans un ordinateur à l' aide d' un scanner. (H) un logiciel d'analyse d'image a été utilisée pour analyser les images en échelle de gris analyse de l' état de contraste. (I) les résultats d'intensité obtenus ont été montés dans une courbe standard. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Angle de contact Résultats pour le nettoyage du coton. DI eau (1 pi) a été abandonné sur le coton de externe, Couche hydrophobe pour déterminer l'angle de contact.
Figure 4. Analyse Résultats pour Nitrite, Urobilinogène et BSA sur l' appareil d' analyse à base de coton. Les courbes standard pour (A) nitrite (0,156 à 2,5 mM), (B) BSA (1,875 à 30 uM), (C) urobilinogène ( . 7,8 à 125 uM) pour chaque concentration, des tests ont été effectués en triple et les valeurs de R 2 pour la courbe d' ajustement étaient nitrite: 0,99, BSA: 0,98, et urobilinogène: 0,95. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les étapes critiques dans ce protocole inclus déterminer la combinaison appropriée de tissu de coton (avec plus ou moins hydrophobie / hydrophilie) et du papier filtre (papier filtre de chromatographie ou papier filtre quantitatif). Une conception de dispositif bien planifié et exécuté rend les meilleurs attributs de performance pour les essais colorimétriques. De nos résultats d'analyse colorimétriques, le dispositif d'analyse à base de coton présentée ici démontre un grand potentiel en tant que plate-forme pour la détection des maladies multiples.
La plupart des produits actuels à base de flux latéral (par ex., Test de grossesse) ne fournissent pas plus d'un seul essai functon 14. Alors que certains tests de dipstick effectuer des essais multiples biomarqueurs 15, leur utilisation court le risque de contamination des échantillons de garantie parce que les réactifs de dosage contacter directement des échantillons d'essai. Notre dispositif surmonte cet obstacle et peut être utilisé pour mettre en œuvre de multiples essais colorimétriques dans un seul dispositif latéral basé sur les flux de canal.
Cette méthode est seulement limitée par la taille moléculaire de l'analyte cible. Les valeurs de R 2 et LOD de nitrite sont beaucoup plus grandes que celles des autres dosages (BSA et urobilinogène), ce qui suggère que les dispositifs ne sont plus adaptés à l' analyse de bas poids moléculaire 5 (figure 4).
Certains optimisation supplémentaire peut encore être nécessaire afin d'améliorer l'aspect pratique de ce dispositif pour la pratique clinique. Cette optimisation consiste à améliorer la fiabilité et la stabilité des réactifs d'essai lorsqu'il est exposé à l'environnement extérieur pendant de longues périodes de temps. Néanmoins, nous pensons que cette invention crée une incursion décisive et précieuse dans le développement de dispositifs d'analyse à faible coût qui peut être utilisé de manière fiable dans la pratique clinique, en particulier en ce qui concerne la satisfaction des besoins pour l'analyse rapide et précise et l'analyse de suivi approprié des communicable et les maladies infectieuses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère de Taiwan de la science et de la technologie (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), et Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
