Abstract
En robust og lave kostnader analytisk enhet skal være brukervennlig, rask og rimelig. Slike enheter bør også være i stand til å operere med knappe prøver og gi informasjon for oppfølgende behandling. Her viser vi utviklingen av en bomull-baserte urinanalyse (dvs. nitritt, total protein, og urobilinogen analyser) analyseenhet som anvender en tversgående vannstrøm-basert format, og er billig, lett å fremstille, rask, og kan brukes til å utføre flere tester uten krysskontaminering bekymringer. Bomull er sammensatt av cellulosefibre med naturlig absorberende egenskaper som kan utnyttes for flytbasert analyse. Den enkle, men elegant fremstillingsprosessen av vår bomull basert analytisk anordning er beskrevet i denne studien. Anordningen av bomull struktur og testputen utnyttet hydrofobisitet og sugestyrken av hvert materiale. På grunn av disse fysiske egenskaper, kan kolorimetriske resultater vedvarende følge testenpad. Denne enheten gjør det mulig for leger å motta klinisk informasjon på en riktig måte, og viser stort potensial som et verktøy for tidlig intervensjon.
Introduction
Utviklingen av point-of-care (POC) diagnostiske enheter som er rimelig, robust og enkelt brukes er avgjørende for bedre global helse 1,2. Spesielt enheter bestående av cellulose underlag (for eksempel papir, tråd, og bomull) gir lovende analytiske plattformer for lav-kostnadsanalyse på grunn av deres ubiquity, kostnader, brukervennlighet, robusthet og kapasitet til å gi raske resultater 3-7.
Her, avsløre vi utviklingen av en bomull-basert analytisk enhet som bruker en lateral strømningsbasert format for urinanalyse. Dette bomull-baserte analyseenhet gir en alternativ deteksjon tilnærming med flere viktige fordeler: i) fabrikasjon med minimal menneskelig innsats; ii) lav pris; iii) evnen til å bli brukt til å utføre flere, forskjellige analyser uten krysskontaminering bekymringer; . iv) anordning uavhengighet, dvs. evnen til å bli kjørt uten ekstra utstyr og / eller elektrisitet; og, v) Hastighet (kolorimetriske analyser kan gjennomføres innen 10 min).
Strukturen av dette bomull basert analytisk anordning kan deles inn i fire deler: i) bomull som er naturlig hydrofobe på sin ytre hydrofobt lag; ii) bomull som er internt hydrofil og tjener som en transportkanal for flytende veke; iii) laminering film som binder og komprimerer bomull som brukes, men inneholder boret ut hull for plassering av reaksjons / forsøksputene; og, iv) kromatografi papir-forsøksputene, som er belagt / integrert med reaktive reagenser som er lagt på den ytre overflate av bomull (spesielt, i løpet boret ut av lamine film) som reaksjonsområder for kolorimetriske analyser (dvs., nitritt, totalt protein, pH-verdi, og urobilinogen analyser), og visning av resultater.
Den underliggende mekanisme for testen er som følger. Bomullen-baserte analyseenhet er scoret med linjer som trenge halvveis gjennom depth av bomull materiale for å skape en strømningskanal som gjør det mulig for prøvefluid for å oppnå de reaktive elektrodene som brukes. Den absorberende kant av analyseanordningen er nedsenket inn i målet prøven, hvoretter oppløsningen er ond langs fluidkanalen fra absorpsjonssonen enden til testputer (figur 1). Fordi den absorberende styrken av testputen er større enn den for bomull, blir løsningene absorbert av forsøks elektrodene fast inneholdt inne i testputen papiret slik at det ikke er noen flyt tilbake inn i fluidkanalen, og den kolorimetriske resultatene blir deretter festet på test pad materiale. Ved slutten av reaksjonen blir kolorimetriske resultatene registrert via en stasjonær skanner, og analysert via bildeanalyserende programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ADVARSEL: Riktig laboratorie hygiene er nødvendig. Hansker og generelle forholdsregler er nødvendig når du bruker denne POC enheten. Forurensning av resultater eller infeksjon kan oppstå hvis tilstrekkelige steriliseringsprosedyrer ikke er utført riktig.
1. Forbered strimmeldisketter Devices
- Bestemme hydrofobisiteten til det ytre lag av den rensende bomull ved kontaktvinkelmåling 8 (figur 3).
- Fremstille bomull basert analytisk enhet ved å kutte rensing bomull i 5,5 cm x 1 cm stykker med en papirkutter (figur 2A).
- Bor hull (ø = 0,5 cm) i en standard ark med laminering film i rader av tre; Avstanden mellom to etterfølgende hull er 1 cm.
MERK: Så mange som 36 individuelle teststrimler med tre testområder hvert kan gjøres ved hjelp av en standard ark med laminering film (5,5 cm x 2 cm) (figur 2B). - Sandwich rensing bomull (characterized av utvendig hydrofobisitet og hydrofilisitet innvendig) mellom to stykker av lamine film, dvs. hullet er boret ark av laminering film på den ene siden, og en uboret ark av lamine film (uten hull) på den andre siden. Plasser enheten i en lamineringsmaskin til å pakke enheten. Dette forbedrer enhetens mekanisk styrke, og gir en ytre, ugjennomtrengelig lag.
MERK: diameter på hullene vil krympe fra 0,5 cm til ~ 0,47 cm etter laminering. Noen små hull vil forbli mellom rensing bomull og laminering film rundt omkretsen av hvert hull. Disse små hull lette plasseringen av testputen sirkler som er gjort i et etterfølgende trinn. - Bruk et par saks for å klippe enkelt 5,5 cm x 1 cm teststrimler enheter fra forsamlingen, dvs. boret lamine ark / bomullsdott / uboret lamine ark "sandwich" (figur 2C). Gjør 48 enheter totalt å lage standardkurver som beskrevet senere (18 enheterfor nitritt analysen, 15 enheter for BSA analysen, og 15 enheter for urobilinogen analysen).
- Bruk en skarp kniv eller barberblad for å kutte en sliss (som en liten fluidkanal) fra midten av hvert testområde (ikke dekket av lamine film), på tvers av og gjennom det hydrofobe sjikt av testområdet til det hydrofile lag av langsgående enheten være forsiktig for å skjære halvveis gjennom dybden av sandwichanordning (figur 2D).
- Påfør papir testblokkene (ø = 0,5 cm) ved å skyve dem inn i hullene på omkretsen av hvert hull i lamineringen (figur 2E).
2. Forbered Standarder og Indikator Løsninger for Urinanalyse
- Fremstille 10,0 mM nitrittstamløsning ved å løse opp 69,0 mg natriumnitritt i 100 ml avionisert (DI) vann. Fortynn nitritt stamløsning i DI vann for å lage en serie med nitritt konsentrasjon standardløsninger (2500, 1250, 625, 312, 156, og 78 mm) (Figur4A).
- Fremstille 60 uM bovint serumalbumin (BSA) lageroppløsning ved å oppløse 415 mg BSA i 100 ml PBS-oppløsning (10 M fosfatbuffer, 0,0027 M kaliumklorid og 0,137 M natriumklorid, pH 7,0). Fortynn BSA stamløsning i deionisert vann for å skape en serie av BSA-konsentrasjonsstandardløsninger (30, 15, 7,5, 3,75 og 1,875 uM) (figur 4B).
- Fremstille 25 g / l urobilinogen stamløsning ved oppløsing av 2,5 g urobilinogen i 100 ml DI-vann. Fortynn lager urobilinogen oppløsning i deionisert vann for å lage en serie med urobilinogen konsentrasjonsstandardløsninger (7.8, 15,6, 31,2, 62,5 og 125 mg / l) (Figur 4C).
- Fremstille nitrittindikatorløsning inneholdende 50 mM sulfanilamid, 330 mM sitronsyre og 10 mM N- (1-naftyl) etylendiamindihydroklorid.
- Fremstille BSA-indikatorløsning inneholdende 250 mM citrat-bufferoppløsning (pH 1,8) og 3,3 mM løsning av tetrabromophenol blå i 95% etanol.
- Forbered urobilinogen indikatorløsning som inneholder 0,1 M 4-Dimethylamine benzaldehyd.
3. Forbered Indikator Pads
- Skjær tre sirkulære pads eller disker (ø = 0,5 cm) fra kromatografi papir og sette hver av dem (en for hver analyse på tre-analysen stripe) på hver teststrimmel enhet for å lage en løsning standardkurve (§ 4).
- Ved hver av de tre laminefilm hullene av sammenstillingen, observere et lite mellomrom mellom lamineringsfilmen og bomullstestputen ved å få de kantene av kuttet hullet. Legg merke til at det hull i lamineringsfilmen er litt mindre i diameter enn papirtestputen.
MERK: Sammen utgjør disse funksjonene gjør papiret testputen til å bli brukt mot bomull testputen del av enheten, slik at kantene på papiret testputen skli inn den slanke gapet nevnt, dvs. under kantene av laminering film hullet. Dette gjelder papirtesten pads på plass. - Klargjør Nitritt Assay del av innretningen.
- Coat nitritt analysen pad med 4 mL av nitritt indikatorløsning (utarbeidet i trinn 2.4) og la det tørke helt ved romtemperatur.
- Klargjør Total protein analysen Andel av detektoren.
- Coat den totale proteinanalysen pad med 4 mL av BSA indikatorløsning (utarbeidet i trinn 2.5) og la det tørke helt ved romtemperatur.
- Klargjør Uroblinogen analysen Andel av detektoren.
- Smør uroblinogen analysen pad med 4 pl uroblinogen indikator (utarbeidet i trinn 2.6) og la det tørke helt ved romtemperatur.
4. Lag standardkurver for Cotton-basert Analytisk Device
- For hver standard forberedt, dypp absorberende enden av en forberedt enhet (forhåndslastet med analyse indikatorer (se avsnitt 3.4)) i standardløsningen i 10 sek (absorpsjon volum ~200 - 300 ul) (figur 2f).
- Plasser bomull-basert enhet i et stemningsfullt miljø for 10 minutter å fullføre kolorimetriske reaksjoner (Figur 2F). Gjenta hvert forsøk i tre eksemplarer.
- Skann enheten til å analysere den kolo endringen skjer på hver testputen (figur 2G). Place resulterer testblokkene på glasset til en stasjonær skanner og skanne testblokkene i RGB-modus med 600 dpi i bildeoppløsning. Lagre hvert bilde i jpeg-format.
- Analyser det skannede bildet på en datamaskin ved hjelp av bildeanalyse programvare for å fastslå respektive fargeintensitet (Figur 2 H).
- Last ned ImageJ programvare på http://imagej.nih.gov/ij/. Åpne de skannede bildefiler. Velg bildet i menykommandoer, og velg "Type" for å konvertere RGB-bilder til 8-bits gråtoner.
- Bruk "Oval" verktøy på verktøylinjen for å velge testputen analyseområdet. Velg "Analyze" i menyen commands, og velg "tiltak" for å analysere fargeintensitet. Record mener intensitet resultater.
- Etablere standardkurver for nitritt, totalt protein, og urobilinogen analyser (figur 2i).
- Indikerer forskjellige konsentrasjoner av standard nitritt, totalt protein, og urobilinogen løsninger og korreleres midlere intensitet resultater på et todimensjonalt koordinatsystem ved hjelp av stastical programvare.
- Monter standardkurven for en nitritt analyse av en kvadratisk modell og standardkurver for total protein og urobilinogen analyser av lineære regresjonsmodeller.
5. Bestem ukjent prøve Konsentrasjoner ved hjelp av etablerte standardkurve Verdier
- For å bestemme nitritt, total protein og urobilinogen konsentrasjoner i ukjente løsninger, bruke enheten som beskrevet for måling av standardoppløsningskonsentrasjoner og erstatte målt intensitet resultater for nitritt, total protein, og urobilinogen analyser i ligningene for de modeller bygget i trinn 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrert utvikling av bomull-baserte analytiske enheter ved hjelp av kommersielt tilgjengelige rensing bomull kjennetegnet ved hydrofilt (indre del) og hydrofobe (ytre del) egenskaper (figur 1A). Figur 3 viser resultatene av kontaktvinkelmåling. Den hydrofobe grensesnittet til utvendig bomull var 127,35 ° ± 4.73 °. Fra et brukervennlig perspektiv, kan kolorimetriske analyser ansatt her observeres direkte med det blotte øye, og videre kvantifisert gjennom fargeintensitet analyser (figur 2F). Urin totalt protein i et normalt individ bør være mindre enn 150 mg / dl (4 uM). Verdien av urinnitrittioner er forbundet med urinveisinfeksjoner eller bakterielle infeksjoner, slik at den analytiske sensitiviteten av urin nitritt påvisning bør være så lav som mulig når det gjelder utvikling av analytiske innretninger for ennitritt analyse. Urobilinogen skilles ut gjennom avføringen og utvinnes av enterohepatisk sirkulasjon, men noen nivåer av urobilinogen, ca 1-4 mg / daglig, kan finnes i urinen Figur 4A -. C illustrerer resultatene fra arbeidet med å skape standardkurver for hver analyse mål. Disse standardkurver ble etablert ved å undersøke midlere kolorimetrisk intensitet resultater og sammenligne dem med de konsentrasjoner av standard konsentrasjoner som vi etablert. Dette tillot oss å vurdere grensen for påvisninger (Lods) for hver analyse. De lods for nitritt, BSA, og urobilinogen i buffersystemer var, 0,147 mM, 3,672 uM, og 4,861 mg / l, henholdsvis. Dette har også gitt oss med en matematisk rammeverk for å bestemme konsentrasjonene av nitritt, BSA, og urobilinogen i ukjente løsninger.
Figur 1 >. Prinsippskisse av Cotton-baserte Analytisk enhet. Top og tverrsnitt vise bilder viser dimensjonene på hver test pad (0,5 cm diameter) og bomull-basert enhet (1 cm bredde x 5,5 cm lengde). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fabrikasjon Process of Cotton baserte Analytisk Device, Sampling, og resultater analyse. (A) En papirkniv ble brukt til å skjære biter av rensing bomull til den angitte størrelsen. (B) En penn ble brukt til å markere steder for laminering film hull i sammenstillingen. (c) en lamineringsmaskin ble brukt for å sandwich-sammenstillingen mellom to lag av lamine film etter oppvarming. (D) (E) De testblokkene ble montert på bomull-enhet. (F) urobilinogen, BSA, og nitritt ble utført med vår bomull basert analytisk enhet. (G) Images av resultatene ble gjort og importert til en datamaskin ved hjelp av en skanner. (H) Bildeanalyse analyse~~POS=HEADCOMP programvare ble brukt til å analysere bildene av grå-skala kontrast tilstand analyse. (i) de oppnådde intensitet resultater ble montert inn i en standardkurve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kontakt Angle Resultater for rensing Cotton. DI vann (1 mL) ble slippes på bomull eksterne, Hydrofobe lag å bestemme kontaktvinkelen.
Figur 4. Analyseresultater for Nitritt, urobilinogen, og BSA på Cotton-basert Analytisk Device. Standardkurvene for (A) nitritt (0,156 til 2,5 mm), (B) BSA (1,875 til 30 mm), (C) urobilinogen ( . 7,8 til 125 mm) for hver konsentrasjon, tester ble utført i tre eksemplarer og R 2 verdier for montering kurven var nitritt: 0.99, BSA: 0,98, og urobilinogen: 0,95. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderte bestemmelse av passende kombinasjon av bomull materiale (med varierende hydrofobitet / hydrofilitet) og filterpapir (kromatografi filterpapir eller kvantitativ filterpapir). En godt planlagt og utført enhet utforming gjør den beste ytelsen attributter for kolorimetriske analyser. Fra våre kolorimetriske analyseresultatene, bomull basert analytisk anordning som presenteres her viser et stort potensiale som en plattform for multippel sykdom deteksjon.
De fleste nåværende lateral flow-base produkter (f.eks., Graviditetstest) tilveiebringe ikke mer enn en enkelt assay functon 14. Mens noen peilepinnen tester utføre flere biomarkør analyser 15, går bruken risikoen for sivile prøvekontaminering fordi assayreagenser direkte kontakt stikkprøvene. Vår anordning overvinner dette hinderet og kan brukes til å implementere flere kolorimetriske assays i en enkelt tversgående vannstrøm basert på kanalanordningen.
Denne metode er bare begrenset av målanalytten molekylstørrelse. R 2 og LOD verdier av nitritt er mye større enn de av de andre analysene (BSA og urobilinogen), noe som tyder på at maskinen er mer egnet for lav molekylær analyse 5 (figur 4).
Noen ytterligere optimalisering kan være nødvendig for å øke den praktiske ved denne anordning for klinisk praksis. Denne optimaliseringen omfatter å forbedre påliteligheten og stabilitet av analysereagensene når de utsettes for det ytre miljøet i lange perioder av gangen. Likevel mener vi at denne oppfinnelsen skaper en avgjørende og verdifullt inntog inn i utviklingen av lavkost analytiske enheter som kan sikkert brukes i klinisk praksis, særlig i forhold til å oppfylle behov for rask og nøyaktig analyse og egnet oppfølging analyse av smittsomme og infeksjonssykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra Taiwan Ministry of Science and Technology (MEST 104-2628-E-007-001-My3 (CMC)), og Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al. Cotton-based Diagnostic Devices. Scientific reports. 4, 6976-6976 (2013).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R. Understanding Urinalysis. medscape. 7 (3), 269-279 (2012).
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
