Abstract
Eine robuste, kostengünstige Analysegerät sollte benutzerfreundlich, schnell und erschwinglich sein. Solche Geräte sollten auch in der Lage sein, mit knappen Proben zu betreiben und Informationen für die Behandlung Follow-up zur Verfügung stellen. Hier zeigen wir die Entwicklung eines auf Baumwollbasis Harnanalyse (dh, Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Assays) analytisches Gerät , das eine Lateral - Fluss-basiertes Format verwendet, und kostengünstig ist, leicht hergestellt, schnelle und verwendet werden kann zur Durchführung mehrere Tests ohne Kreuzkontamination Sorgen. Baumwolle wird mit natürlichen Absorptionseigenschaften von Zellulosefasern bestehen, die für die Flow-basierte Analyse genutzt werden können. Die einfache, aber elegante Herstellungsprozess unserer Baumwollbasis Analysegerät wird in dieser Studie beschrieben. Die Anordnung der Baumwollstruktur und Test-Unterlage nutzt die Hydrophobizität und Absorptionsstärke jedes Material. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften können farbmetrischen Ergebnisse beharrlich auf die Probe haftenPad. Dieses Gerät ermöglicht es Ärzten, klinischen Informationen in einer angemessenen Weise zu empfangen und zeigt ein großes Potenzial als Instrument für frühzeitiges Eingreifen.
Introduction
Die Entwicklung von Point-of-Care (POC) Diagnose - Geräte , die erschwinglich, robust und leicht verwendet zur Verbesserung der globalen Gesundheit 1,2 zwingend notwendig ist. Insbesondere bestehen Geräte aus Cellulosesubstraten (zB Papier, Faden und Baumwolle) bieten vielversprechende analytische Plattformen für Low-Cost - Analyse wegen ihrer Allgegenwart, Erschwinglichkeit, einfache Bedienung, Robustheit und Kapazität 3-7 schnelle Ergebnisse zu liefern.
Hier präsentieren wir die Entwicklung eines Baumwollbasierten Analysegerät, der eine Lateral-Flow-basierten Format verwendet zur Urinanalyse. Diese Baumwolle-basierte Analysegerät stellt einen alternativen Nachweis Ansatz mit mehreren wichtigen Vorteile: i) Herstellung mit minimaler menschlicher Anstrengung; ii) niedrige Kosten; iii) die Fähigkeit, werden verwendet, um mehrere verschiedene Assays ohne Kreuzkontamination betrifft zuführen; . iv) Geräteunabhängigkeit, dh die Fähigkeit , ohne zusätzliche Geräte und / oder Strom betrieben werden; und, v) Geschwindigkeit (kolorimetrische Assays können innerhalb von 10 min) durchgeführt werden.
Die Struktur dieser Baumwollbasis Analysegerät kann in vier Teile unterteilt werden: i) Baumwolle, die auf ihrer äußeren hydrophoben Schicht natürlich hydrophob ist; ii) Baumwolle, die intern hydrophil ist, und dient als ein Transportkanal für Flüssigkeit wicking; iii) Laminieren Film, bindet und komprimiert die Baumwolle verwendet werden, sondern enthält Löcher für die Platzierung von Reaktions- / Test-Pads herausgebohrt; und iv) Chromatographiepapier Testpads, die beschichtet sind / eingebettet mit reaktiven Reagenzien, auf der äußeren Oberfläche der Baumwolle gelegt (insbesondere in dem Raum aus dem Laminatfilm gebohrt) als Reaktionsbereiche für kolorimetrische Assays (dh, Nitrit, Gesamtprotein, pH-Wert und Urobilinogen-Assays) und Ergebnisanzeige.
Der zugrunde liegende Mechanismus des Tests ist wie folgt. Die Baumwolle-basierte Analysegerät ist mit Linien erzielt, die auf halbem Weg durch den Abt eindringenh des Baumwollmaterial einen Strömungskanal zu schaffen, die Probenflüssigkeit erlaubt die reaktiven Pads zu erreichen ist. Die Absorptionskante des analytischen Hilfsmittels in die Zielprobe eingetaucht, worauf die Lösung entlang der Fluid - Kanal aus dem Absorptionsende zu den Prüfkontaktflächen (Abbildung 1) Losen ist. Weil die Absorptionsstärke der Test-Unterlage ist größer als die aus Baumwolle, die von den Test-Pads absorbierten Lösungen sind fest innerhalb der Test-Unterlage Papier enthalten, so daß es keine Reflow zurück in den Fluidkanal ist, und die farbmetrischen Ergebnisse sich in der Folge auf der festen Testkissenmaterial. Am Ende der Reaktion kolorimetrischen Ergebnisse werden über einen Desktop-Scanner erfasst und mittels Bildanalysesoftware analysiert.
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Protocol
ACHTUNG: Die richtige Laborhygienepraxis ist nicht erforderlich. Handschuhe und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, wenn diese POC-Gerät. Verunreinigung von Ergebnissen oder Infektion kann auftreten, wenn eine ausreichende Sterilisationsverfahren sind nicht richtig durchgeführt wird.
1. Bereiten Sie den Teststreifen-Geräte
- Bestimmung der Hydrophobizität der Außenschicht des Reinigungs Baumwolle durch Kontaktwinkelmessung 8 (Figur 3).
- Fabrizieren die Baumwollbasis analytischen Hilfsmittels durch Schneiden Reinigungs Baumwolle in 5,5 cm x 1 cm - Stücke mit einem Papierschneider (2A).
- Die Bohrungen (ø = 0,5 cm) in einem Standard-Blatt Laminierungfilm in Reihen von drei; der Abstand zwischen zwei aufeinanderfolgenden Löchern ist 1 cm.
HINWEIS: Nicht weniger als 36 einzelne Teststreifen mit drei Testflächen jeweils hergestellt werden , um ein Standardblatt Laminierfolie (5,5 cm x 2 cm) (2B) verwendet wird . - Sandwich die Reinigung Baumwolle (characterized durch äußere Hydrophobizität und Innen Hydrophilie) zwischen zwei Stücken Laminierungfilm, dh das Loch gebohrt Blatt Laminierungfilm auf der einen Seite, und ungebohrter Blatt Laminierungfilm (ohne Löcher) auf der anderen Seite. Platzieren der Anordnung in einem Laminator die Vorrichtung zu verpacken. Dies erhöht die mechanische Festigkeit des Geräts und bietet eine externe, undurchlässige Schicht.
HINWEIS: Die Durchmesser der Löcher von 0,5 cm schrumpfen auf ~ 0,47 cm nach der Laminierung. Einige geringfügige Lücken zwischen der Reinigung Baumwolle und Laminierungfilm um den Umfang jedes Lochs verbleiben. Diese geringfügige Lücken erleichtern die Platzierung von Testfeld Kreise in einem nachfolgenden Schritt. - Verwenden Sie ein Paar Schereneinzel 5,5 cm x 1 cm Teststreifenvorrichtungen von der Baugruppe zu schneiden, dh das gebohrte Lamellenblechart / Wattepad / ungebohrter Lamellenblechart "Sandwich" (Abbildung 2C). Machen Sie 48 Geräte Standardkurven zu erstellen insgesamt wie später beschrieben wird (18 Gerätefür die Nitrit-Test, 15 Geräte für den BSA-Test und 15 Geräte für den Urobilinogen-Test).
- Mit einem scharfen Messer oder einer Rasierklinge einen Schlitz (als kleiner fluidischen Kanal) von der Mitte eines jeden Testbereich (nicht abgedeckt durch Laminieren Film) zu schneiden, über und durch die hydrophobe Schicht von Testfläche auf der hydrophilen Schicht der Längsvorrichtung, wobei vorsichtig Hälfte der Tiefe der sandwichartig Einrichtung (2D) zu schneiden.
- Anwenden Papier Prüfkontaktflächen (ø = 0,5 cm) , indem sie in die Zwischenräume am Umfang jedes Lochs in der Laminierungsrichtung (2E) gleitet.
2. Bereiten Sie Standards und Indikatorlösungen für Urinalysis
- Bereiten 10,0 mM Nitrit Stammlösung durch Auflösen von 69,0 mg Natriumnitrit in 100 ml entionisiertes (DI) Wasser. Verdünnen Sie die Nitrit - Stammlösung in DI - Wasser eine Reihe von Nitrit - Konzentration Standardlösungen zu schaffen (2500, 1250, 625, 312, 156 und 78 & mgr; M) (Abbildung4A).
- Vorbereitung 60 uM Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung durch Auflösen von 415 mg BSA in 100 ml PBS-Lösung (10 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,0). Verdünne die BSA - Stammlösung in entionisiertem Wasser eine Reihe von BSA - Konzentration von Standardlösungen zu schaffen (30, 15, 7,5, 3,75 und 1,875 & mgr; M) (4B).
- Bereiten Sie 25 g / L urobilinogen Stammlösung durch Auflösen von 2,5 g Urobilinogen in 100 ml VE-Wasser. Verdünnen Lager urobilinogen Lösung in VE - Wasser eine Reihe von Urobilinogen Konzentration Standardlösungen zu schaffen (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 und 125 mg / L) (4C).
- Bereiten Nitrit Indikatorlösung, die 50 mM Sulfanilamid, 330 mM Citronensäure und 10 mM N- (1-Naphthyl) ethylendiamin-dihydrochlorid.
- Bereiten BSA-Indikatorlösung, die 250 mM Citrat-Pufferlösung (pH 1,8) und 3,3 mM Lösung von Tetrabromphenolblau in 95% Ethanol.
- Bereiten Sie urobilinogen Indikatorlösung 0,1 M 4-Dimethylamine Benzaldehyd enthalten.
3. Bereiten Sie Indikator-Pads
- Cut drei kreisförmige Kissen oder Scheiben (ø = 0,5 cm) aus der Chromatographie Papier und legen Sie jede von ihnen (eine für jeden Test auf dem Drei-Teststreifen) auf jedem Teststreifen-Gerät eine Lösung Standardkurve (Abschnitt 4) zu erstellen.
- An jedem der drei Laminierungfilm Löcher der Montage, eine kleine Lücke zwischen dem Laminierungfilm beobachten und den Baumwolltestfeld an den äußersten Rand des geschnittenen Loch. Beachten Sie, das Loch in der Laminierfolie ist im Durchmesser etwas kleiner als die Papiertestkissen.
HINWEIS: Zusammen stellen diese Funktionen ermöglichen es dem Papier Testkissen gegen das Testfeld Teil der Vorrichtung Baumwolle angewandt werden , so dass die Ränder des Papiers Testfeld Schlicker in die schlanke Lücke erwähnt, dh unter den Rändern des Laminierungfilm Loch. Dies hält die Papier Test-Pads an Ort und Stelle. - Bereiten Sie die Nitrite Assay Teil der Vorrichtung.
- Bestreichen Sie die Nitrit-Assay-Pad mit 4 ul Nitrit Indikatorlösung (hergestellt in Schritt 2.4) und lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur trocknen.
- Bereiten Sie die Gesamtprotein-Assay Portion der Erfassungsvorrichtung.
- Coat die Gesamtproteinassay-Pad mit 4 & mgr; l BSA-Indikatorlösung (hergestellt in Schritt 2.5) und ermöglichen es vollständig bei Umgebungstemperatur trocknen.
- Bereiten Sie die Uroblinogen Assay Portion der Erfassungsvorrichtung.
- Mantel der uroblinogen Assay-Pad mit 4 ul uroblinogen Indikator (hergestellt in Schritt 2.6) und lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur trocknen.
4. Erstellen von Standardkurven für die Cotton-basierte Analysegerät
- Für jeden Standard vorbereitet, tauchen die Absorptions Ende eines vorbereiteten Gerät (mit Test Indikatoren vorbelastet (Abschnitt 3.4) zu sehen) in die Standardlösung für 10 sec (das Absorptionsvolumen ~200-300 ul) (2F).
- Legen Sie die Baumwolle-basierten Gerät in einer Umgebung für 10 min kolorimetrischen Reaktionen (2F) zu vervollständigen. Wiederholen Sie jede Experiment in dreifacher Ausfertigung.
- Scannen Sie das Gerät die kolorimetrische Änderung zu analysieren an jedem Testfeld auftritt (2G). Ort resultierenden Testflächen auf dem Glas eines Desktop-Scanner und Scan-Test-Pads in RGB-Modus mit 600 dpi der Bildauflösung. Speichern Sie jedes Bild im JPEG-Format.
- Analysieren des gescannten Bildes auf einer Computerbildanalysesoftware unter Verwendung der jeweiligen Farbintensitäten (Figur 2H) , um zu bestimmen.
- Download von ImageJ Software bei http://imagej.nih.gov/ij/. Öffnen Sie die gescannten Bilddateien. Wählen Sie das Bild in den Menübefehlen, und wählen Sie "Type" in RGB-Bilder in 8-Bit Graustufen umwandeln.
- Verwenden Sie das "Oval" in der Werkzeugleiste das Testfeld Analysebereich zu wählen. Wählen Sie "Analysieren" im Menü commands, und wählen Sie "Messen" Farbintensität zu analysieren. Nehmen mittlere Intensität Ergebnisse.
- Stellen Sie die Standardkurven von Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Assays (2I).
- Zeigen verschiedene Konzentrationen von Standard Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Lösungen und korrelierte mittlere Intensität Ergebnisse auf einem zweidimensionalen Koordinatensystem stastical Software.
- Den Standardkurve für einen Nitrit-Assay durch ein quadratisches Modell und die Standardkurven für Gesamtprotein und Urobilinogen Assays durch lineare Regressionsmodelle.
5. Bestimmen Unbekannte Probenkonzentrationen mit etablierten Standardkurve Werte
- Um zu bestimmen, Nitrit, Gesamtprotein und Urobilinogen Konzentrationen in unbekannten Lösungen, verwenden Sie das Gerät wie zur Messung Standardlösungskonzentrationen und Ersatz gemessene Intensität Ergebnisse für Nitrit, Gesamtprotein beschrieben, und urobilinogen Assays in die Gleichungen der integrierten Modelle in Schritt 2 aus.
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Representative Results
Wir haben gezeigt , erfolgreich die Entwicklung von Baumwolle-basierten Analysegeräte von durch hydrophile (inneren Teil) und hydrophoben (Außenbereich) Eigenschaften (1A) gekennzeichnet kommerziell erhältliche Reinigungs Baumwolle verwenden. 3 sind die Ergebnisse der Kontaktwinkelmessung zeigt. Die hydrophobe Oberfläche von außen Baumwolle war 127,35 ° ± 4,73 °. Von einer benutzerfreundlichen Perspektive hier verwendeten farbmetrischen Assays direkt mit dem bloßen Auge beobachtet werden konnte, und weiter durch Farbintensität Analysen quantifiziert (2F). Urin Gesamtprotein in einem normalen Individuum sollte weniger als 150 mg / dl (4 uM). Der Wert des Urins Nitrit-Ionen mit Infektionen der Harnwege oder bakterielle Infektionen assoziiert, so dass die analytische Sensitivität des Urins Nitrit Erkennung sollte so niedrig wie möglich sein, wenn es um die Entwicklung von Analysegeräten für eine kommtNitrit-Test. Urobilinogen wird durch den Kot ausgeschieden und durch den enterohepatischen Kreislauf zurückgewonnen, aber einige Stufen Urobilinogen, ca. 1 - 4 mg / Tag, im Urin gefunden werden 4A -. C zeigt die Ergebnisse unserer Bemühungen für jeden Test Standardkurven zu erstellen Ziel. Diese Standardkurven wurden etabliert durch mittlere kolorimetrischen Intensität Ergebnisse untersuchen und sie auf die Konzentrationen von Standardkonzentrationen zu vergleichen, die wir etabliert. Dies erlaubte uns, die Grenze der Detektionen (LOD) für jeden Test zu bewerten. Die LOD für Nitrit, BSA und Urobilinogen in Puffersysteme waren, 0,147 mM, 3,672 uM und 4,861 mg / L, respectively. Dies gab uns auch einen mathematischen Rahmen für die Konzentration von Nitrit zu bestimmen, BSA und Urobilinogen in unbekannten Lösungen.
Abbildung 1 >. Schematische Darstellung der Cotton-basierten Analysegerät. Nach oben und Querschnittsbilder , die Abmessungen jedes Testfeld (0,5 cm Durchmesser) und Baumwolle-Gerät (1 cm Breite x 5,5 cm Länge) anzuzeigen Ansicht. Klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Herstellungsprozess von Cotton-basierten Analysegerät, Probenahme und Analyse zur Verfügung . (A) Ein Papierschneider verwendet wurde Stücke Reinigung Baumwolle auf die angegebene Größe zu schneiden. (B) Ein Stift wurde verwendet , um die Standorte für die Laminierung zu markieren Filmöffnungen in der Baugruppe. (C) einem Laminator sandwichartig durch Erhitzen der Anordnung zwischen zwei Schichten aus Laminierfolie verwendet wurde. (D) (E) Die Testfelder auf dem Baumwoll Gerät installiert wurden. (F) Urobilinogen, BSA und Nitrit - Tests wurden mit unseren Baumwollbasis Analysegerät. (G) Bilder durchgeführt mit Hilfe eines Scanners der Ergebnisse wurden in einem Computer hergestellt und importiert werden . (H) Bildanalyse - Software wurden die Bilder von Graustufenkontrast Zustandsanalyse. (I) die erhaltenen Intensität Ergebnisse in eine Standard - Kurve angepasst zu analysieren verwendet wurde. Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur sehen.
Abbildung 3. Kontaktwinkel Ergebnisse für die Reinigung Baumwolle. DI - Wasser (1 ul) wurde auf die Baumwolle ist gesunken Außen, Hydrophobe Schicht Kontaktwinkel zu bestimmen.
Abbildung 4. Analyseergebnisse für Nitrit, Urobilinogen und BSA auf Baumwolle basierenden Analysegerät. Die Standardkurven für (A) Nitrit (0,156 bis 2,5 mM), (B) BSA (1,875 bis 30 & mgr; M), (C) Urobilinogen ( . 0,99, BSA: 0,98 und Urobilinogen: - 7,8 125 & mgr; M) für jede Konzentration wurden Tests in dreifacher Ausfertigung und die R 2 Werte für die Ausgleichskurve waren Nitrit durchgeführt 0,95. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte in diesem Protokoll enthalten, die geeignete Kombination aus Baumwollmaterial zu bestimmen (mit unterschiedlicher Hydrophobizität / Hydrophilie) und Filterpapier (Chromatographie Filterpapier oder quantitative Filterpapier). Eine gut geplante und durchgeführte Gerätedesign macht die beste Leistung für kolorimetrische Assays Attribute. Aus unserer Farbtestergebnisse, die auf Baumwollbasis hier vorgestellten Analysegerät zeigt großes Potenzial als Plattform für mehrere Krankheitserkennung.
Die meisten aktuellen Lateral - Flow-Basis - Produkte (z. B. Schwangerschaftstest) bieten nicht mehr als einen einzigen Test functon 14. Während einige Peilstab Tests Tests mit mehreren Biomarkern 15 durchführen, läuft deren Verwendung das Risiko von Sicherheiten Probenkontamination , da Testreagenzien direkt Testproben in Verbindung. Unsere Vorrichtung überwindet dieses Hindernis und können verwendet werden, um mehrere kolorimetrische Assays in einem einzigen Lateralfluss-basierte Kanal-Vorrichtung zu implementieren.
Diese Methode wird von Zielanalyten Molekülgröße begrenzt. Die R 2 und LOD - Werte von Nitrit sind viel größer als die der anderen Assays (BSA und Urobilinogen), was darauf hindeutet , dass unsere Systeme besser geeignet für niedrige molekulare Analyse 5 (Figur 4) sind.
Einige weitere Optimierung kann noch erforderlich sein, um die Praktikabilität dieses Gerätes für die klinische Praxis zu verbessern. Diese Optimierung umfasst die Verbesserung der Zuverlässigkeit und Stabilität der Assayreagenzien, wenn an die äußere Umgebung für längere Zeiträume ausgesetzt sind. Trotzdem glauben wir, dass diese Erfindung eine entscheidende und wertvolle inroad in die Entwicklung von Low-Cost-Analysegeräten erstellt, die zuverlässig in der klinischen Praxis eingesetzt werden können, vor allem im Hinblick auf die Bedürfnisse für eine schnelle und genaue Analyse und geeignete Follow-up-Analyse von übertragbaren Erfüllung und Infektionskrankheiten.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus Taiwan Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)) und Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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