Abstract
Una robusta, dispositivo di analisi a basso costo dovrebbe essere facile da usare, rapida e conveniente. Tali dispositivi devono essere in grado di operare con campioni scarsi e fornire informazioni per trattamento di follow-up. Qui, dimostriamo lo sviluppo di un urine a base di cotone (cioè, nitrito, proteina totale, e urobilinogeno saggi) strumento analitico che utilizza un formato basato sul flusso laterale, ed è poco costoso, facilmente fabbricato, rapida, e può essere utilizzato per condurre più test senza preoccupazioni la contaminazione incrociata. Cotton è composto da fibre di cellulosa con proprietà assorbenti naturali che possono essere sfruttate per analisi di flusso basati. La semplice ma elegante processo di fabbricazione del nostro dispositivo di analisi a base di cotone è descritto in questo studio. La disposizione del tampone struttura in cotone e prova approfitta della idrofobicità e la forza di assorbimento di ciascun materiale. A causa di queste caratteristiche fisiche, risultati colorimetrici possono costantemente aderire alla provapad. Questo dispositivo consente ai medici di ricevere informazioni cliniche in modo tempestivo e mostra un grande potenziale come strumento di intervento precoce.
Introduction
Lo sviluppo di point-of-care (POC) dispositivi diagnostici che sono accessibili, robusta e facilmente utilizzato è di importanza fondamentale per il miglioramento della salute globale 1,2. In particolare, i dispositivi composti da substrati cellulosici (ad esempio, carta, filo e cotone) fornire piattaforme analitiche promettenti per l'analisi a basso costo a causa della loro ubiquità, la convenienza, la facilità d'uso, la robustezza e la capacità di fornire risultati rapidi 3-7.
Qui, sveliamo lo sviluppo di un dispositivo di analisi a base di cotone che utilizza un formato basato sul flusso laterale per analisi delle urine. Questo dispositivo di analisi a base di cotone fornisce un approccio di rilevamento alternativo con diversi vantaggi: i) la fabbricazione con uno sforzo umano minimo; ii) a basso costo; iii) la capacità di essere utilizzato per condurre più, saggi differenti senza preoccupazioni contaminazione incrociata; . iv) indipendenza dal dispositivo, cioè la capacità di essere eseguito senza attrezzature e / o energia elettrica supplementare; e, v) Velocità (test colorimetrici può essere completato entro 10 min).
La struttura di questo dispositivo di analisi a base di cotone può essere diviso in quattro parti: i) di cotone che è naturalmente idrofobico sul suo strato idrofobo esterna; ii) di cotone che è internamente idrofila e serve come canale di trasporto per l'assorbimento di liquido; iii) pellicola di laminazione che lega e comprime il cotone utilizzato, ma contiene forato i fori per il posizionamento di tamponi reazione / di prova; e, iv) test pad cromatografia su carta, che sono rivestiti / integrati con reagenti reattivi, poste sulla superficie esterna del cotone (specificamente, nello spazio forato dalla pellicola di laminazione) come aree di reazione per test colorimetrici (cioè, nitriti, proteine totali, pH, e saggi urobilinogeno) e la visualizzazione dei risultati.
Il meccanismo alla base del test è la seguente. Il dispositivo di analisi a base di cotone è segnato con linee che penetrano a metà strada attraverso il repartoh del materiale di cotone per creare un canale di flusso che permette al fluido campione raggiunga le pastiglie reattivi utilizzati. Il bordo di assorbimento del dispositivo analitico è immerso nel campione di destinazione, dopodiché la soluzione è empio lungo il canale fluidico dall'estremità assorbimento ai pad di test (Figura 1). Poiché la forza di assorbimento del tampone di test è maggiore di quella del cotone, soluzioni assorbite dalle piazzole di test sono saldamente contenute all'interno del pad carta di prova in modo che non ci sia reflow indietro nel canale fluidica, ei risultati colorimetrici diventano successivamente fissati sulla pad materiale di prova. Al termine della reazione, i risultati colorimetrici vengono registrati tramite uno scanner da tavolo, e analizzati mediante software di analisi di immagine.
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Protocol
ATTENZIONE: è necessario Una corretta pratica di laboratorio di igiene. Guanti e precauzioni universali sono necessari quando si utilizza questo dispositivo POC. La contaminazione dei risultati o infezione può verificarsi se adeguate procedure di sterilizzazione non vengono effettuate in modo corretto.
1. Preparare Devices striscia di prova
- Determinare l'idrofobicità dello strato esterno del cotone purificazione mediante misurazione dell'angolo di contatto 8 (Figura 3).
- Realizzare il dispositivo analitico a base di cotone tagliando cotone pulizia in 5,5 cm x 1 cm pezzi con un taglierino (Figura 2A).
- Praticare dei fori (ø = 0,5 cm) in un normale foglio di pellicola di laminazione in file di tre; la distanza tra due fori successivi è 1 cm.
NOTA: ben 36 strisce di test individuali con tre aree di prova ciascuno può essere effettuato con un normale foglio di pellicola di laminazione (5,5 cm x 2 cm) (Figura 2B). - Sandwich cotone pulizia (characterizcato da idrofobicità esterno e idrofilicità interni) tra due pezzi di pellicola di laminazione, vale a dire, il foglio foro trapanato di laminazione di film su un lato, ed un foglio non forata di plastificazione (senza fori) dall'altro lato. Posizionare il gruppo in una plastificatrice per confezionare il dispositivo. Questo migliora la resistenza meccanica del dispositivo, e fornisce un, strato impermeabile esterna.
NOTA: I diametri dei fori si restringono da 0,5 cm a ~ 0,47 cm dopo la laminazione. Alcune lievi lacune rimarranno tra il cotone pulizia e la pellicola di laminazione lungo il perimetro di ciascun foro. Queste leggere lacune facilitano il posizionamento di cerchi pad di test effettuati in una fase successiva. - Utilizzare un paio di forbici per tagliare singoli 5,5 cm x 1 cm dispositivi strisce reattive dal gruppo, vale a dire, il foglio di laminazione forata / batuffolo di cotone / foglio di laminazione non forata "sandwich" (Figura 2C). Fare 48 dispositivi totali per creare curve standard come descritto più avanti (18 dispositiviper il saggio nitriti, 15 dispositivi per il dosaggio BSA e 15 dispositivi per il dosaggio urobilinogeno).
- Usare un coltello affilato o rasoio per tagliare una fessura (come un canalino fluidico) dal centro di ogni area di prova (non coperta dalla pellicola di laminazione), attraverso e attraverso lo strato idrofobo di area di test allo strato idrofilo del dispositivo longitudinali, essendo cauto per tagliare a metà della profondità del dispositivo sandwich (Figura 2D).
- Applicare test pad carta (ø = 0,5 cm) facendole scorrere nelle fessure sul perimetro di ogni foro nella laminazione (figura 2E).
2. Preparare Norme e Indicatore Soluzioni per analisi delle urine
- Preparare 10,0 mm di soluzione di nitrito sciogliendo 69,0 mg di nitrito di sodio in 100 ml di acqua deionizzata (DI). Diluire la soluzione di nitrito magazzino in acqua deionizzata per creare una serie di soluzioni standard di nitrito concentrazione (2.500, 1.250, 625, 312, 156, e 78 micron) (Figura4A).
- Preparare 60 micron albumina sierica bovina (BSA) stock soluzione sciogliendo 415 mg di BSA in 100 ml di soluzione PBS (tampone di 10 M di fosfato, cloruro di potassio 0,0027 M e 0,137 di cloruro di sodio M; pH 7,0). Diluire la soluzione madre BSA in acqua deionizzata per creare una serie di soluzioni standard di concentrazione BSA (30, 15, 7,5, 3,75 e 1,875 mM) (Figura 4B).
- Preparare 25 g / L urobilinogeno di soluzione sciogliendo 2,5 g urobilinogeno in 100 ml di acqua deionizzata. Diluire soluzione madre urobilinogeno in acqua deionizzata per creare una serie di soluzioni di concentramento urobilinogeno standard (7,8, 15,6, 31,2, 62,5, e 125 mg / L) (Figura 4C).
- Preparare la soluzione indicatore nitrito contenente 50 mM Sulfanilamide, 330 mM acido citrico, e 10 mm N- (1-naftil) etilendiammina dicloridrato.
- Preparare la soluzione indicatore BSA contenente 250 mM soluzione tampone citrato (pH 1,8) e 3,3 mM soluzione di tetrabromophenol blu in etanolo al 95%.
- Preparare la soluzione indicatore dell'urobilinogeno contenente 0,1 M 4-Dimetilammina benzaldeide.
3. Preparare Pads Indicator
- Tagliare tre pastiglie di forma circolare o dischi (Ø = 0,5 cm) di carta per cromatografia e inserire ciascuno di loro (uno per ogni test sulla striscia di tre test) su ogni dispositivo striscia reattiva per creare una curva standard soluzione (sezione 4).
- In ciascuna delle tre fori pellicola di laminazione del montaggio osservare un piccolo spazio tra la pellicola di laminazione e test batuffolo di cotone ai più bordi del foro taglio. Nota, il foro nella pellicola di laminazione è di diametro leggermente inferiore rispetto al pad di test carta.
NOTA: Insieme, queste caratteristiche permettono al pad di test carta da applicare contro la parte di tampone di prova di cotone del dispositivo in modo che i bordi del test pad carta slittamento nella fessura sottile menzionato, cioè, sotto i bordi del foro laminazione film. Questo vale le pastiglie di prova carta in posizione. - Preparare il Nitrito Assay porzione del dispositivo.
- Rivestire il pad test nitriti con 4 ml di soluzione di nitrito di indicatore (preparata al punto 2.4) e lasciarlo asciugare completamente a temperatura ambiente.
- Preparare la Total Protein Assay porzione del dispositivo di rilevamento.
- Rivestire il pad totale dosaggio di proteine con 4 ml di soluzione di BSA indicatore (preparata al punto 2.5) e lasciarlo asciugare completamente a temperatura ambiente.
- Preparare la porzione Uroblinogen test del dispositivo di rilevazione.
- Rivestire il pad test uroblinogen con 4 ml di indicatore uroblinogen (preparata al punto 2.6) e lasciarlo asciugare completamente a temperatura ambiente.
4. Creare curve standard per il dispositivo di analisi a base di cotone
- Per ogni standard preparata, immergere la fine di assorbimento di un dispositivo preparato (precaricato con indicatori di analisi (vedi sezione 3.4)) nella soluzione standard per 10 secondi (il volume assorbimento ~200 - 300 ml) (Figura 2F).
- Posizionare il dispositivo a base di cotone in un ambiente ambiente per 10 minuti per completare le reazioni colorimetriche (Figura 2F). Ripetere ogni esperimento in triplice copia.
- Eseguire la scansione del dispositivo per analizzare la variazione colorimetrica che si verificano a ogni pad di test (Figura 2G). Luogo risultante pastiglie di test sul vetro di uno scanner desktop e pastiglie di prova di scansione in modalità RGB con 600 dpi di risoluzione dell'immagine. Salva ogni immagine in formato jpeg.
- Analizzare l'immagine acquisita su un computer utilizzando il software di analisi dell'immagine per determinare rispettive intensità di colore (Figura 2H).
- Scarica il software ImageJ a http://imagej.nih.gov/ij/. Aprire i file di immagini acquisiti. Selezionare l'immagine nei comandi di menu e selezionare "Tipo" per convertire le immagini RGB a 8-bit in scala di grigi.
- Utilizzare lo strumento "ovale" nella barra degli strumenti per selezionare l'area analitica pad di prova. Selezionare "Analyze" nel menù commands, e selezionare "Measure" per analizzare l'intensità del colore. Record significa risultati di intensità.
- Stabilire le curve standard di nitrito, proteine totali, e saggi di urobilinogeno (Figura 2i).
- Indicare diverse concentrazioni di nitrito di serie, proteine totali, e soluzioni urobilinogeno e correlata risultati medi di intensità su un sistema di coordinate bidimensionali utilizzando software stastical.
- Montare la curva standard per un saggio di nitriti da un modello quadratico e le curve standard per un totale di saggi di proteine e urobilinogeno di modelli di regressione lineare.
5. determinare le concentrazioni campione sconosciuto Utilizzando stabilito valori standard curva
- Per determinare nitriti, proteine totali, e le concentrazioni di urobilinogeno nelle soluzioni sconosciute, utilizzare il dispositivo come descritto per la misurazione delle concentrazioni di soluzioni standard e sostitutive misurato risultati intensità per nitriti, proteine totali, e urobisaggi linogen nelle equazioni dei modelli costruiti nel passaggio 2.
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Representative Results
Abbiamo dimostrato con successo lo sviluppo di dispositivi analitici cotone-based utilizzando disponibili in commercio cotone Risanamento caratterizzata da idrofila (porzione interna) e le proprietà idrofobe (parte esterna) (Figura 1A). La Figura 3 mostra i risultati della misurazione dell'angolo di contatto. L'interfaccia idrofobica di cotone esterno era 127.35 ° ± 4,73 °. Dal punto di vista user-friendly, test colorimetrici impiegati qui possono essere osservati direttamente ad occhio nudo, e l'ulteriore quantificati attraverso l'intensità del colore analisi (Figura 2F). Urina proteine totali in un individuo normale dovrebbe essere inferiore a 150 mg / dl (4 mM). Il valore di urina ioni nitrito è associata con infezioni del tratto urinario o infezioni batteriche, quindi la sensibilità analitica di rivelazione urine nitriti dovrebbe essere il più basso possibile per quanto riguarda lo sviluppo di dispositivi analitici per untest nitriti. Urobilinogeno viene escreto dai feci e recuperato dalla circolazione enteroepatica, ma alcuni livelli di urobilinogeno, a circa 1-4 mg / al giorno, può essere trovato nelle urine Figura 4A -. C illustra i risultati dei nostri sforzi per creare curve standard per ciascun test bersaglio. Queste curve standard sono stati stabiliti esaminando medi risultati intensità colorimetrica e confrontandole con le concentrazioni di concentrazioni standard che abbiamo stabilito. Questo ci ha permesso di valutare il limite di rilevamenti (Lods) per ogni test. I limiti di determinazione per nitriti, BSA, e urobilinogeno in sistemi tampone sono stati, 0.147 mM, 3.672 micron e 4.861 mg / L, rispettivamente. Questo anche fornito una struttura matematica per determinare le concentrazioni di nitrito, BSA, e urobilinogeno in soluzioni incognite.
Figura 1 >. Schema di dispositivo analitica a base di cotone. Superiore e la sezione trasversale vista immagini mostrano le dimensioni di ogni pad di test (0,5 cm di diametro) e il dispositivo a base di cotone (1 cm Lunghezza di larghezza x 5,5 cm). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. processo di fabbricazione del dispositivo di cotone a base analitica, campionamento e analisi dei risultati. (A) Una taglierina è stato usato per tagliare pezzi di cotone di pulizia per la dimensione specificata. (B) Una penna è stato utilizzato per segnare i punti per la laminazione fori di film nell'assieme. (c) una plastificatrice è stato utilizzato per l'assemblaggio a sandwich tra due strati di pellicola di laminazione di riscaldamento. (D) (E) I rilievi di prova sono stati installati sul dispositivo di cotone. (F) Urobilinogeno, BSA, e saggi di nitriti sono stati eseguiti con il nostro dispositivo di analisi a base di cotone. (G) Immagini dei risultati sono state fatte e importati in un computer utilizzando uno scanner. (H) software di analisi delle immagini è stato utilizzato per analizzare le immagini di scala di grigi analisi dello stato di contrasto. (i) i risultati di intensità ottenuti sono stati montati in una curva standard. si prega di fare clic su qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Angolo di contatto Risultati per la pulizia di cotone. Acqua deionizzata (1 ml) è stata abbandonata sul cotone del esterna, Strato idrofobo per determinare l'angolo di contatto.
Figura 4. I risultati delle analisi per nitrito, Urobilinogeno, e BSA su Device Analytical a base di cotone. Le curve standard per (A) nitriti (,156-2,5 mm), (B) BSA (1,875-30 micron), (C) urobilinogen ( . 7,8-125 micron) per ogni concentrazione, i test sono stati eseguiti in triplice copia e R 2 valori per la curva di raccordo erano nitrito: 0.99, BSA: 0,98, e urobilinogeno: 0.95. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
passaggi critici in questo protocollo inclusi determinare la combinazione appropriata di tessuto di cotone (con vari idrofobicità / idrofilicità) e carta da filtro (carta da filtro cromatografia o carta da filtro quantitativa). Un disegno dispositivo ben pianificato ed eseguito rende attribuisce le migliori prestazioni per test colorimetrici. Dai nostri risultati del test colorimetrici, il dispositivo di analisi a base di cotone presentato qui dimostra un grande potenziale come piattaforma per il rilevamento della malattia multipla.
La maggior parte dei prodotti attuali laterale flusso-base (ad es., Test di gravidanza) non forniscono più di un singolo test functon 14. Mentre alcuni test astina eseguire saggi multipli biomarker 15, il loro uso corre il rischio di contaminazione del campione garanzie perché i reagenti contattare direttamente campioni di prova. Il nostro dispositivo supera questo ostacolo e può essere utilizzato per implementare più test colorimetrici in un unico dispositivo a canale basato sul flusso laterale.
Questo metodo è limitato solo dalla porta analita dimensione molecolare. I valori di R 2 e LOD di nitrito sono molto superiori a quelle degli altri saggi (BSA e urobilinogeno), suggerendo che i nostri dispositivi sono più adatti per partire analisi molecolari 5 (Figura 4).
Qualche ulteriore ottimizzazione può essere ancora necessario per migliorare la praticità di questo dispositivo per la pratica clinica. Questa ottimizzazione include migliorare l'affidabilità e stabilità dei reagenti dosaggio quando esposto all'ambiente esterno per lunghi periodi di tempo. Tuttavia, crediamo che questa invenzione crea una incursione decisivo e prezioso nello sviluppo di dispositivi di analisi a basso costo che può essere utilizzato in modo affidabile nella pratica clinica, in particolare per quanto riguarda soddisfare le esigenze per l'analisi rapida e precisa e adeguata analisi di follow-up di trasmissibili e le malattie infettive.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), e Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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