Abstract
堅牢、低コストの分析装置は、ユーザーフレンドリーな、迅速、かつ手頃な価格でなければなりません。このようなデバイスはまた、乏しいサンプルで動作することが可能とフォローアップ治療のための情報を提供すべきです。ここでは、側方流動ベースのフォーマットを採用し、かつ、容易に迅速な、安価な製造され、かつ実施するために使用することができる（ すなわち 、亜硝酸塩、総タンパク質、及びウロビリノーゲンアッセイ）分析装置綿ベースの尿検査の開発を実証します交差汚染の心配のない複数のテスト。綿は、フローベースの分析のために活用することができる天然の吸収特性を有するセルロース繊維から構成されています。我々の綿ベースの分析装置のシンプルだがエレガントな製造工程は、本研究に記載されています。綿の構造とテストパッドの配置は、各材料の疎水性および吸収強度を利用しています。そのためこれらの物理的特性のため、測色結果が永続的にテストに付着することができますパッド。このデバイスは、タイムリーに臨床情報を受信するために医師を可能にし、早期介入のためのツールとして大きな可能性を示しています。
Introduction
手頃な価格ポイント・オブ・ケア（POC）診断装置の開発、堅牢、かつ簡単に使用するには、世界的な健康1,2を向上させるために不可欠です。具体的には、デバイスは、セルロース基質（ 例えば 、紙、糸、綿）ため、その普遍性、手頃な価格、迅速な結果3-7を提供するために使用、堅牢性、および容量の容易性の低コスト分析のための有望な分析プラットフォームを提供で構成される。
ここでは、尿検査のためのラテラルフローベースのフォーマットを使用しています綿ベースの分析装置の開発を発表します。これは綿ベースの分析装置は、いくつかの重要な利点で代替検出アプローチを提供します。最小限の人間の努力でⅰ）製造を。 ⅱ）低コスト。 iii）の容量は、交差汚染の心配なしに複数の異なるアッセイを実施するために使用されます。 ⅳ）デバイスに依存しない、 すなわち 、追加の装置および/ または電気なしで実行することができる能力。そして、V）速度（比色アッセイ）を10分以内に完了することができます。
この綿ベースの分析装置の構造は、4つの部分に分けることができた：i）その外部の疎水性層上に自然に疎水性である綿。 ⅱ）内部的に親水性であり、液体吸上げ用の輸送路として機能綿;結合し、綿が使用されているが、反応/テストパッドを配置するための穴を掘削含ま圧縮iii）の積層膜。比色アッセイのための反応領域としての綿の外側表面上に配置された反応性試薬が埋め込 ま/被覆されていると、iv）のクロマトグラフィー紙試験パッド、（具体的には、空間内の積層膜のうち、穿孔）（ すなわち 、亜硝酸塩、総タンパク質、pH、およびウロビリノーゲン検定）と結果が表示されます。
次のようにテストの基本的なメカニズムです。コットンベースの分析装置は、DEPTを通じて途中に浸透線で採点されます綿素材のHは、サンプル流体は、反応性パッドが使用されて到達することを可能にする流路を作成します。溶液は、試験パッドに吸収端からの流体チャネル（ 図1）に沿って邪悪でその後の分析装置の吸収端は、標的試料に浸漬されます。試験パッドの吸収強度が綿よりも大きいため、テストパッドに吸収溶液には、リフローが流体チャネルに戻って存在しないようにしっかりとテストパッド紙の内部に収容され、測色結果は、その後に固定されてしまいますテストパッド材料。反応の終了時に、測色結果は、デスクトップスキャナを経由して記録され、画像解析ソフトウェアを介して分析します。
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Protocol
注意：適切な実験室の衛生練習が必要です。このPOCデバイスを使用する際に手袋と普遍的予防策が必要とされています。適切な滅菌手順が正しく行われていない場合、結果または感染の汚染が発生する可能性があります。
1.テストストリップデバイスを準備します
- 接触角測定8（ 図3）により洗浄綿の外側層の疎水性を決定します。
- 5.5センチメートルペーパーカッター（ 図2A）を使用して、x 1cmの小片にクレンジングコットンを切断することにより、綿ベースの分析装置を製作。
- 3の行の積層膜の標準シートにドリル穴（φ= 0.5センチ）。二つの連続する穴の間の距離は1cmです。
注：3つのテスト領域をそれぞれ有するように多くの36のような個々のテストストリップは、積層膜（×2 cmの5.5センチ）（ 図2B）の標準的なシートを用いて作製することができます。 - サンドイッチクレンジングコットン（characteriz積層膜、 すなわち 、一方の面に積層膜の穴ドリル加工シート、および他側の積層膜のundrilledシート（穴のない）の2枚の間に外部の疎水性とインテリア親水性）によって編。デバイスをパッケージ化するためにラミネーターにアセンブリを配置します。これは、デバイスの機械的強度を高め、外部の、不浸透性の層を提供します。
注：穴の直径は0.5センチメートル積層後に〜0.47センチメートルから縮小されます。いくつかのわずかな隙間が各ホールの周囲クレンジングコットンと積層膜との間に残ります。これらのわずかな隙間は、後の工程で作られた試験パッドの円の配置を容易にします。 - すなわちアセンブリから個々の5.5センチメートルのx 1センチメートルテストストリップデバイスを切断するはさみのペアを使用して、掘削積層シート/綿パッド/ undrilled積層シート「サンドイッチ」（ 図2C）。 （後述するように48のデバイスは、標準曲線を作成するために、合計18のデバイスを作りますBSAアッセイのための亜硝酸塩アッセイのため、15デバイス、およびウロビリノーゲンのアッセイのための15のデバイス）。
- 各試験領域の中心（積層膜で覆われていない）から（小流体チャネルとして）スリットをカットする鋭いナイフやカミソリを使用して、全体の縦デバイスの親水性層にテスト領域の疎水性層を介して、サンド装置（ 図2D）の深さの途中でカットすることに慎重です。
- ラミネーション（ 図2E）の各穴の周囲に隙間にそれらをスライドさせることにより、紙のテストパッド（φ= 0.5センチ）を適用します。
2.尿検査のための基準と指標のソリューションを準備します
- 脱イオン（DI）水100ミリリットルで69.0 mgの亜硝酸ナトリウムを溶解することにより10.0 mMのに亜硝酸原液を準備します。亜硝酸塩濃度標準液（2500、1250、625、312、156、および78μM）のシリーズを作成するために、DI水中の亜硝酸原液を希釈（ 図図4（a））。
- 100mlのPBS溶液415 mgのBSAを溶解することにより60μMウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を調製し（10 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウムおよび0.137 M塩化ナトリウム、pHは7.0）。 BSA濃度の標準溶液のシリーズを作成するために、DI水中のBSA原液を希釈（30、15、7.5、3.75、および1.875μM）（ 図4B）。
- 100ミリリットルのDI水中に2.5グラムのウロビリノーゲンを溶解させて25グラム/ Lウロビリノーゲンストック溶液を準備します。ウロビリノーゲン濃度標準液（7.8、15.6、31.2、62.5、および125 mg / Lで）（ 図4C）のシリーズを作成するために、DI水の株式ウロビリノーゲン液を希釈します。
- 50mMのスルファニルアミド、330 mMのクエン酸、及び10mMのN-（1-ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩を含む亜硝酸指示薬溶液を調製します。
- 250mMのにクエン酸緩衝液（pH 1.8）、95％エタノール中のテトラブロモフェノールブルーの3.3 mM溶液を含むBSA指示薬溶液を調製します。
- 0.1 M 4 - ジメチルアミンベンズアルデヒドを含むウロビリノーゲン指示薬溶液を準備します。
3.インジケータパッドを準備します
- 3円形のパッドやディスク（φ= 0.5 cm）のクロマトグラフィー紙からをカットし、ソリューション標準曲線（セクション4）を作成し、各テストストリップデバイスにそれら（3-アッセイストリップ上の各アッセイのための1）のそれぞれを挿入します。
- アセンブリの3積層フィルム孔の各々において、積層膜とカット穴の非常に縁で綿のテストパッドとの間に僅かな隙間を観察します。ノート、積層膜の孔は、紙試験パッドよりも直径がわずかに小さいです。
注：これらの機能、 すなわち 、積層フィルムの穴の縁の下に記載のスリム隙間に紙試験パッドスリップの縁ように紙試験パッドはデバイスの綿試験パッド部分に対して適用されることを可能にします。これは適切に紙のテストパッドを保持しています。 - 亜硝酸アッサを準備デバイスのy部分。
- コート（ステップ2.4で調製した）亜硝酸指示薬溶液4μlのと亜硝酸アッセイパッドと、それは周囲温度で完全に乾燥させます。
- 検出装置の総タンパク質アッセイ部分を準備します。
- コート（ステップ2.5で調製した）BSA指示薬溶液4μlの持つ全タンパク質アッセイパッドと、それは周囲温度で完全に乾燥させます。
- 検出装置のUroblinogenアッセイ部分を準備します。
- コート（ステップ2.6で調製した）uroblinogenインジケータの4μlのでuroblinogenアッセイパッドと、それは周囲温度で完全に乾燥させます。
4.コットンベースの分析装置のための標準曲線を作成します。
- 調製した各標準について、準備されたデバイスの吸収端を浸し〜10秒（吸収量のための標準溶液に（アッセイ指標（セクション3.4を参照）がプリインストール）200から300μl）を（ 図2F）。
- 比色反応（ 図2F）を完了するために10分間、周囲環境に綿ベースのデバイスを配置します。三連で各実験を繰り返します。
- 各テストパッド（ 図2G）で生じる比色変化を分析するためのデバイスをスキャンします。デスクトップスキャナと画像解像度の600dpiのでRGBモードでのスキャンテストパッドのガラス上にテストパッドを生じた場所。 JPEG形式の各画像を保存します。
- 各色の強度（ 図2H）を決定するために画像解析ソフトウェアを用いてコンピュータ上でスキャンした画像を解析します。
- http://imagej.nih.gov/ij/でImageJソフトウェアをダウンロードしてください。スキャンした画像ファイルを開きます。メニューコマンドでイメージを選択し、8ビットグレースケールにRGB画像を変換するために、「タイプ」を選択します。
- テストパッドの分析領域を選択し、ツールバーの「楕円」ツールを使用してください。メニューCOMMで「分析」を選択論理積、および色の強度を分析するために「測定」を選択します。録音は、強度の結果を意味します。
- 亜硝酸塩、総タンパク質、及びウロビリノーゲンアッセイ（ 図2I）の標準曲線を確立します。
- 標準亜硝酸塩、総タンパク質、及びウロビリノーゲン溶液の異なる濃度を示し、stasticalソフトウェアを使用して二次元の座標系での平均強度結果を相関。
- 二次モデルと線形回帰モデルによる総タンパク質およびウロビリノーゲンアッセイのための標準曲線によって亜硝酸塩アッセイのための標準曲線をフィット。
5.確立された標準曲線値を使用して未知試料の濃度を決定
- 、亜硝酸塩、総タンパク質、および未知の溶液中のウロビリノーゲンの濃度を決定する標準液濃度および亜硝酸塩の代わりに測定された強度結果、総タンパク質を測定するための記載の装置を使用し、urobiするためにステップ2で構築されたモデルの式にアッセイをlinogen。
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Representative Results
我々は成功し、親水性（内側部分）によって特徴付け市販清浄綿および疎水性（外側部分）の特性（ 図1A）を用いて綿ベースの分析装置の開発を示した。 図3は、接触角測定の結果を示します 。外装綿の疎水性界面は、127.35°±4.73°でした。ユーザーフレンドリーの観点から、ここで用いられる比色アッセイは、直接肉眼で観察することができ、さらに色強度分析（ 図2F）を介して定量しました。正常な個体における尿総タンパク質未満150ミリグラム/デシリットル（4μM）でなければなりません。尿中亜硝酸の検出の分析感度は、可能な限り低くあるべきであるので、それがために、分析装置の開発になると尿亜硝酸イオンの値は、尿路感染症または細菌感染に関連しています亜硝酸塩アッセイ。ウロビリノーゲンは、糞から排泄し、腸肝循環により回復したが、ウロビリノーゲンのいくつかのレベルが、約1される- /毎日4 mgであり、尿中に見つけることができます。図4（a） - 。Cは、各アッセイのための標準曲線を作成するための努力の結果を示していますターゲット。これらの標準曲線は、平均比色強度の結果を調べ、我々は確立された標準濃度の濃度にそれらを比較することによって確立しました。これは、私たちは各アッセイのための検出（のLOD）の限界を評価することができました。亜硝酸塩、BSA、および緩衝系でウロビリノーゲンのためのLODは、それぞれ、0.147ミリモル、3.672μM、及び4.861 mg / Lでした。これはまた、未知の溶液中で亜硝酸塩、BSA、及びウロビリノーゲンの濃度を決定するための数学的枠組みを提供してくれました。
図1 >。 概略コットンベースの分析装置の図。トップと断面図の画像は、各テストパッド（直径0.5cm）の寸法と綿ベースのデバイス（1センチ幅のx 5.5センチメートル長）を表示します。 表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。
コットンベースの分析装置は、サンプリング、および結果分析の 図2 製造プロセス（A）ペーパーカッターが指定されたサイズに洗浄綿の小片を切断するために使用した。（B）ペンは、積層のために位置をマークするために使用されましたアセンブリ内のフィルム孔（C）ラミネータを加熱によりラミネートフィルムの2つの層の間に挟むようにアセンブリを使用した。（D） 。（E）試験パッドはコットンデバイスにインストールされた。（F）ウロビリノーゲン、BSA、および亜硝酸塩アッセイ我々の綿ベースの分析装置を用いて行った。（G）画像結果のスキャナを使用してコンピュータに行われ、インポートされた。（H）画像解析ソフトウェアは、グレースケールコントラスト状態分析によって画像を解析するために使用した。（I）を得た強度結果を標準曲線に当てはめた。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
図3. 接触角は、綿の外部上に滴下したクレンジングコットン。DI水（1μl）をするための結果、疎水性層は、接触角を決定します。
コットンベースの分析装置に亜硝酸、ウロビリノーゲン、及びBSA 図 4. 分析結果。（A）、亜硝酸（0.156から2.5 mM）の、（B）BSA（1.875から30μM）、（C）ウロビリノーゲン（のための標準曲線7.8から125μM）各濃度について、試験は三連で実施し、カーブフィッティングのためのR 2値は亜硝酸塩であった：。。150、BSA：0.98、およびウロビリノーゲン：0.95 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルにおける重要なステップは、濾紙（クロマトグラフィ濾紙または定量濾紙）（疎水性/親水性を変化させて）、綿素材の適切な組合せを決定含ま。よく計画され、実行デバイスの設計は、最高のパフォーマンスを比色アッセイのために属性をレンダリングします。我々の比色アッセイの結果から、本明細書に提示綿ベースの分析装置は、複数の疾患の検出のためのプラットフォームとして大きな可能性を示しています。
現在のほとんどのラテラルフロー・ベースの製品（ 例えば 、妊娠検査）14 functon単一のアッセイよりも多くを提供しません。いくつかのディップスティックテストは、複数のバイオマーカーアッセイ15を実行しながら、アッセイ試薬が直接試験サンプルに連絡しているため、その使用は、担保試料汚染のリスクを実行します。我々のデバイスは、この障害を克服し、単一の側方流動ベースのチャネル装置内の複数の比色アッセイを実施するために使用することができ。
このメソッドは、標的分析物分子の大きさによって制限されます。亜硝酸塩のR 2及びLOD値は、我々のデバイスは、低分子の分析5（ 図4）のために適していることを示唆している他のアッセイ（BSA及びウロビリノーゲン）のものよりもはるかに大きいです。
いくつかのさらなる最適化はまだ臨床実践のために、この装置の実用性を高めるために必要とされ得ます。長時間にわたって外部環境にさらされたときに、この最適化は、アッセイ試薬の信頼性と安定性を向上させることを含みます。それにもかかわらず、我々は、特に、迅速かつ正確な分析と通信の適切なフォローアップ分析のためのニーズを満たすことに関しては、本発明は、確実に臨床で使用することができる低コストの分析装置の開発に決定的かつ貴重な侵入を作成すると信じ感染症。
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Acknowledgments
この作品は、台湾の科学技術省（MOST 104から2628-E-007から001-MY3（CMC））、および台中ベテランズ総合病院（TCVGH-1056904C（MYH））からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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