Abstract
강력한, 저렴한 비용 분석 장치는 사용하기 쉬운, 신속하고 저렴한해야한다. 이러한 장치는 부족한 샘플 작동 및 후속 치료에 대한 정보를 제공 할 수 있어야한다. 여기서는 횡 흐름 기반 포맷을 사용하고, 쉽게 신속하고 저렴한 제작 및 수행하는데 사용될 수있다 (즉, 아질산염, 총 단백질 및 urobilinogen 분석) 분석 장치 면화 기반 소변의 발전을 보여 교차 오염의 우려없이 여러 테스트합니다. 코튼은 흐름 기반 분석에 활용할 수있는 천연 흡수성 특성을 갖는 셀룰로오스 섬유로 구성된다. 우리면 기반 분석 장치의 단순하지만 우아한 제조 공정이 본 연구에 기재되어있다. 면 구조와 테스트 패드의 배치는 각각 소수성 물질의 흡수 강도를 이용한다. 때문에 이러한 물리적 특성, 색채 결과는 지속적으로 시험을 준수 할 수 있습니다인주. 이 장치는 적시에 임상 정보를받을 의사 수 및 조기 개입을위한 도구로서 큰 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
현장 진료의 개발 (POC), 저렴한 강력하고 쉽게 사용이 글로벌 건강 1,2 향상을위한 필수적입니다있는 진단 장치. 특히, 장치는 셀룰로오스 기판 (예를 들면, 종이, 실, 면화) 때문에 편재, 저렴한 가격, 빠른 결과 3-7를 제공하기 위해 사용, 견고성 및 용량의 용이성 저렴한 비용 분석을위한 유망한 분석 플랫폼을 제공하는 구성.
여기서는 소변위한 측방 유동 기반 포맷을 사용하는면 기반 분석 장치의 개발을 공개. 이면 기반 분석 장치는 몇 가지 주요 장점 대안 검출 방법을 제공합니다 최소한의 인간의 노력으로 전) 제조를; ⅱ) 저렴한 비용으로; ⅲ) 용량은 교차 오염의 우려가없는 다수의 상이한 분석을 실시하는 데 사용하는 단계; . ⅳ) 장치 독립성, 즉, 기능은 추가 장비 및 / 또는 전기없이 실행하는 단계; 그리고, V) 속도 (비색 분석법)를 10 분 이내에 완료 될 수있다.
이면 기반 분석 장치의 구조는 네 부분으로 분할 될 수있다 : ⅰ) 외부 소수성 층 자연스럽게 소수성면; ⅱ) 내부에 친수성 액체 위킹하는 운송 채널로서 기능면; 결합과 면화를 사용하고 있지만, 반응 / 테스트 패드의 배치를위한 구멍을 뚫고 포함 압축 ⅲ) 적층 필름; 및 ⅳ) 비색 분석법에 대한 반응 영역으로서면 (구체적으로는, 공간의 적층 막 중 천공)의 외부 표면 상에 배치 / 코팅 반응성 시약 매립 크로마토 종이 테스트 패드 (즉, 아질산 총 단백질, 산도, 그리고 urobilinogen 분석) 및 결과가 표시됩니다.
다음 시험의 기본 메커니즘이다. 코튼 기반 분석 장치는 부서를 통해 절반 방법을 관통하는 라인으로 득점한다코튼 물질의 H는 샘플 유체가 반응성 패드 사용되고 도달 할 수있는 유동 채널을 생성한다. 용액은 시험 패드 (도 1)의 흡수 단부로부터 유체 채널을 따라 악한 그러자 분석 장치의 흡수 에지는 타겟 샘플에 침지된다. 시험 패드의 흡수 강도면의 그것보다 크기 때문에, 테스트 패드로 흡수 용액은 리플 로우가 유체 채널로 다시이 없도록 확실하게 테스트 패드 종이 내부에 포함하고, 비색 결과는 이후에 고정 될 테스트 패드 소재입니다. 반응의 끝에서, 측색 결과 데스크탑 스캐너를 사용하여 기록하고, 화상 해석 소프트웨어를 통해 분석 하였다.
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Protocol
주의 : 적절한 실험실 위생 연습이 필요합니다. 이 POC 장치를 사용할 때 장갑과 보편적 인주의 사항이 필요합니다. 적절한 멸균 절차가 제대로 수행되지 않은 경우 결과 나 감염의 오염이 발생할 수 있습니다.
1. 테스트 스트립 장치를 준비
- 접촉각 측정 (8) (그림 3)에 의해 클렌징면의 외부 층의 소수성을 결정합니다.
- 종이 커터 (그림 2A)와 5.5 cm × 1 cm 조각으로 클렌징면을 절단하여면 기반 분석 장치를 제작.
- 세 행 적층 필름의 표준 시트 드릴 홀 (ø = 0.5 cm); 이후 두 구멍 사이의 거리는 1cm이다.
참고 : 각 적층 필름의 표준 시트 (5.5 cm × 2 cm) (그림 2B)를 사용하여 제조 될 수있다 세 가지 시험 영역과 마찬가지로 36 개의 개별 테스트 스트립. - 클렌징 코튼 샌드위치 (characteriz적층 막, 즉 한쪽에 적층 막의 구멍 천공 시트, 다른 쪽 적층 막의 undrilled 시트 (NO 구멍)의 두 부분 사이의 외부 및 내부의 소수성 친수성)에 의해 에디션. 장치를 포장하는 라미네이터에 어셈블리를 배치합니다. 이는 장치의 기계적 강도를 강화하고, 외부의 불 투과성 층을 제공한다.
참고 : 구멍의 직경이 0.47 cm 적층 한 후 0.5 cm로 ~에서 축소됩니다. 약간의 차이는 각 구멍의 둘레 주위 클렌징면과 적층 필름 사이에 남아있을 것이다. 이러한 약간의 차이는 후속 단계에서 만들어진 테스트 패드 원의 배치를 용이하게한다. - 즉, 어셈블리, 개별 5.5 cm × 1 cm 테스트 스트립 장치를 잘라 가위의 쌍을 사용하여 드릴 적층 시트 / 화장 솜 / undrilled 적층 시트 "샌드위치"(그림 2C). (후술하는 바와 같이 장치 (48)는 표준 곡선을 작성하는 합계 18 소자 만들기아질산 분석 들어, BSA 분석을위한 장치 (15) 및 urobilinogen 분석을위한 장치 (15)).
- 각 테스트 영역의 중심 (적층 막에 의해 커버되지 않은)에서 (작은 유체 채널로서) 슬릿을 절단하는 날카로운 칼이나 면도칼을 사용하여, 가로 및 세로 장치의 친수성 층의 테스트 영역의 소수성 층을 통해, 신중하면 끼워 장치 (그림 2D)의 깊이를 반쯤 잘라.
- 적층 (그림 2E)의 각 구멍의 둘레의 차이로 밀어 용지 테스트 패드 (ø = 0.5 cm)를 적용합니다.
2. 소변 검사를위한 기준 및 지표 솔루션을 준비
- (DI) 탈 이온수 100 ㎖ 중의 69.0 mg의 아질산 나트륨을 용해시켜 10.0 mM의 아질산을 스톡 용액을 제조 하였다. 아질산염 농도를 표준액의 시리즈 (2500, 1250, 625, 312, 156, 및 78 μM)을 생성하기 위해 DI 물 아질산 원액을 희석한다 (도4A).
- 100 ml의 PBS 용액 415 mg을 BSA에 용해시켜 60 μM 소 혈청 알부민 (BSA) 스톡 용액을 제조 하였다 (10 M 인산염 완충액, 0.0027 M 염화칼륨 및 0.137 M 염화나트륨, pH를 7.0). BSA 농도를 표준액의 시리즈를 생성하는 DI 워터의 BSA 스톡 용액을 희석 (30, 15, 7.5, 3.75 및 1.875 μM) (도 4b).
- 100㎖의 탈 이온수에 250 g에 용해 urobilinogen 25 g / L urobilinogen 스톡 용액을 제조 하였다. urobilinogen 농도 표준 용액 (7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125 ㎎ / ℓ) (도 4C)의 시리즈를 생성하는 DI 물 스톡 urobilinogen 용액을 희석.
- 50 밀리미터 술 파닐 아미드, 330 mM의 시트르산, 10 mM의 N- (1- 나프 틸) 에틸렌 디아민 디 하이드로 클로라이드를 함유 아질산염 표시 용액을 제조 하였다.
- 250 mM의 시트르산을 완충액 (PH 1.8) 및 95 % 에탄올 tetrabromophenol 블루 3.3 mM의 용액을 함유 BSA 표시기 용액을 제조 하였다.
- 0.1 M 4- 디메틸 아민 벤즈알데히드를 포함 urobilinogen 표시 솔루션을 준비합니다.
3. 표시 패드를 준비합니다
- 세 개의 원형 모양의 패드 나 디스크 (ø = 0.5 cm) 크로마토 그래피 용지에서 잘라 내기 및 솔루션 표준 곡선 (4 절)을 생성하기 위해 각 테스트 스트립 장치에 그들 (세 검정 스트립의 각 분석에 대해 하나)을 각각 삽입합니다.
- 어셈블리의 세 적층 막 구멍 각각에서, 적층 필름 및 절단 구멍의 가장 가장자리면 시험 패드 사이에 약간의 차이를 관찰한다. 적층 막에 구멍 용지 테스트 패드보다 지름이 약간 작다 참고.
주 : 함께, 이러한 특징은 종이 테스트 패드 장치의면 테스트 패드 부에 대하여 적용 할 수 있도록 적층 필름 구멍의 가장자리 아래 언급 슬림형 갭, 즉에 용지 테스트 패드 미끄럼 가장자리. 이 대신에 용지 테스트 패드를 보유하고있다. - 아질산 아싸 준비장치의 Y 부분입니다.
- 코트 아질산염 표시 (단계 2.4에서 준비) 솔루션은 상온에서 완전히 건조 할 수 있도록 4 μL와 아질산 분석 패드.
- 탐지 장치의 총 단백질 분석의 부분을 준비합니다.
- 코트 BSA 표시 솔루션 (단계 2.5에서 준비)하고 주위 온도에서 완전히 건조 할 수 있도록 4 μL로 총 단백질 분석 패드.
- 탐지 장치의 Uroblinogen 분석 비중을 준비합니다.
- 코트 uroblinogen 표시 등 (단계 2.6에서 준비)하고 주위 온도에서 완전히 건조 할 수 있도록 4 μL와 uroblinogen 분석 패드.
4. 코튼 기반 분석 장치에 대한 표준 곡선을 만들기
- 준비 각 표준의 경우, 준비된 장치의 흡수 끝을 찍어 ~ 10 초 (흡수 볼륨에 대한 표준 용액에 (분석 지표 (3.4 절 참조)와 함께 미리로드)200-300 μL) (그림 2 층).
- 10 분 비색 반응 (그림 2 층)에 완료 될 때까지 주위 환경에서면 기반 장치를 놓습니다. 세중의 각 실험을 반복합니다.
- 각각의 테스트 패드 (도 2G)에서 발생하는 색채의 변화를 분석하는 장치를 검사한다. 데스크탑 스캐너 화상 해상도 600 dpi로 함께 RGB 모드 스캔 테스트 패드의 유리 테스트 패드를 찾는 결과. JPEG 형식으로 각각의 이미지를 저장합니다.
- 각 색의 강도 (도 2H)를 결정하기 위해 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에서 스캔 한 이미지를 분석한다.
- http://imagej.nih.gov/ij/에서 ImageJ에 소프트웨어를 다운로드합니다. 스캔 한 이미지 파일을 엽니 다. 메뉴 명령에서 이미지를 선택하고, 8 비트 그레이 스케일로 RGB 이미지를 변환하는 "형식"을 선택합니다.
- 시험 패드 분석 영역을 선택하려면 도구 모음에서 "타원형"도구를 사용합니다. 선택 메뉴 통신에 "분석"의 ands 및 색상 강도를 분석하는 "측정"을 선택합니다. 기록은 강도 결과를 의미한다.
- 아질산염, 총 단백질 및 urobilinogen 분석 (그림 2I)의 표준 곡선을 설정합니다.
- 표준 아질산염, 총 단백질 및 urobilinogen 용액의 상이한 농도를 나타내며 stastical 소프트웨어를 이용한 2 차원 좌표계에서, 평균 강도 결과를 상관.
- 이차 모델과 선형 회귀 모델별로 총 단백질과 urobilinogen 분석을위한 표준 곡선에 의해 아질산염 분석의 표준 곡선을 맞 춥니 다.
5. 설립 표준 곡선 값을 이용하여 미지 시료의 농도를 결정
- 아질산염, 총 단백질 및 미지 용액의 농도를 urobilinogen 결정 표준 용액의 농도 및 아질산 대용 강도 측정 결과, 총 단백질을 측정 한 바와 같은 장치를 사용하기 urobi2 단계에서 내장 된 모델의 방정식에 linogen 분석.
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Representative Results
우리는 성공적으로 친수성 (내측 부분)을 특징으로 시판 세정면과 소수성 (외장 부) 속성 (도 1A)를 사용하여면 기반 분석 장치의 개발을 입증 하였다. (3) 접촉각 측정의 결과를 보여준다. 외부면의 소수성 인터페이스는 127.35 ° ± 4.73 °이었다. (도 2F)을 분석하고 사용자 친화적 인 측면에서, 여기에서 사용되는 비색 분석법 직접 육안으로 관찰 될 수 있으며 상기 정색 통해 정량화. 일반 개인에 소변 총 단백질 미만 150 밀리그램 / DL (4 μM)해야한다. 소변 아질산 검출의 민감도 분석 가능한 낮아야 그래서 A의 분석 장치의 개발에 있어서는 소변 아질산 이온의 값은, 요로 감염 또는 세균성 감염과 연관된아질산염 분석. Urobilinogen가 대변 배설 및 장간 순환에 의해 회수되지만 urobilinogen 어떤 수준은 대략 1이된다 - 4 mg의 / 일일 소변도 4a에서 찾을 수있다 -. C는 각각 검정 표준 곡선을 생성하기위한 노력의 결과를 도시 목표. 이 표준 곡선은 평균 색채 강도 검사 결과 우리가 설정된 표준 농도의 농도로 비교하여 확립 하였다. 이것은 우리가 각각의 분석에 대한 탐지 (LOD를) 제한을 평가할 수 있었다. 버퍼 시스템의 아질산염, BSA 및 urobilinogen의 LOD를 각각 0.147 밀리미터, 3.672 μM, 및 4.861 ㎎ / ℓ이었다. 이것은 또한 알 수없는 솔루션 아질산염, BSA 및 urobilinogen의 농도를 결정하기위한 수학적 프레임 워크와 함께 우리를 제공했다.
그림 1 >. 회로도면 기반 분석 장치의 다이어그램. 위쪽 및 단면 뷰 이미지가 각 시험 패드 (0.5 cm 직경) 및면 기반 장치 (1 cm 가로 x 5.5 cm 길이)의 크기를 표시합니다. 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
면 기반 분석 장치, 샘플링, 및 결과 분석도 2의 제조 공정. (A)이 용지 절단기가 지정된 크기로 세정면 조각을 절단하는 데 사용 하였다. (B)은 펜의 적층에 대한 위치를 표시하는 데 사용 된 어셈블리 필름 홀. (C) 라미네이터가 가열에 의해 적층 필름의 두 개의 층 사이에 샌드위치 어셈블리를 사용 하였다. (D) (F) Urobilinogen, BSA. 테스트 패드면 장치에 설치 하였다 (E). 절단하고, 아질산 분석법 우리면 기반 분석 장치를 사용하여 수행 하였다. (G) 이미지 결과를 스캐너를 사용하여 컴퓨터로 제조 수입 하였다. (H) 이미지 분석 소프트웨어 계조 콘트라스트 상태를 분석하여 이미지를 분석하기 위해 사용되었다. (I)을 수득 강도 결과를 표준 곡선에 끼워졌다. 클릭하세요 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3. 접촉각은면의 외부에 떨어 된 클렌징면. DI 물 (1 μL)에 대한 결과소수성 층은 접촉 각도를 결정한다.
코튼 기반 분석 장치에 아질산염, Urobilinogen 및 BSA 그림 4. 분석 결과. (A) 아질산염 (0.156-2.5 밀리미터), (B) BSA (1.875-30 μM), (C) urobilinogen (의 표준 곡선 . 7.8-125 μM)는 각각의 농도를 들어, 테스트 중으로 수행하고, 커브 피팅의 R 2 값은 아질산염했다 : BSA 0.99 : 0.98, 및 urobilinogen : 0.95. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 중요한 단계는 여과지 (크로마토 여과지 또는 정량 여과지) (소수성 / 친수성을 가변으로)면 재료의 적절한 조합을 포함 결정. 잘 계획되고 실행 장치 설계는 최상의 성능 비색 분석법 속성을 렌더링한다. 우리의 비색 분석 결과에서, 여기에 제시된면 기반 분석 장치는 여러 질병 검출을위한 플랫폼으로 큰 잠재력을 보여줍니다.
현재 대부분의 측방 유동 기반 제품 (예., 임신 검사)는 14 functon 단일 분석보다 더 이상 제공하지 않습니다. 일부 딥 스틱 테스트는 다중 바이오 마커 분석 (15)을 수행하는 동안 분석 시약 직접 테스트 샘플에 연락하기 때문에, 이들의 사용은 부수적 인 샘플 오염의 위험을 실행합니다. 우리의 장치는이 장애물을 극복하고 단일 측방 유동 - 기반 채널 장치에서 여러 비색 분석법을 구현하는데 사용될 수있다.
이 방법은 대상 분석 분자 크기에 의해 제한됩니다. 아질산염의 R 2 및 LOD 값은 우리의 장치는 저 분자량 분석 (5) (그림 4)에 더 적합하다는 것을 암시 다른 분석 (BSA 및 urobilinogen)의 그들보다 훨씬 크다.
일부 추가적인 최적화는 여전히 임상이 장치의 실용성을 향상시키기 위해 요구 될 수있다. 장기간 동안 외부 환경에 노출 될 때 이러한 최적화 분석 시약의 신뢰성과 안정성을 향상시키는 것을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 우리는이 발명은 신속하고 정확한 분석과 전염성의 적절한 후속 분석을위한 요구 사항을 충족, 특히 관해서, 안정적으로 임상에서 사용할 수있는 저렴한 비용 분석 장치의 개발에 결정적인 가치 잠식을 생성하는 생각 전염병.
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Acknowledgments
이 작품은 과학 기술의 대만 정부 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC))과 타이 재향 군인 병원 (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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