Abstract
Надежный, недорогой аналитическое устройство должно быть удобным, быстрым и доступным. Такие устройства должны также иметь возможность работать с дефицитных образцов и предоставить информацию для последующего лечения. Здесь мы демонстрируем развитие анализа мочи хлопковой основе (т.е., нитрита, общего белка, и Уробилиноген анализы) аналитическое устройство , которое использует формат бокового потока на основе, и недорог, легко изготовлены, быстрым, и может быть использован для проведения множественные испытания без перекрестного загрязнения забот. Хлопок состоит из целлюлозных волокон с натуральными поглощающими свойствами, которые могут быть использованы для анализа потока на основе. Простой, но элегантный процесс изготовления нашего хлопка на основе аналитического устройства описывается в данном исследовании. Компоновка структуры хлопка и тест-слой использует гидрофобности и абсорбционной прочности каждого материала. Из-за этих физических характеристик, колориметрические результаты могут упорно придерживаться тестанакладка. Это устройство позволяет врачам получать клиническую информацию своевременно и показывает большой потенциал в качестве инструмента для раннего вмешательства.
Introduction
Развитие пункта оказания медицинской помощи (ПСУ) диагностических устройств , которые являются доступными, надежными и легко использовать крайне важно для улучшения глобального здоровья 1,2. В частности, устройства состоят из субстратов целлюлозы (например, бумага, нитки и хлопок) обеспечивают перспективные аналитические платформы для анализа низкой стоимости из - за их вездесущность, доступность, простота использования, надежность и способность обеспечить быстрые результаты 3-7.
Здесь мы раскрываем развитие ватной основе аналитического устройства, которое использует формат бокового потока на основе для анализа мочи. Этот хлопок на основе аналитического устройства обеспечивает альтернативный подход для обнаружения с несколькими ключевыми преимуществами: I) изготовление с минимальными человеческими усилиями; б) низкая стоимость; III) способность использовать для проведения нескольких анализов, различные без проблем перекрестного загрязнения; . IV) независимость устройства, то есть, способность работать без дополнительного оборудования и / или электроэнергии; и, v) Скорость (колориметрические анализы могут быть завершены в течение 10 мин).
Структура этого хлопка на основе аналитического устройства можно разделить на четыре части: I) хлопок, который естественным образом гидрофобный на его внешнем гидрофобным слоем; б) хлопок, который внутренне гидрофильные и служит в качестве транспортного канала для впитываемость жидкости; III) ламинирование пленка, которая связывает и сжимает хлопок используется, но содержит высверлить отверстия для размещения реакции / испытательных набивок; и, IV) тест хроматографической бумаги колодки, которые покрыты / внедренные с реактивными реагентами, размещаемые на внешней поверхности хлопка ( в частности, в пространстве , пробуренной из пленки для ламинирования) в качестве областей реакции для колориметрического анализа (то есть, нитриты, общий белок, рН, и Уробилиноген анализы) и отображение результатов.
Механизм, лежащий в теста выглядит следующим образом. Хлопка на основе аналитического устройства оценивается с линиями, которые проникают на полпути через отделч хлопчатобумажного материала, чтобы создать канал, который позволяет потока пробы текучей среды, чтобы достичь реакционноспособные колодки используются. Поглощающий край аналитического устройства погружается в целевой образец, после чего раствор грешно вдоль струйного канала от конца поглощения в испытательных набивок (рисунок 1). Поскольку поглощающая сила тест-слой больше, чем у хлопка, растворы, поглощаемые испытательных набивок надежно содержится внутри испытательной площадки бумаги таким образом, чтобы не оплавления обратно в жидкостном канале, и колориметрические результаты становятся впоследствии фиксируется на тест материал прокладки. В конце реакции, колориметрические результаты записываются с помощью настольного сканера, и анализировали с помощью анализа изображения программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ВНИМАНИЕ: требуется Правильная лабораторная практика гигиены. Перчатки и универсальные меры предосторожности необходимы при использовании этого устройства СПЭ. Заражение результатов или инфекции может возникнуть, если адекватные процедуры стерилизации не выполняются должным образом.
1. Подготовить тест-полоска устройств
- Определить гидрофобность внешнего слоя очищающей хлопка путем измерения угла смачивания 8 (рисунок 3).
- Изготовить хлопковой основе аналитического устройства путем разрезания очистительную хлопка в 5,5 см х 1 см куски с помощью резака бумаги (рис 2А).
- Просверлите отверстия (диаметр = 0,5 см) в стандартном листе пленки для ламинирования в ряды трех; расстояние между двумя последовательными отверстиями составляет 1 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целых 36 отдельных тест - полосок с трех тестовых областях каждый из них может быть сделано с использованием стандартного листа пленки для ламинирования (5,5 см х 2 см) (рис 2B). - Сэндвич очищающий хлопок (characterizред внешней гидрофобности и гидрофильности интерьера) между двумя кусками пленки для ламинирования, то есть отверстия просверленные листа пленки для ламинирования с одной стороны, и неразбуренных лист пленки для ламинирования (без отверстий) на другой стороне. Поместите сборку в ламинатор, чтобы упаковать устройство. Это повышает механическую прочность устройства, и обеспечивает внешний слой, непроницаемый.
Примечание: Диаметры отверстий будет уменьшаться от 0,5 см до ~ 0,47 см после ламинирования. Некоторые небольшие промежутки остаются между очищающей хлопка и ламинирование пленки по периметру каждого отверстия. Эти небольшие зазоры облегчают размещение тест-слой кругов, сделанных на последующей стадии. - Используйте пару ножниц вырезать отдельные 5,5 см х 1 см индикаторной полоски устройства от узла, то есть просверлены ламинирование лист / ватный тампон / без отверстий ламинирование листов "сэндвич" (рис 2С). Сделайте 48 устройств всего для создания стандартных кривых, как описано ниже (18 устройствдля анализа нитрита, 15 устройств для анализа БСА, и 15 устройств для анализа Уробилиноген).
- Используйте острый нож или лезвие, чтобы сократить разрез (как небольшой жидкостный канал) из центра каждой испытательной зоны (не покрыта ламинированием пленкой), поперек и через гидрофобный слой испытательной зоны с гидрофильным слоем продольного устройства, быть осторожным , чтобы разрезать на полпути от глубины зажатой устройства (рис 2D).
- Устанавливают испытательные колодки бумаги (диаметр = 0,5 см), сдвинув их в зазоры по периметру каждого отверстия в ламинировании (рис 2E).
2. Подготовить стандарты и решения для индикаторных анализ мочи
- Приготовьте 10,0 мМ нитрита исходного раствора путем растворения 69,0 мг нитрита натрия в 100 мл деионизованной (ДИ) воды. Развести нитрит маточного раствора в деионизированной воде , чтобы создать серию нитрита концентрации стандартных растворов (2500, 1250, 625, 312, 156 и 78 мкм) (рис4А).
- Готовят 60 мкМ бычий сывороточный альбумин (БСА) маточного раствора путем растворения 415 мг БСА в 100 мл раствора PBS (10 М фосфатный буфер, 0,0027 М хлорида калия и 0,137 М хлорида натрия, рН 7,0). Разбавляют исходный раствор БСА в деионизированной воде , чтобы создать ряд БСА концентрации стандартных растворов (30, 15, 7,5, 3,75 и 1,875 мкМ) (фиг.4В).
- Приготовьте 25 г / л Уробилиноген маточного раствора путем растворения 2,5 г уробилиноген в 100 мл деионизированной воды. Развести запас Уробилиноген раствора в деионизированной воде , чтобы создать серию концентрации уробилиногена стандартных решений (7,8, 15,6, 31,2, 62,5 и 125 мг / л) (рис 4в).
- Подготовка раствора нитрита индикатора, содержащего 50 мМ сульфаниламид, 330 мМ лимонной кислоты и 10 мМ N- (1-нафтил) этилендиамина дигидрохлорид.
- Готовят раствор, содержащий индикатор BSA 250 мМ цитрата буферный раствор (рН 1,8) и 3,3 мМ раствор tetrabromophenol синего в 95% этаноле.
- Подготовка Уробилиноген раствора индикатора, содержащего 0,1 М 4-диметиламина бензальдегид.
3. Подготовка колодки Индикатор
- Нарезать три круглой формы колодки или диски (диаметр = 0,5 см) из хроматографической бумаги и вставьте каждый из них (по одному для каждого анализа на три полосы анализа) на каждый тест-полосок устройства для создания раствора стандартной кривой (раздел 4).
- На каждом из трех отверстий пленки для ламинирования сборки, заметить небольшой зазор между пленкой и ламинирование испытательной площадки из хлопчатобумажной ткани при самых краев вырезанное отверстие. Обратите внимание, что отверстие в пленки для ламинирования немного меньше в диаметре, чем тест бумаги площадку.
Примечание: В совокупности эти функции позволяют индикаторная бумага коврик для применения на грелку части испытательного хлопка устройства так, чтобы края подкладки скольжения тестовой бумаги в тонкий зазор упомянутый, то есть, по краям отверстия ламинирование пленки. Это держит индикаторной бумаги колодки на месте. - Подготовьте нитритов Ассау части устройства.
- Coat нитрит анализ подушечка с 4 мкл раствора нитрита индикатора (полученного на стадии 2.4) и дайте ему полностью высохнуть при комнатной температуре.
- Подготовьте Общий Protein Assay части обнаружения устройств.
- Coat общий анализ протеина площадку с 4 мкл раствора БСА индикатора (полученного на стадии 2.5) и дайте ему полностью высохнуть при комнатной температуре.
- Подготовить Uroblinogen Пробирной часть обнаружения устройств.
- Покрыть uroblinogen анализ подушечка с 4 мкл индикатора uroblinogen (полученного на стадии 2.6) и дайте ему полностью высохнуть при комнатной температуре.
4. Создание стандартных кривых для хлопковой основе аналитического устройства
- Для каждого стандарта, подготовленный, окунуть поглощающую конец подготовленного устройства (с предустановленными показателей анализа (смотри раздел 3.4)) в стандартный раствор в течение 10 сек (объем поглощения ~200 - 300 мкл) (рис. 2F)
- Поместите устройство ватный основе в окружающей среде в течение 10 мин для завершения реакции , колориметрические (рис 2F). Повторите каждый эксперимент в трех экземплярах.
- Сканирование устройства для анализа колориметрического изменения , происходящие в каждой испытательной площадке (рис 2G). Место в результате испытаний колодки на стекле настольного сканера и сканирования испытательных набивок в режиме RGB с 600 точек на дюйм и разрешением изображения. Сохранять каждое изображение в формате JPEG.
- Проанализируйте отсканированное изображение на компьютере с помощью программного обеспечения для анализа изображений , чтобы определить соответствующие интенсивности цвета (рис 2H).
- Скачать программу ImageJ на http://imagej.nih.gov/ij/. Откройте отсканированные файлы изображений. Выберите изображение в командах меню и выберите "Type" для преобразования RGB изображения в 8-битные оттенки серого.
- Используйте "Овал" инструмент на панели инструментов, чтобы выбрать тест пусковой площадки аналитическую область. Выберите "Анализ" в меню коммАндами, и выберите "Измерить" для анализа интенсивности цвета. Запись означает, результаты интенсивности.
- Установить стандартные кривые нитрита, общего белка и Уробилиноген анализа (рис 2i).
- Указывают на различные концентрации стандартного нитрита, общего белка и Уробилиноген растворов и коррелируют результаты средней интенсивности на двумерной системе координат с использованием stastical программного обеспечения.
- Установить стандартную кривую для анализа нитрита квадратичной модели и стандартные кривые для общего белка и Уробилиноген анализов по модели линейной регрессии.
5. Определение неизвестного образца концентраций с использованием устоявшихся ценностей стандартной кривой
- Для определения нитрит, общего белка и концентрации уробилиногена в неизвестных растворах, использовать устройство, как описано для измерения стандартных концентраций растворов и заменителей результата измерения интенсивности для нитрита, общего белка, и urobilinogen анализы в уравнениях моделей, построенных на шаге 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно продемонстрировали развитие хлопковых на основе аналитических устройств с использованием коммерчески доступного очищающий хлопка , характеризующийся гидрофильной (внутренней части) и гидрофобные (внешняя часть) свойства (рис 1а). На рисунке 3 показаны результаты измерения угла смачивания. Гидрофобный интерфейс внешнего хлопка был 127,35 ° ± 4,73 °. С точки зрения удобной для пользователей, колориметрические анализы , используемые здесь , могли непосредственно наблюдать невооруженным глазом, и дополнительно количественно с помощью анализа интенсивности цвета (рис 2F). Моча общего белка у нормального индивидуума должна быть не менее 150 мг / дл (4 мкМ). Величина ионов нитрита мочи связано с инфекциями мочевых путей или бактериальных инфекций, так что аналитическая чувствительность обнаружения мочи нитрита должно быть настолько низким, насколько это возможно, когда речь идет о разработке аналитических приборы дляНитрит анализ. Уробилиноген выводится из организма с калом и извлечены с помощью энтерогепатической циркуляции, но некоторые уровни уробилиногена, примерно 1 - 4 мг / сут, можно найти в моче Рисунок 4A -. C иллюстрирует результаты от наших усилий по созданию стандартных кривых для каждого анализа мишень. Эти стандартные кривые были установлены путем анализа средние результаты колориметрического интенсивности и сравнивая их с концентрациями стандартных концентраций, которые мы установили. Это позволило нам оценить предел обнаружения (УД) для каждого анализа. В ЛОДа для нитритов, БСА и уробилиногена в буферных системах, были, 0,147 мМ, 3,672 мкМ и 4,861 мг / л, соответственно. Это также дало нам математической основы для определения концентраций нитрита, БСА и уробилиногена в неизвестных растворах.
Рисунок 1 >. Принципиальная схема Cotton на основе аналитического устройства. Верхняя и поперечное сечение просматривать изображения показывают размеры каждой испытательной площадки (диаметр 0,5 см) и хлопка на основе устройства (1 см длина х ширина 5,5 см). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 2. Процесс изготовления хлопка на основе аналитического устройства, отбор проб и анализа результатов. (A) резак для бумаги использовали вырезать куски чистки хлопка до указанного размера. (В) Перо было использовано для обозначения места для ламинации отверстия пленки в сборке. (C) ламинатор был использован для сэндвича сборку между двумя слоями пленки для ламинирования путем нагревания. (D) (E) были установлены испытательные колодки на устройство хлопка. (F) Уробилиноген, БСА и нитритов анализы проводили с помощью нашей хлопковой основе аналитического устройства. (G) Изображения результатов были сделаны и импортированы в компьютер с помощью сканера. (H) программного обеспечения для анализа изображений была использована для анализа изображения по серой шкале контраст анализа состояния. (I) полученные результаты интенсивности были установлены в стандартной кривой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Угол контакта Результаты для очищающего хлопка. DI воды (1 мкл) капают на хлопок через наружную, Гидрофобный слой, чтобы определить угол контакта.
Рисунок 4. Результаты анализа нитриты, уробилиноген и БСА на хлопке на основе аналитического устройства. Стандартные кривые (А) нитрита (0.156-2.5 мМ), (B) БСА (1.875-30 мкМ), (C) уробилиноген ( . 7.8 - 125 мкМ) для каждой концентрации, испытания были проведены в трех экземплярах и значения R 2 для подгонки кривой были нитриты: 0,99, БСА: 0,98 и уробилиноген: 0,95. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в этом протоколе включали определение соответствующего сочетания хлопкового материала (с различной гидрофобности / гидрофильности) и фильтровальную бумагу (хроматографию фильтровальной бумаги или фильтровальной бумаги количественный). Хорошо спланированная и выполнен дизайн устройства делает лучшее исполнение атрибутов для колориметрических анализов. Из наших колориметрических результатов анализа, хлопковая на основе аналитического устройства, представленные здесь демонстрирует большой потенциал в качестве платформы для обнаружения множественной заболевания.
Большинство современных бокового потока базовых продуктов (например., Тест на беременность) не дают не более одного анализа functon 14. В то время как некоторые тесты выполняют импрегнированным субстратом нескольких биомаркеров анализов 15, их использование подвергается риску заражения сопутствующий образца , так как реагентов для анализа непосредственно нами тестовые образцы. Наше устройство позволяет преодолеть это препятствие и может быть использован для реализации нескольких колориметрического анализа в одном устройстве канала бокового потока на основе,
Этот метод ограничен только целевого аналита размером молекул. Значения R 2 и LOD нитрита намного больше , чем у других анализов (БСА и уробилиногена), предполагая , что наши устройства являются более подходящими для низкого молекулярного анализа 5 (рис 4).
Некоторые дальнейшей оптимизации могут по-прежнему необходимы для того, чтобы повысить практичности этого устройства для клинической практики. Такая оптимизация включает в себя повышение надежности и стабильности реагентов для анализа при воздействии внешней среды в течение длительного периода времени. Тем не менее, мы считаем, что это изобретение создает решающий и ценное нашествие в разработке недорогих аналитических устройств, которые могут быть надежно использоваться в клинической практике, особенно в отношении к выполнению потребностей для быстрого и точного анализа и подходящего последующего анализа инфекционных и инфекционных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами от Министерства Тайваня по науке и технике (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), и Тайчжун ветеранов больницы (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
