Abstract
Um dispositivo analítico robusto e de baixo custo deve ser de fácil utilização, rápida e acessível. Tais dispositivos também deve ser capaz de operar com amostras escassos e fornecer informações para acompanhamento do tratamento. Aqui, demonstramos o desenvolvimento de uma análise de urina à base de algodão (ou seja, nitrito, proteína total, e urobilinogênio ensaios) do dispositivo de análise que emprega um formato baseado em fluxo lateral, e é barato, facilmente fabricado, rápido, e pode ser usado para conduzir vários testes sem preocupações contaminação cruzada. O algodão é composto por fibras de celulose com as propriedades de absorção naturais que podem ser aproveitados para a análise baseada em fluxo. O processo de fabricação simples mas elegante do nosso dispositivo analítico baseado em algodão é descrito neste estudo. O arranjo da estrutura de algodão e a almofada de ensaio tira vantagem da hidrofobicidade e a força de absorção de cada material. Devido a estas características físicas, os resultados colorimétricos persistentemente podem aderir ao testealmofada. Este dispositivo permite aos médicos para receber informação clínica em tempo hábil e mostra grande potencial como ferramenta de intervenção precoce.
Introduction
O desenvolvimento de point-of-care (POC) dispositivos de diagnóstico que são acessíveis, robusto e de fácil utilização é imperativo para a melhoria 1,2 a saúde global. Em particular, os dispositivos composta de substratos de celulose (por exemplo, papel, linha, e algodão) fornecem plataformas analíticas promissoras para a análise de baixo custo por causa de sua onipresença, acessibilidade, facilidade de uso, robustez e capacidade de fornecer resultados rápidos 3-7.
Aqui, nós desvendar o desenvolvimento de um dispositivo analítico em algodão que usa um formato de fluxo lateral com base em urina. Este dispositivo analítico baseado em algodão fornece uma abordagem de detecção alternativo com várias vantagens importantes: i) a fabricação com o esforço humano mínimo; ii) baixo custo; iii) a capacidade de ser usado para conduzir múltiplos ensaios diferentes, sem preocupações de contaminação cruzada; . iv) independência do dispositivo, ou seja, a capacidade de ser executado sem equipamento e / ou eletricidade adicional; e, v) Velocidade (ensaios colorimétricos pode ser concluída dentro de 10 min).
A estrutura deste dispositivo analítico em algodão pode ser dividido em quatro partes: i) de algodão, que é naturalmente hidrofóbico na sua camada externa hidrofóbica; ii) de algodão hidrófilo que é internamente e serve como um canal de transporte para que a absorção de líquido; iii) película de laminação que se liga e comprime o algodão a ser utilizado, mas contém orifícios perfurados para fora para a colocação de pastilhas de reacção / ensaio; e, iv) compressas de teste de papel de cromatografia, os quais são revestidos / incorporados com reagentes reactivos, colocados sobre a superfície exterior do algodão (especificamente, no espaço perfurado para fora da película de laminação) como zonas de reacção para os ensaios colorimétricos (isto é, nitrito, proteína total, pH, e ensaios urobilinogênio) e exibir os resultados.
O mecanismo subjacente do teste é como se segue. O dispositivo analítico baseado em algodão é marcado com linhas que penetram a meio do depth do material de algodão para criar um canal de fluxo que permite que o fluido de amostra para atingir as almofadas reactivos a ser utilizado. A borda de absorção do dispositivo de análise é imerso na amostra alvo, após o que a solução é mau ao longo do canal de fluidos a partir do extremo de absorção às almofadas de teste (Figura 1). Uma vez que a força de absorção da almofada de teste é maior do que a de algodão, soluções de absorvidos pelas almofadas de teste são firmemente contido no interior do papel de teste do rato de modo que não existe qualquer refluxo de volta para dentro do canal de fluidos, e os resultados colorimétricos tornar-se subsequentemente fixado sobre o material de almofada de teste. No final da reacção, colorimétricos resultados são registados por meio de um digitalizador de mesa, e analisados por meio de software de análise de imagem.
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Protocol
CUIDADO: A prática correta higiene laboratório é necessária. Luvas e precauções universais são necessárias ao usar este dispositivo POC. A contaminação de resultados ou infecção pode ocorrer se os procedimentos de esterilização adequadas não forem realizados corretamente.
1. Prepare tiras de teste Devices
- Determinar a hidrofobicidade da camada exterior do algodão purificação por medição do ângulo de contacto 8 (Figura 3).
- Fabricar o dispositivo analítico em algodão através do corte de algodão de limpeza em 5,5 cm x 1 cm pedaços com um cortador de papel (Figura 2A).
- Faça furos (Ø = 0,5 cm) em uma folha padrão de filme de laminação em fileiras de três; a distância entre dois furos subsequentes é de 1 cm.
NOTA: Como muitos como 36 tiras de teste individuais com três áreas de teste cada um pode ser feito usando uma folha padrão de filme de laminação (5,5 cm x 2 cm) (Figura 2B). - Sanduíche do algodão de limpeza (characterized pela hidrofobicidade e hidrofilicidade exterior interior) entre dois pedaços de película de laminação, ou seja, a folha perfurados buracos de filme de laminação, de um lado, e uma folha de película não perfuradas de laminação (não há furos), por outro lado. Coloque o conjunto em um laminador para empacotar o dispositivo. Isto aumenta a resistência mecânica do dispositivo, e proporciona uma camada exterior, impermeável.
NOTA: Os diâmetros de furos vai encolher de 0,5 cm para ~ 0,47 cm após a laminação. Algumas pequenas aberturas permanecerá entre o algodão de limpeza e a película de laminação em torno do perímetro de cada orifício. Estas pequenas aberturas facilitar a colocação da almofada de teste círculos feito num passo subsequente. - Utilizar um par de tesoura para cortar dispositivos de tiras de teste de 5,5 cm x 1 cm individuais do conjunto, ou seja, a folha de laminação perfurado / almofada de algodão / folha de laminação não perfuradas "sanduíche" (Figura 2C). Adicione 48 total de dispositivos para criar curvas padrão como descrito mais tarde (18 dispositivospara o ensaio de nitritos, 15 dispositivos para o ensaio de BSA, 15 e dispositivos para o ensaio de urobilinogénio).
- Utilize uma faca afiada ou lâmina para cortar uma fenda (como um pequeno canal fluídico) a partir do centro de cada zona de ensaio (não cobertos pela película de laminação), do outro lado e através da camada hidrofóbica de área de teste para a camada hidrófila do dispositivo longitudinal, sendo cauteloso para cortar a meio da profundidade do dispositivo ensanduichada (Figura 2D).
- Aplicar compressas de teste de papel (Ø = 0,5 cm), deslizando-as para as lacunas no perímetro de cada orifício na laminação (Figura 2E).
2. Prepare Padrões e Indicadores Soluções para Urinalysis
- Prepare a 10,0 mm da solução de nitrito por dissolução de 69,0 mg de nitrito de sódio em 100 ml de água desionizada (Dl). Dilui-se a solução stock de nitrito em água DI para criar uma série de soluções padrão de nitrito (concentração de 2.500, 1.250, 625, 312, 156, e 78 ^ M) (Figura4A).
- Preparar a solução de albumina de soro (BSA) 60 uM da bovina por dissolução de 415 mg de BSA, em 100 ml de solução de PBS (tampão de fosfato 10 M, 0,0027 M de cloreto de potássio e cloreto de sódio 0,137 M; pH 7,0). Dilui-se a solução de reserva de BSA em água DI para criar uma série de soluções padrão de concentração de BSA (30, 15, 7,5, 3,75, e 1,875 uM) (Figura 4B).
- Prepare 25 g / L solução de urobilinogênio dissolvendo 2,5 g urobilinogénio em 100 ml de água DI. Diluir solução estoque urobilinogénio em água DI para criar uma série de soluções padrão de concentração urobilinogénio (7,8, 15,6, 31,2, 62,5, e 125 mg / L) (Figura 4C).
- Preparar a solução de indicador de nitrito de sulfanilamida contendo 50 mM, ácido cítrico 330 mM, e 10 mM de N- (1-naftil) etilenodiamina dicloridrato.
- Preparar a solução de indicador de BSA contendo 250 mM de solução tampão de citrato (pH 1,8) e uma solução 3,3 mM de tetrabromophenol azul em 95% de etanol.
- Preparar a solução indicador urobilinogénio contendo 0,1 M de 4 Dimethylamine benzaldeído.
3. Prepare Pads indicadoras
- Corte três almofadas em forma circulares ou discos (o = 0,5 cm) de papel de cromatografia e inserir cada um deles (um para cada ensaio na tira de ensaio de três) para cada dispositivo de tira de teste para criar uma curva padrão solução (secção 4).
- Em cada um dos três furos de filmes de laminação da montagem, observar um pequeno espaço entre o filme de laminação e a almofada de teste de algodão nas próprias bordas do furo do corte. Note-se, o orifício no filme de laminação é ligeiramente menor em diâmetro que a almofada de ensaio de papel.
NOTA: Em conjunto, estas características permitem que o tampão de teste de papel para ser aplicada contra a parte da almofada de teste de algodão do dispositivo, de modo que as bordas da almofada de deslizamento de ensaio de papel para o intervalo fino mencionado, isto é, sob as bordas do orifício de filme de laminação. Esta detém as almofadas de teste papel no lugar. - Prepare o Nitrito Assay porção do dispositivo.
- Brasão da almofada ensaio de nitritos com 4 ml de solução de nitrito de indicador (preparada no passo 2.4) e deixe-a secar completamente à temperatura ambiente.
- Preparar a percentagem do total de ensaio de proteína do dispositivo de detecção.
- Revestir a almofada de ensaio total de proteína com 4 ul de solução de BSA indicador (preparado no passo 2.5) e deixar secar completamente à temperatura ambiente.
- Prepara-se o Porção Uroblinogen Ensaio do dispositivo de detecção.
- Brasão da almofada de ensaio uroblinogen com 4 ul de indicador uroblinogen (preparado no passo 2.6) e deixe-a secar completamente à temperatura ambiente.
4. criar curvas padrão para o dispositivo analítico à base de algodão
- Para cada padrão preparada, mergulhe o fim de absorção de um dispositivo preparado (pré-carregado com indicadores de ensaio (ver secção 3.4)) para a solução padrão para 10 segundos (o volume de absorção ~200 - 300 ul) (Figura 2F).
- Coloque o dispositivo à base de algodão num ambiente ambiente durante 10 min para completar as reacções colorimétricas (Figura 2F). Repita cada experimento em triplicado.
- Digitalizar o dispositivo para analisar a alteração colorimétrica ocorrendo em cada almofada de ensaio (Figura 2G). Lugar resultando compressas de teste no vidro de um scanner de mesa e almofadas de teste de verificação no modo RGB com 600 dpi de resolução de imagem. Salvar cada imagem em formato jpeg.
- Analisar a imagem digitalizada em um computador utilizando o software de análise para determinar respectivas intensidades de cor (Figura 2H).
- Baixar software ImageJ na http://imagej.nih.gov/ij/. Abra os arquivos de imagens digitalizadas. Selecione a imagem nos comandos de menu e selecione "Type" para converter imagens RGB para 8 bits em tons de cinza.
- Use a ferramenta "Oval" na barra de ferramentas para selecionar a área de análise do teste pad. Selecione "Analisar" no menu de commands, e selecione "Measure" para analisar a intensidade da cor. Grave significa resultados intensidade.
- Estabelecer as curvas padrão de nitrito, proteína total, e ensaios urobilinogênio (Figura 2I).
- Indicar diferentes concentrações de nitrito padrão, proteína total, e soluções urobilinogênio e correlacionados os resultados médios de intensidade num sistema de coordenadas bidimensional utilizando software stastical.
- Ajustar a curva padrão para um ensaio de nitritos por um modelo quadrático e as curvas padrão para o total de ensaios de proteína e urobilinogênio por modelos de regressão linear.
5. determinar as concentrações de amostra desconhecida Usando estabelecia valores curva padrão
- Para determinar nitrito, proteína total, e as concentrações de urobilinogênio em soluções desconhecidos, usar o dispositivo como descrito para a medição das concentrações de soluções padrão e substitutos medido resultados intensidade para nitrito, proteína total, e urobiensaios linogen nas equações dos modelos construídos no passo 2.
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Representative Results
Foi demonstrado com êxito do desenvolvimento de dispositivos de análise à base de algodão usando disponível comercialmente de algodão hidrófilo de limpeza caracteriza-se por (porção interna) e propriedades hidrofóbicas (parte exterior) (Figura 1A). A Figura 3 mostra os resultados da medição do ângulo de contacto. A interface de algodão hidrófobo exterior era 127,35 ° ± 4,73 °. De uma perspectiva de user-friendly, ensaios colorimétricos empregadas aqui poderia ser diretamente observado a olho nu, e mais quantificado através intensidade da cor análises (Figura 2F). Urina proteína total num indivíduo normal deve ser inferior a 150 mg / dl (4 uM). O valor de iões nitrito de urina está associada com infecções do tracto urinário e infecções bacterianas, por isso, a sensibilidade analítica de detecção de nitrito de urina deve ser tão baixa quanto possível quando se trata do desenvolvimento de dispositivos de análise para umaensaio de nitritos. Urobilinogênio é excretada pelas fezes e recuperada pela circulação entero-hepática, mas alguns níveis de urobilinogénio, cerca de 1-4 mg / dia, podem ser encontrados na urina Figura 4A -. C ilustra os resultados dos nossos esforços para criar curvas padrão para cada ensaio alvo. Estas curvas padrão foram estabelecidas por análise de resultados médios de intensidade colorimétrica e comparando-as com as concentrações de concentrações padrão que estabelecidas. Isto permitiu-nos avaliar o limite de detecções (LODS) para cada ensaio. Os limites de determinação das nitrito, de BSA, e urobilinogénio em sistemas tampão foram, 0,147 mM, 3,672 uM, e 4,861 mg / L, respectivamente. Isso também nos forneceu uma estrutura matemática para a determinação das concentrações de nitrito, BSA, e urobilinogênio em soluções desconhecidas.
figura 1 >. Diagrama esquemático do dispositivo analítico baseado em Cotton. Top e secção transversal ver imagens exibir as dimensões de cada almofada de teste (0,5 cm de diâmetro) e um dispositivo à base de algodão (1 cm de comprimento largura x 5,5 cm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Processo de fabricação de base-Cotton Analytical, amostragem e análise dos resultados. (A) Um cortador de papel foi usada para cortar pedaços de algodão de limpeza para o tamanho especificado. (B) Uma caneta foi usada para marcar os locais para laminação furos de cinema na montagem. (C) Um laminador foi usado para a montagem de sanduíche entre duas camadas de filme de laminação a quente. (D) (E) dos painéis de teste foram instalados no dispositivo de algodão. (F) Urobilinogênio, BSA, e ensaios de nitrito foram realizadas com o nosso dispositivo analítico em algodão. Imagens (G) dos resultados foram feitos e importados para um computador usando um scanner. (H) software de análise de imagem foi usado para analisar as imagens por análise de estado contraste em escala de cinza. (i) os resultados de intensidade obtidos foram instalados em uma curva padrão. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ângulo de Contato Resultados para a limpeza do algodão. DI água (1 mL) foi descartado para o algodão do externo, Camada hidrofóbica para determinar o ângulo de contato.
Figura 4. Análise de Resultados para nitrito, Urobilinogênio e BSA no dispositivo analítico baseado em algodão. As curvas padrão para (A) nitrito (0,156-2,5 mM), (B) BSA (1,875-30? M), (C) urobilinogênio ( . 7,8-125 M) para cada concentração, os testes foram realizados em triplicado e os 2 valores de R para o ajuste de curvas foram nitrito: 0,99, BSA: 0,98, e urobilinogênio: 0,95. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
passos críticos neste protocolo incluiu a determinação da combinação adequada de material de algodão (com diferentes hidrofobicidade / hidrofilicidade) e filtro de papel (papel de filtro cromatografia ou papel de filtro quantitativo). Um projeto dispositivo bem planejado e executado torna atribui o melhor desempenho para ensaios colorimétricos. A partir dos nossos resultados ensaio colorimétrico, o dispositivo analítico em algodão aqui apresentado demonstra grande potencial como uma plataforma para a detecção de doença múltipla.
A maioria dos produtos correntes laterais de fluxo de base (por ex., Teste de gravidez) proporcionar não mais do que um único ensaio functon 14. Enquanto alguns testes vareta realizar ensaios de múltiplos biomarcadores 15, a sua utilização corre o risco de contaminação da amostra garantia, porque os reagentes do ensaio contactar directamente amostras de teste. O nosso dispositivo ultrapassa este obstáculo e pode ser utilizado para implementar vários ensaios colorimétricos em um único dispositivo de canal baseada em fluxo lateral.
Este método só é limitada pelo tamanho molecular do analito alvo. Os valores de R 2 e LOD de nitrito são muito maiores do que aqueles dos outros ensaios (BSA e urobilinogênio), sugerindo que os dispositivos são mais adequados para análise molecular baixo 5 (Figura 4).
Alguns uma maior optimização ainda pode ser necessário, a fim de aumentar a viabilidade do presente dispositivo para a prática clínica. Esta optimização inclui a melhoria da fiabilidade e estabilidade dos reagentes de ensaio, quando exposto ao ambiente exterior por longos períodos de tempo. No entanto, acreditamos que esta invenção cria uma incursão decisivo e valioso para o desenvolvimento de dispositivos analíticos de baixo custo que pode ser usado de forma confiável na prática clínica, especialmente no que diz respeito à satisfação das necessidades para a análise rápida e precisa e análise de acompanhamento adequado das doenças transmissíveis e doenças infecciosas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (a maioria 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)) e Taichung Veterans Hospital Geral (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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