Abstract
Un dispositivo analítico bajo costo robusta debe ser fácil de usar, rápida y asequible. Tales dispositivos también deben ser capaces de operar con muestras escasos y proporcionar información para el seguimiento del tratamiento. Aquí, demostramos el desarrollo de un análisis de orina basado en algodón (es decir, nitrito, proteína total y urobilinógeno ensayos) dispositivo analítico que emplea un formato basado en flujo lateral, y es barato, fácilmente fabricado, rápida, y se puede utilizar para llevar a cabo múltiples pruebas sin preocupaciones de contaminación cruzada. El algodón se compone de fibras de celulosa con propiedades de absorción naturales que pueden ser aprovechados para el análisis basado en el flujo. El simple pero elegante proceso de fabricación de nuestro dispositivo analítico basado en algodón se describe en este estudio. La disposición de la estructura de algodón y la prueba de la almohadilla se aprovecha de la hidrofobicidad y la fuerza de absorción de cada material. Debido a estas características físicas, los resultados colorimétricos pueden adherirse persistentemente a la pruebaalmohadilla. Este dispositivo permite a los médicos para recibir información clínica en el momento oportuno y muestra un gran potencial como herramienta para la intervención temprana.
Introduction
El desarrollo de los puntos de atención (PDA) dispositivos de diagnóstico que sean asequibles, robusto y fácil utilización es imprescindible para la mejora de la salud mundial 1,2. En particular, los dispositivos compuestos por sustratos de celulosa (por ejemplo, papel, hilo, algodón) y proporcionar plataformas analíticas prometedores para el análisis bajo costo debido a su ubicuidad, la accesibilidad, la facilidad de uso, robustez y capacidad para proporcionar resultados rápidos 3-7.
Aquí, revelamos el desarrollo de un dispositivo analítico basado en algodón que utiliza un formato basado en flujo lateral para análisis de orina. Este dispositivo analítico basado en el algodón ofrece un enfoque alternativo de detección con varias ventajas clave: i) la fabricación con el esfuerzo humano mínima; ii) bajo coste; iii) la capacidad de ser utilizado para llevar a cabo varios ensayos diferentes, sin preocupaciones de contaminación cruzada; . iv) la independencia de dispositivo, es decir, la capacidad de funcionar sin el equipo y / o electricidad adicional; y, v) Velocidad (ensayos colorimétricos se puede completar en 10 min).
La estructura de este dispositivo analítico basado en algodón se puede dividir en cuatro partes: i) de algodón que es naturalmente hidrófoba sobre su capa hidrófoba externa; ii) de algodón que es internamente hidrófilo y sirve como un canal de transporte para absorción de líquido; iii) película de laminación que se une y comprime el algodón se utiliza, pero contiene perforado los agujeros para la colocación de almohadillas de reacción / de prueba; y, iv) almohadillas de análisis papel de cromatografía, que se recubren / incrustados con reactivos reactivos, colocados en la superficie exterior del algodón (en concreto, en el espacio perforado fuera de la película de laminación) como zonas de reacción para ensayos colorimétricos (es decir, nitrito, proteína total, pH, y los ensayos de urobilinógeno) y visualización de resultados.
El mecanismo subyacente de la prueba es el siguiente. El dispositivo analítico basado en el algodón se obtuvo con las líneas que penetran a mitad de camino a través del departamentoh de la tela de algodón para crear un canal de flujo que permite que el fluido de la muestra para llegar a las almohadillas de reactivos utilizados. El borde de absorción del dispositivo analítico se sumerge en la muestra diana, después de lo cual la solución es malo a lo largo del canal fluídico desde el extremo de absorción para las almohadillas de ensayo (Figura 1). Debido a que la fuerza de absorción de la almohadilla de ensayo es mayor que la de algodón, soluciones absorbidas por las almohadillas de ensayo queden contenidos en el interior del papel almohadilla de ensayo de manera que no hay reflujo de nuevo en el canal fluídico, y los resultados colorimétricos se convierten posteriormente fijos en el material de la almohadilla de prueba. Al final de la reacción, los resultados colorimétricos se registran a través de un escáner de escritorio, y se analizaron mediante software de análisis de imagen.
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Protocol
PRECAUCIÓN: Se requiere la práctica adecuada de la higiene de laboratorio. Guantes y precauciones universales son necesarios cuando se utiliza este dispositivo POC. La contaminación de los resultados o la infección se puede producir si los procedimientos adecuados de esterilización no se realizan correctamente.
1. Preparar dispositivos de tira de prueba
- Determinar la hidrofobicidad de la capa exterior del algodón de limpieza mediante la medición del ángulo de contacto 8 (Figura 3).
- Fabricar el dispositivo analítico basado en algodón cortando algodón limpieza en 5,5 cm x 1 cm piezas con un cortador de papel (Figura 2A).
- Los agujeros del taladro (Ø = 0,5 cm) en una hoja estándar de la película de laminación en filas de tres; la distancia entre dos agujeros posteriores es de 1 cm.
NOTA: Tanto como 36 tiras de prueba individuales con tres zonas de prueba, cada uno puede hacerse usando una hoja estándar de la película de laminación (5,5 cm x 2 cm) (Figura 2B). - Sandwich del algodón de limpieza (characterized por hidrofobicidad e hidrofilicidad exterior interior) entre dos piezas de película de laminación, es decir, la hoja de agujero taladrado de película de laminación en un lado, y una lámina no perforada de la película de laminación (sin agujeros) en el otro lado. Coloque el conjunto en un laminador para empaquetar el dispositivo. Esto mejora la resistencia mecánica del dispositivo, y proporciona una capa externa, impermeable.
NOTA: Los diámetros de los agujeros se reducirá desde 0,5 cm a 0,47 ~ cm después de la laminación. Algunas ligeras deficiencias permanecerán entre el algodón y la limpieza de película de laminación en todo el perímetro de cada hoyo. Estas ligeras lagunas facilitan la colocación de los círculos almohadilla de análisis realizados en una etapa posterior. - Use un par de tijeras para cortar las tiras reactivas dispositivos individuales de 5,5 cm x 1 cm del conjunto, es decir, la hoja de laminado perforado / algodón / hoja de laminación sin perforar "sandwich" (Figura 2C). Hacer 48 dispositivos en total para crear curvas de calibración como se describe más adelante (18 dispositivospara el ensayo de nitrito, 15 dispositivos para el ensayo de BSA, y 15 dispositivos para el ensayo de urobilinógeno).
- Utilice un cuchillo afilado o de afeitar para cortar una ranura (como un pequeño canal fluídico) desde el centro de cada zona de ensayo (no cubierta por la película de laminación), a través y a través de la capa hidrófoba de área de prueba para la capa hidrófila del dispositivo longitudinal, ser cauteloso para cortar la mitad de la profundidad del dispositivo de intercalado (Figura 2D).
- Aplicar las almohadillas de análisis de papel (Ø = 0,5 cm) deslizándolos dentro de los huecos en el perímetro de cada agujero en el laminado (Figura 2E).
2. Preparar normas y el indicador de Soluciones para el análisis de orina
- Preparar 10,0 mM solución madre de nitrito mediante la disolución de nitrito de sodio 69,0 mg en 100 ml de agua desionizada (DI). Se diluye la solución de nitrito de stock en agua DI para crear una serie de soluciones de nitrito estándar de concentración (2.500, 1.250, 625, 312, 156, y 78 M) (Figura4A).
- Preparar 60 mM bovina solución de albúmina sérica (BSA) stock disolviendo 415 mg de BSA en 100 ml de solución de PBS (tampón fosfato 10 M, cloruro potásico 0,0027 M y cloruro de sodio 0,137 M; pH 7,0). Diluir la solución madre de BSA en agua DI para crear una serie de soluciones patrón de concentración de BSA (30, 15, 7,5, 3,75, y 1,875 M) (Figura 4B).
- Preparar 25 g / L de solución de stock de urobilinógeno disolviendo 2,5 g de urobilinógeno en 100 ml de agua DI. Diluir solución madre urobilinógeno en agua DI para crear una serie de soluciones de concentración urobilinógeno estándar (7.8, 15.6, 31.2, 62.5, y 125 mg / L) (Figura 4C).
- Preparar la solución de nitrito de indicador que contiene sulfanilamida 50 mM, ácido cítrico 330 mM, y dihidrocloruro de etilendiamina mM N- 10 (1-naftil).
- Preparar la solución de indicador de BSA que contiene 250 mM solución tampón de citrato (pH 1,8) y una solución 3,3 mM de tetrabromofenol azul en 95% de etanol.
- Preparar la solución de indicador de urobilinógeno que contiene 0,1 M benzaldehído 4-dimetilamina.
3. Preparar Pad Indicador
- Cortar tres almohadillas circulares o en forma de discos (Ø = 0,5 cm) de papel de cromatografía e insertar cada uno de ellos (uno para cada ensayo en la tira de ensayo de tres) en cada dispositivo de tira reactiva para crear una curva estándar de solución (sección 4).
- En cada uno de los tres agujeros de la película de laminación de la asamblea, observar un pequeño espacio entre la película de laminación y la almohadilla de ensayo de algodón en los mismos bordes del agujero cortado. Nota, el agujero en la película de laminación es ligeramente más pequeño en diámetro que la almohadilla de ensayo de papel.
NOTA: En conjunto, estas características permiten que la almohadilla de ensayo de papel que se aplica contra la parte de la almohadilla de prueba de algodón del dispositivo de manera que los bordes de la almohadilla de hoja de prueba de papel en el hueco delgado mencionado, es decir, en los bordes del agujero película de laminación. Esto mantiene las almohadillas de ensayo de papel en su lugar. - Preparar el nitrito Assay parte del dispositivo.
- Escudo de la almohadilla de análisis de nitrito con 4 l de solución de nitrito de indicador (preparado en el paso 2.4) y deje que se seque por completo a temperatura ambiente.
- Preparar el total de las porciones de ensayo de proteínas del dispositivo de detección.
- Escudo de la almohadilla de ensayo total de proteínas con 4 l de solución de BSA indicador (preparado en el paso 2.5) y deje que se seque por completo a temperatura ambiente.
- Preparar la porción Uroblinogen Ensayo del dispositivo de detección.
- Escudo de la almohadilla de análisis uroblinogen con 4 l de indicador uroblinogen (preparado en el paso 2.6) y deje que se seque por completo a temperatura ambiente.
4. Crear curvas de calibración para el dispositivo analítico basado en algodón
- Para cada patrón preparada, sumergir el extremo de absorción de un dispositivo preparado (precargado con indicadores de ensayo (ver sección 3.4)) en la solución estándar durante 10 segundos (el volumen de absorción ~200 - 300 l) (Figura 2F).
- Coloque el dispositivo basado en algodón en un entorno ambiente durante 10 min para completar reacciones colorimétricas (Figura 2F). Repetir cada experimento por triplicado.
- Analizar el dispositivo para analizar el cambio colorimétrico que ocurre en cada almohadilla de análisis (Figura 2G). Lugar resultante almohadillas de análisis en el cristal de un escáner de sobremesa y almohadillas de análisis de exploración en el modo RGB con 600 dpi de resolución de imagen. Guardar cada imagen en formato jpeg.
- Analizar la imagen escaneada en un ordenador utilizando el software de análisis de imágenes para determinar las intensidades de color respectivos (Figura 2H).
- Descargar el software ImageJ en http://imagej.nih.gov/ij/. Abrir los archivos de imágenes escaneadas. Seleccione la imagen en los comandos de menú y seleccione "Tipo" para convertir las imágenes RGB a escala de grises de 8 bits.
- Utilice la herramienta de "oval" en la barra de herramientas para seleccionar el área de análisis de la almohadilla de prueba. Seleccione "Analizar" en el menú de comunicacionesands, y seleccione "medida" para analizar la intensidad del color. Grabar significa resultados de intensidad.
- Establecer las curvas estándar de nitrito, proteína total, y los ensayos de urobilinógeno (Figura 2I).
- Indicar diferentes concentraciones de nitrito estándar, proteína total, y soluciones de urobilinógeno y correlacionada resultados medios de intensidad en un sistema de coordenadas de dos dimensiones utilizando software stastical.
- Adaptarse a la curva estándar para un ensayo de nitrito por un modelo cuadrático y las curvas de calibración para proteínas totales y urobilinógeno ensayos de modelos de regresión lineal.
5. Determinar concentraciones de las muestras desconocidas usando establecido valores curva estándar
- Para determinar el nitrito, proteína total, y las concentraciones de urobilinógeno en soluciones desconocidas, utilizar el dispositivo como se describe para la medición de concentraciones de la solución estándar y sustitutos medido resultados de intensidad para el nitrito, proteína total y urobilinogen ensayos en las ecuaciones de los modelos construidos en el paso 2.
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Representative Results
Hemos demostrado con éxito el desarrollo de dispositivos analíticos basados en algodón mediante el uso de algodón disponible en el mercado que se caracteriza por la limpieza de hidrófilo (parte interior) y propiedades hidrofóbicas (parte exterior) (figura 1A). La figura 3 muestra los resultados de la medición del ángulo de contacto. La interfaz hidrofóbica de algodón exterior era 127.35 ° ± 4,73 °. Desde una perspectiva fácil de usar, ensayos colorimétricos utilizados aquí pueden ser observados directamente por el ojo desnudo, y aún más cuantificados a través de los análisis de la intensidad del color (Figura 2F). La orina de proteína total en un individuo normal debe ser inferior a 150 mg / dl (4 M). El valor de iones nitrito de orina se asocia con infecciones del tracto urinario o las infecciones bacterianas, por lo que la sensibilidad analítica de detección de nitrito de orina debe ser lo más bajo posible cuando se trata de el desarrollo de dispositivos de análisis para unaensayo de nitrito. Urobilinógeno se excreta por las heces y recuperado por la circulación enterohepática, pero algunos niveles de urobilinógeno, aproximadamente 1 - 4 mg / día, se pueden encontrar en la orina Figura 4A -. C ilustra los resultados de nuestros esfuerzos para crear las curvas de calibración para cada ensayo objetivo. Estas curvas de calibración se establecieron mediante el examen de los resultados promedio de intensidad colorimétrica y comparándolas con las concentraciones de concentraciones estándar que establecimos. Esto nos permitió evaluar el límite de detección (Lods) para cada ensayo. Los LD para nitrito, BSA, y urobilinógeno en sistemas tampón eran, 0,147 mM, 3,672 M, y 4,861 mg / L, respectivamente. Esto también nos proporcionó un marco matemático para determinar las concentraciones de nitrito, BSA, y urobilinógeno en soluciones desconocidas.
Figura 1 >. Diagrama esquemático del dispositivo analítico basado en algodón. Arriba y la sección transversal ver imágenes muestran las dimensiones de cada almohadilla de ensayo (0,5 cm de diámetro) y dispositivo basado en el algodón (1 cm de ancho x 5,5 cm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Proceso de fabricación de dispositivos basados en algodón analítica, toma de muestras y análisis de resultados. (A) Un cortador de papel se utiliza para cortar trozos de algodón de limpieza para el tamaño especificado. (B) Una pluma se utiliza para marcar la ubicación de laminado agujeros de cine en la asamblea. (C) Un laminador se utilizó para emparedar el montaje entre dos capas de película de laminación por calentamiento. (D) (E) Las almohadillas de ensayo se han instalado en el dispositivo de algodón. (F) Urobilinógeno, BSA, y los ensayos de nitrito se realizaron con nuestro dispositivo analítico basado en algodón. Imágenes (G) de los resultados se hicieron y se importa a un ordenador mediante un escáner. (H) de software de análisis de imágenes se utilizó para analizar las imágenes mediante el análisis del estado de contraste de escala de grises. (i) los resultados de intensidad obtenidos se ajustaron a una curva estándar. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados del ángulo de contacto para la limpieza del algodón. Agua DI (1 l), se dejó caer en el exterior de algodón, Capa hidrófoba para determinar el ángulo de contacto.
Figura 4. Resultados del análisis de nitrito, urobilinógeno, y BSA en el dispositivo analítico basado en el algodón. Las curvas de calibración para (A) de nitrito (0,156 a 2,5 mM), (B) BSA (1,875 a 30 mM), (C) urobilinógeno ( . 7.8 - 125 mM) para cada concentración, las pruebas se realizaron por triplicado y los valores de R 2 para el ajuste de curvas eran nitrito: 0,99, BSA: 0,98, y urobilinógeno: 0,95. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos en este protocolo incluyen la determinación de la combinación adecuada de tela de algodón (con diferentes hidrofobicidad / hidrofilicidad) y el papel de filtro (papel de filtro o cromatografía de papel de filtro cuantitativo). Un diseño del dispositivo bien planificado y ejecutado hace atribuye el mejor rendimiento para ensayos colorimétricos. A partir de nuestros resultados de ensayo colorimétrico, el dispositivo analítico basado en algodón presentada en este documento demuestra un gran potencial como una plataforma para la detección de la enfermedad múltiples.
La mayoría de los productos actuales lateral flujo base (por ejemplo., Prueba de embarazo) proporcionan no más de un único ensayo functon 14. Si bien algunos análisis de tiras reactivas, realizar ensayos de múltiples biomarcadores 15, su uso corre el riesgo de contaminación de la muestra colateral porque los reactivos de ensayo en contacto directamente con muestras de ensayo. Nuestro dispositivo supera este obstáculo y se puede utilizar para implementar múltiples ensayos colorimétricos en un único dispositivo de canal basada en el flujo lateral.
Este método sólo se limita por el tamaño molecular analito diana. Los valores de R 2 y LOD de nitrito son mucho mayores que las de los otros ensayos (BSA y urobilinógeno), lo que sugiere que nuestros dispositivos son más adecuados para el análisis molecular bajo 5 (Figura 4).
Algunos optimización adicional puede ser necesaria con el fin de mejorar la practicidad de este dispositivo para la práctica clínica. Esta optimización incluye la mejora de la fiabilidad y estabilidad de los reactivos de ensayo cuando se expone al ambiente exterior durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, creemos que esta invención crea una incursión decisiva y valioso en el desarrollo de dispositivos analíticos de bajo costo que se puede utilizar de forma fiable en la práctica clínica, especialmente en lo que respecta al cumplimiento de las necesidades para el análisis rápido y preciso y el análisis de seguimiento adecuado del transmisibles y enfermedades infecciosas.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 104-2628-E-007-001-MY3 (CMC)), y el Hospital General de Veteranos Taichung (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
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