Abstract
En robust, låg kostnad analytiska enheten ska vara användarvänliga, snabba och prisvärda. Sådana produkter bör också kunna arbeta med knappa prover och ge information för uppföljande behandling. Här visar vi utvecklingen av en bomullsbaserat urinanalys (dvs., nitrit, totalt protein, och urobilinogen-analyser) analytisk anordning som utnyttjar ett lateralt flöde-baserat format, och är billig, lätt att tillverka, snabb, och kan användas för att genomföra flera tester utan korskontaminering bekymmer. Bomull är sammansatt av cellulosafibrer med naturliga absorberande egenskaper som kan utnyttjas för flödesbaserad analys. Den enkla men eleganta tillverkningsprocess av vår bomullsbaserade analytiska anordning beskrivs i denna studie. Arrangemanget av bomullsstruktur och testdynan drar fördel av hydrofobiciteten och absorberande styrka varje material. På grund av dessa fysiska egenskaper, kan kolorimetriska resultat envist hålla sig till testetvaddera. Denna anordning gör det möjligt för läkare att få klinisk information i rätt tid och visar stor potential som ett verktyg för tidigt ingripande.
Introduction
Utvecklingen av point-of-care (POC) diagnostiska anordningar som är prisvärda, robust och lätt att använda är absolut nödvändigt för att förbättra den globala hälsan 1,2. I synnerhet anordningar som består av cellulosasubstrat (t ex papper, tråd, och bomull) ger lovande analytiska plattformar för låg-kostnadsanalys på grund av deras utbredning, överkomliga, användarvänlighet, robusthet och förmåga att ge snabba resultat 3-7.
Här, vi avslöja utvecklingen av en bomullsbaserade analytisk anordning som använder en flödes-baserat format för urinanalys. Detta bomull-baserade analysanordning ger en alternativ metod att upptäcka med flera viktiga fördelar: i) tillverkning med minimal mänsklig ansträngning; ii) låg kostnad; iii) förmåga att användas för att utföra flera, olika analyser utan korskontaminering oro; . iv) apparatoberoende, det vill säga förmågan att köras utan extra utrustning och / eller elektricitet; och, v) Hastighet (kolorimetriska analyser kan slutföras inom 10 minuter).
Strukturen för denna bomull-baserade analysanordning kan delas upp i fyra delar: i) bomull som är naturligt hydrofoba på sin yttre hydrofoba skiktet; ii) bomull som är internt hydrofila och fungerar som en transportkanal för flytande uppsugning; iii) laminering film som binder och komprimerar bomull som används, utan innehåller borras ut hål för placering av reaktion / testfält; och, iv) kromatografipapper testfält, som är belagda / inbäddade med reaktiva reagens, som släpps ut på den yttre ytan av den bomull (närmare bestämt i utrymmet borras ut av lamineringsfilm) som reaktionsområden för kolorimetriska analyser (dvs., nitrit, totalt protein, pH och urobilinogen-analyser) och resultaten display.
Den underliggande mekanismen för testet är enligt följande. Bomullen baserade analysanordning poängsätts med linjer som tränger halvvägs genom avdh hos bomullsmaterial för att skapa en flödeskanal som tillåter provvätskan för att nå de reaktiva dynor som används. Det absorptiva kanten av den analytiska anordningen är nedsänkt i det riktade urvalet, varefter lösningen är ond längs fluidkanalen från absorptionen slut på de testdynorna (figur 1). Eftersom absorptiva styrkan hos testkudden är större än den för bomull, är lösningar absorberas av testdynorna stadigt innesluten inne i testdynan papperet så att det inte finns någon reflow tillbaka in i fluidkanalen, och de kolorimetriska resultaten blir därefter fixerad på testdynan materialet. Vid slutet av reaktionen, är kolorimetriska resultaten registreras via en bordsskanner, och analyserades via bildanalyserande mjukvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: God sed laboratoriehygien krävs. Handskar och universella försiktighetsåtgärder krävs vid användning av denna POC enhet. Förorening av resultat eller infektion kan uppstå om lämpliga steriliseringsprocedurer inte genomförs korrekt.
1. Bered testremsatillbehör
- Bestämma hydrofobiciteten av det yttre skiktet av den rengörande bomull kontaktvinkelmätning 8 (Figur 3).
- Fabricera bomullsbaserade analytisk anordning genom att skära rensning bomull i 5,5 cm x 1 cm bitar med en pappersskärare (Figur 2A).
- Borra hål (ø = 0,5 cm) i en standard ark lamine film i rader av tre; avståndet mellan två på varandra följande hål är 1 cm.
OBS: Så många som 36 individuella testremsor med tre testområdena var och en kan göras med en vanlig ark lamine film (5,5 cm x 2 cm) (Figur 2B). - Sandwich rengörings bomull (characterized av yttre hydrofoba och interiör hydrofilicitet) mellan två bitar av lamine film, dvs hål borrade ark lamine film på ena sidan och en oborrad ark lamine film (inga hål) på den andra sidan. Placera enheten i en laminator för att paketera anordningen. Detta förbättrar anordningens mekaniska hållfasthet, och åstadkommer en yttre, ogenomträngligt skikt.
OBS! Diametrar hål kommer att krympa från 0,5 cm till ~ 0,47 cm efter laminering. Vissa smärre brister kvarstår mellan rengöring bomull och lamine film runt omkretsen av varje hål. Dessa små luckor underlätta placeringen av testkudden cirklar gjort i ett efterföljande steg. - Använd ett par sax för att klippa enskilda 5,5 cm x 1 cm provremsor enheter från enheten, det vill säga det borrade lamine plåt / bomullstuss / oborrad lamine ark "sandwich" (figur 2C). Gör 48 enheter totalt att skapa standardkurvor som beskrivs senare (18 enheterför nitritanalysen, 15 enheter för BSA-analysen, och 15 anordningar för urobilinogen analysen).
- Använd en vass kniv eller rakblad för att skära en slits (som en liten fluidkanal) från mitten av varje testområde (som inte omfattas av lamine film), över och genom det hydrofoba skiktet av testområdet för att det hydrofila skiktet av den längsgående anordningen, att vara försiktig för att skära halvvägs genom djupet av den inklämt anordning (figur 2D).
- Applicera papper testdynorna (ø = 0,5 cm) genom att skjuta dem i luckorna på omkretsen av varje hål i laminering (Figur 2E).
2. Förbered Standarder och Indikator Lösningar för Urinanalys
- Förbered 10,0 mM nitrit stamlösning genom att lösa 69,0 mg natriumnitrit i 100 ml avjoniserat (DI) vatten. Späd nitrit stamlösning i avjoniserat vatten för att skapa en serie av nitritkoncentration standardlösningar (2.500, 1.250, 625, 312, 156, och 78 ^ M) (figur4A).
- Förbered 60 pM bovint serumalbumin (BSA) förrådslösning genom att lösa 415 mg BSA i 100 ml PBS-lösning (10 M fosfatbuffert, 0,0027 M kaliumklorid och 0,137 M natriumklorid; pH 7,0). Späd BSA stamlösning i avjoniserat vatten för att skapa en serie av BSA koncentration standardlösningar (30, 15, 7,5, 3,75, och 1,875 pM) (figur 4B).
- Förbered 25 g / L urobilinogen förrådslösning genom att lösa 2,5 g urobilinogen i 100 ml DI-vatten. Späd lager urobilinogen lösning i avjoniserat vatten för att skapa en serie av urobilinogen koncentrationsstandardlösningar (7,8, 15,6, 31,2, 62,5, och 125 mg / L) (Figur 4C).
- Förbereda nitrit indikatorlösning innehållande 50 mM sulfanilamid, 330 mM citronsyra, och 10 mM N- (1-naftyl) etylendiamin-dihydroklorid.
- Förbereda BSA indikatorlösning innehållande 250 mM citrat-buffertlösning (pH 1,8) och 3,3 mM lösning av tetrabromophenol blått i 95% etanol.
- Förbereda urobilinogen indikatorlösning innehållande 0,1 M 4-Dimetylamin bensaldehyd.
3. Förbered Indikator Pads
- Skär tre cirkulära formade kuddar eller diskar (ø = 0,5 cm) från kromatografi papper och sätt var och en av dem (en för varje analys på tre analysremsan) på varje testremsa enhet för att skapa en lösning standardkurva (avsnitt 4).
- Vid vart och ett av de tre lamineringsfilm hål i aggregatet, observera ett litet mellanrum mellan lamineringsfilmen och bomullstestkudde vid själva kanterna på den kapade hålet. Notera, hålet i lamine filmen är något mindre i diameter än papperstestdynan.
OBS: Tillsammans utgör dessa funktioner kan papperstestkudde som skall tillämpas mot bomullstestkudden del av enheten så att kanterna på papperstestkudden glida in i smala gap som nämns, det vill säga under kanterna av lamineringsfilmen hålet. Detta håller papperstestdynorna på plats. - Förbered Nitrit Assay delen av anordningen.
- Coat nitritanalysplattan med 4 pl nitrit indikatorlösning (framställd i steg 2,4) och låt den torka helt vid rumstemperatur.
- Förbered Total Protein Assay Andel av detekteringsanordningen.
- Coat den totala proteinanalys pad med 4 pl BSA indikatorlösning (framställd i steg 2,5) och låt den torka helt vid rumstemperatur.
- Förbered Uroblinogen analys Andel av detekteringsanordningen.
- Täck uroblinogen analysplattan med 4 pl uroblinogen indikator (framställd i steg 2,6) och låt den torka helt vid rumstemperatur.
4. Skapa standardkurvor för Bomull baserad analytisk anordning
- För varje standard som utarbetats, doppa absorberande änden av en förberedd enhet (förladdad med analys indikatorer (se avsnitt 3.4)) i standardlösningen under 10 sekunder (absorption volym ~200 - 300 l) (Figur 2F).
- Placera bomulls baserad enhet i en omgivande miljö för 10 minuter för att slutföra kolorimetriska reaktioner (Figur 2F). Upprepa varje experiment i tre exemplar.
- Skanna enheten att analysera den kolorimetriska förändringen inträffar vid varje testdyna (figur 2G). Plats vilket testdynorna på glaset i en bordsskanner och skanna provdynor i RGB-läge med 600 dpi i upplösning. Spara varje bild i JPEG-format.
- Analysera den skannade bilden på en dator med programvara bildanalys för att bestämma respektive färgintensitet (Figur 2H).
- Ladda ner ImageJ programvara på http://imagej.nih.gov/ij/. Öppna skannade bildfiler. Välj Bild i menykommandon, och välj "Type" för att konvertera RGB-bilder till 8-bitars gråskala.
- Använd "oval" verktyg i verktygsfältet för att välja testdynan analytiska området. Välj "Analysera" i menyn commands, och välj "Measure" för att analysera färgintensitet. Record betyda intensitet resultat.
- Fastställa standardkurvorna nitrit, totalt protein, och urobilinogen analyser (Figur 2i).
- Anger olika koncentrationer av standard nitrit, totalt protein, och urobilinogen lösningar och korreleras genomsnittliga intensitetsresultat på ett tvådimensionellt koordinatsystem med användning stastical programvara.
- Montera standardkurva för ett nitritanalys av en kvadratisk modell och standardkurvorna för total protein och urobilinogen analyser av linjära regressionsmodeller.
5. Bestäm okänt prov koncentrationer med en etablerad standard Curve Värden
- För att bestämma nitrit, totalprotein och urobilinogen koncentrationer i okända lösningar, använda enheten som beskrivits för att mäta standardlösningskoncentrationer och ersättnings uppmätta intensitetsresultat för nitrit, totalt protein, och urobilinogen analyser i ekvationerna modellerna byggs i steg två.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerade framgångsrikt utvecklingen av bomullsbaserade analytiska anordningar genom att använda kommersiellt tillgängliga rengörings bomull kännetecknas av hydrofila (inre del) och hydrofoba (yttre del) egenskaper (Figur 1A). Figur 3 visar resultaten av kontaktvinkelmätning. Den hydrofoba gränssnittet mellan exteriör bomull var 127,35 ° ± 4,73 °. Från ett användarvänligt perspektiv, kan kolorimetriska analyser som används här observeras direkt med blotta ögat, och vidare kvantifieras genom färgintensiteten analyser (Figur 2F). Urin totalt protein i en normal individ bör vara mindre än 150 mg / dl (4 M). Värdet av urinnitritjoner är associerad med urinvägsinfektioner eller bakteriella infektioner, så den analytiska känsligheten hos urin nitrit upptäckt bör vara så låg som möjligt när det gäller utvecklingen av analytiska anordningar för ennitrit analys. Urobilinogen utsöndras via avföringen och utvanns genom den enterohepatiska cirkulationen, men vissa nivåer av urobilinogen, ca 1 - 4 mg / dag, kan återfinnas i urinen Figur 4A -. C illustrerar resultaten från våra ansträngningar att skapa standardkurvor för varje analys mål. Dessa standardkurvor fastställdes genom att undersöka medel kolorimetrisk intensitet resultat och jämföra dem till koncentrationerna av standardkoncentrationer som vi etablerade. Detta tillät oss att utvärdera den gräns på detekteringar (bestämningsgränser) för varje analys. De bestämningsgränser för nitrit, BSA, och urobilinogen i buffertsystem var, 0,147 mM, 3,672 pM och 4,861 mg / L, respektive. Detta gav oss också med en matematisk ram för att bestämma koncentrationerna av nitrit, BSA, och urobilinogen i okända lösningar.
Figur 1 >. Schematiskt diagram över Cotton-baserade analysanordning. Top och tvärsnitt visa bilder visar måtten för varje testdyna (0,5 cm i diameter) och bomull-baserad enhet (1 cm bredd x 5,5 cm längd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Framställningsprocesser av Cotton-baserade analysanordning, provtagning och resultatanalys. (A) En pappersskärare användes för att skära bitar av rengöring bomull till den angivna storleken. (B) En penna användes för att markera platser för laminering film hål i aggregatet. (C) En laminator användes för att sandwich aggregatet mellan två skikt av lamineringsfilm genom upphettning. (D) (E) Test kuddar installerades på bomulls enheten. (F) urobilinogen, BSA, och nitrit utfördes med vår bomullsbaserade analysanordning. (G) Images av resultaten gjordes och importeras till en dator med hjälp av en scanner. (H) Bildanalys programvara användes för att analysera bilder av gråskala kontrast tillstånd analys. (i) de erhållna intensitets resultaten monteras i en standardkurva. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kontaktvinkel Resultat för rengöring bomull. DI vatten (1 pl) droppades på bomull externa, Hydrofobt skikt för att bestämma kontaktvinkeln.
Figur 4. analysresultat för nitrit, urobilinogen, och BSA om Cotton-baserade analysanordning. De standardkurvor för (A) nitrit (0,156 till 2,5 mM), (B) BSA (1,875 till 30 M), (C) urobilinogen ( . 7,8-125 M) för varje koncentration, tester utfördes i tre exemplar och R 2 värden för montering kurvan var nitrit: 0,99, BSA: 0,98, och urobilinogen: 0,95. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i detta protokoll ingår att fastställa en lämplig kombination av bomull material (med varierande hydrofobicitet / hydrofilicitet) och filterpapper (kromatografi filterpapper eller kvantitativ filterpapper). En väl planerad och utförd enhet konstruktion gör den bästa prestandaegenskaper för kolorimetriska analyser. Från våra kolorimetriska analysresultat, bomullsbaserade analytisk anordning som presenteras häri visar stor potential som en plattform för flera upptäckt sjukdom.
De flesta av dagens lateralt flöde-base produkter (t.ex.., Graviditetstest) ger inte mer än en enda analys functon 14. Medan vissa tester med mätsticka utföra flera biomarkörer analyser 15, driver deras användning risken för säkerheter provkontaminering eftersom analysreagens kontakta testproverna. Vår anordning övervinner detta hinder och kan användas för att implementera flera kolorimetriska analyser i ett enda lateralt flöde baserade kanalanordning.
Denna metod begränsas endast av målanalyt molekylstorlek. R 2 och LOD-värden för nitrit är mycket större än de övriga analyser (BSA och urobilinogen), vilket tyder på att våra produkter är mer lämpade för låg molekylär analys 5 (Figur 4).
Några ytterligare optimering kan behövas för att förbättra det praktiska i den här enheten för klinisk praxis. Denna optimering ingår också att förbättra tillförlitligheten och stabiliteten av analysreagens när de utsätts för den yttre miljön för långa tidsperioder. Ändå tror vi att denna uppfinning skapar en avgörande och värdefull inbrytning i utvecklingen av billiga analytiska anordningar som kan användas på ett tillförlitligt sätt i klinisk praxis, särskilt när det gäller att uppfylla behov av snabb och noggrann analys och lämplig uppföljande analys av smittsamma och infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Taiwans ministeriet för vetenskap och teknik (MOST 104-2628-E-007-001-My3 (CMC)), och Taichung Veterans General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
