Abstract
Sağlam, düşük maliyetli analitik cihaz kullanıcı dostu, hızlı ve uygun fiyatlı olmalıdır. Bu tür cihazlar da kıt örnekleri ile çalışır ve takip tedavi için bilgi sağlamak gerekir. Burada, bir yanal akış tabanlı bir format kullanır ve kolay, hızlı, ucuz imal edilir ve yürütmek için kullanılabilir (yani, nitrit, toplam protein ve ürobilinojen tahlilleri) değerlendirme cihazı pamuk bazlı idrar tahlili gelişimini göstermektedir çapraz bulaşma endişeleri olmaksızın çoklu testler. Pamuk akımı bazlı analiz için kaldıraçlı doğal emme özellikleri olan selüloz liflerinin oluşmaktadır. Bizim pamuk bazlı analitik cihazın sade ama şık fabrikasyon süreci bu çalışmada açıklanmıştır. Pamuk yapısı ve test pedi düzenlenmesi hidrofobikliği ve her malzemenin emme gücü yararlanır. Çünkü bu fiziksel özelliklerinin, kolorimetrik sonuçları ısrarla testin yapışabilirped. Bu cihaz zamanında klinik bilgi almak için hekimlerin sağlar ve erken müdahale için bir araç olarak büyük bir potansiyel gösterir.
Introduction
Nokta-bakım gelişimi (POC), uygun fiyatlı, sağlam ve kolay kullanılan küresel sağlık 1,2 geliştirmek için zorunludur olan tanı cihazları. Özellikle, cihazlar selüloz yüzeylerde (örneğin, kağıt, iplik ve pamuk) nedeniyle aynı anda her yerde, uygun fiyatta, hızlı sonuçlar 3-7 sağlamak için kullanım, sağlamlık ve kapasite kolaylığı, düşük maliyet analizi için umut verici analitik platformlar sağlamak oluşan.
Burada, idrar tahlili için bir yanal akış tabanlı biçimini kullanan bir pamuk bazlı analitik cihazın geliştirilmesini açıklayacak. Bu pamuk bazlı analitik cihaz birkaç anahtar avantajları ile alternatif bir algılama yaklaşım sağlamaktadır: en az insan çaba ile i) üretimi; ii) düşük maliyetli; iii) kapasitesi çapraz kontaminasyon endişeleri olmaksızın birden çok farklı deneyleri yapmak için kullanılacak; . iv) aygıt bağımsızlığı, yani, yetenek ek donanım ve / veya elektrik olmadan çalıştırılmak üzere; ve h) Hızı (kolorimetrik tahlilleri) 10 dakika içinde tamamlanabilir.
Bu pamuk bazlı analitik cihazı yapısı dört bölüme ayrılabilir: i) dış hidrofobik katman üzerinde doğal olarak hidrofobik olan pamuk; ii) dahili olarak hidrofiliktir ve sıvı fitilleme bir ulaşım kanalı olarak hizmet veren pamuk, bağlanan ve pamuk kullanılan ancak reaksiyon / test pedleri yerleştirilmesi için delikleri delinmiş içeren sıkıştırır iii) laminasyon filmi; ve iv) kolorimetrik deney için reaksiyon alanları olarak pamuk (spesifik olarak, boşlukta laminasyon filmi üzerinden delinmiş) dış yüzeyi üzerine yerleştirilen / kaplanmış Reaktif ile gömülürler kromatografi kağıdı test pedleri, (örneğin, nitrit, toplam protein, pH ve ürobilinojen tahlilleri) ve sonuçları ekran.
aşağıdaki şekilde test mekanizmadır. pamuk bazlı analitik cihaz borç yoluyla yarım nüfuz hatları ile atılırsaPamuk malzemesinin h numunesi reaktif pedler kullanılan ulaşmasını sağlayan bir akış kanalı oluşturmak için. Çözelti testi pedleri (Şekil 1) emme ucundan akışkan kanalı boyunca kötü olduğunu bunun üzerine analitik cihazın emici kenarı, hedef numunenin içine batırılır. Test yastığının emici gücü pamuktan daha büyük olduğundan, deney yastıkları tarafından emilir çözümler hiçbir reflow akışkan kanala geri kalmayacak şekilde sıkıca Test ped kağıt içinde yer alır ve kolorimetrik sonuçlar daha sonra sabit hale Test pedi malzemesi. Reaksiyon sonunda, kolorimetrik sonuçlar bir masaüstü tarayıcısı üzerinden kaydedilir ve görüntü analiz yazılımı ile analiz edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİKKAT: Uygun laboratuvar hijyen uygulamaları gerekmektedir. Bu POC cihazı kullanırken eldiven ve evrensel önlemler gereklidir. Yeterli sterilizasyon prosedürleri düzgün yapılmadığı takdirde sonuçları veya enfeksiyon bulaşma meydana gelebilir.
1. Test Şerit Cihazları hazırlayın
- Temas açısı ölçümü 8 (Şekil 3) ile temizlik pamuk dış tabakasının hidrofobikliğini belirleyin.
- Bir kağıt kesici (Şekil 2A) ile 5.5 cm x 1 cm parçalar halinde temizlik pamuk keserek pamuk bazlı analitik cihaz imal.
- Üç satır laminasyon filmi standart bir levha delik açın (ø = 0.5 cm); birbirini takip eden iki delik arasındaki mesafe 1 cm'dir.
NOT: Her laminasyon filmi, standart bir tabaka (5.5 cm x 2 cm) (Şekil 2B) kullanılarak yapılabilir üç test alanları gibi bir çok 36 nolu ayrı ayrı test şeritleri. - temizlik pamuk Sandwich (characterizLaminasyon filmi, örneğin, bir tarafta laminasyon filmi delik delinmiş sac, ve diğer tarafta da laminasyon filmi bir delinmemiş tabaka (deliksiz) iki adet arasında dış hidrofobiklik ve iç hidrofilikliği) tarafından ifa. Cihazı paketlemek için bir laminar içine derleme yerleştirin. Bu cihazın mekanik mukavemet artırır ve harici, su geçirmez katmanı sağlar.
NOT: Delik çapları 0.47 cm laminasyon sonra 0.5 cm ~ den küçülecek. Bazı hafif boşluklar her deliğin çevresinde temizlik pamuk ve laminasyon filmi arasında kalacaktır. Bu hafif bir boşluk, bir sonraki aşamada yapılan deney tampon çevrelerinde yerleştirilmesini kolaylaştırır. - Yani montaj, bireysel 5,5 cm x 1 cm test şeridi cihazları kesmek için makas bir çift kullanın, delinmiş laminasyon sac / pamuk ped / deliksiz laminasyon sac "sandviç" (Şekil 2C). (Daha sonra açıklanacağı şekilde 48 cihazlar standart eğrileri oluşturmak için toplam 18 cihazlar yapmakNitrit deneyi için, BSA Deney 15 aygıtları ve ürobilinojen tahlilinde 15 cihazları).
- Her test alanının ortasına (laminasyon filmi kapsamına girmeyen) den (küçük bir akışkan kanalı gibi) bir yarık kesmek için keskin bir bıçak ya da jilet kullanın, karşısında ve boyuna cihazın hidrofilik tabakasına test alanının hidrofobik katmanı sayesinde, dikkatli olmak sandviç cihazı (Şekil 2B) derinliği ile yarım kesmek için.
- Laminasyon (Şekil 2E) her deliğin çevresine boşlukları içine kaydırarak kağıt testi yastıkları (ø = 0.5 cm) uygulayın.
2. idrar tahlili için Standartlar ve Gösterge Çözümleri hazırlayın
- (Di) deiyonize su, 100 ml 69.0 mg sodyum nitrit çözülmesiyle 10.0 mm nitrit stok çözelti hazırlayın. Bir nitrit konsantrasyonu, standart solüsyonların dizi (2.500, 1.250, 625, 312, 156, ve 78 mcM) oluşturmak için DI su nitrit stok solüsyonu sulandırmak (Şekil4A).
- 100 ml PBS çözeltisi 415 mg BSA çözülmesiyle 60 uM sığır serum albümini (BSA) bir stok çözelti hazırlayın (10 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür ve 0.137 M sodyum klorür, pH 7.0). BSA konsantrasyonu standart solüsyonların bir dizi oluşturmak için DI su BSA stok solüsyonu sulandırmak (30, 15, 7.5, 3.75 ve 1.875 uM) (Şekil 4B).
- 100 ml Dİ su içinde 2.5 gr urobilinogen çözülmesiyle 25 g / L ürobilinojen stok çözelti hazırlayın. Ürobilinojen konsantrasyonu, standart çözümlerin (7.8, 15.6, 31.2, 62.5 ve 125 mg / L) (Şekil 4C) bir dizi oluşturmak için DI su stok ürobilinojen çözeltisi ile seyreltilir.
- 50 mM sülfanilamid, 330 mM sitrik asit ve 10 mM N- (1-naftil) etilenediamin diklorid içeren nitrit gösterge solüsyonu hazırlanır.
- 250 mM sitrat tampon çözeltisi (pH 1.8) ve% 95 etanol içinde tetrabromophenol mavi 3.3 mM solüsyonu BSA gösterge solüsyonu hazırlanır.
- 0.1 M 4-dimetilamin benzaldehit içeren ürobilinojen indikatör çözeltisi hazırlayın.
3. Gösterge Pads hazırlayın
- Üç yuvarlak şekilli pedleri veya diskler (ø = 0.5 cm) kromatografi kağıttan kesilmiş ve bir çözüm standart bir eğri (bölüm 4) oluşturmak için her test şeridi cihaz üzerine onlara (üç deney şeridi üzerinde her bir deney için bir tane) her yerleştirin.
- toplanma üç laminasyon filmi deliklerin her anda, laminasyon filmi ve kesim deliğin çok kenarlarında pamuk test pedi arasında hafif bir boşluk görüyoruz. laminasyon filmi delik kağıt test pedi daha çapı biraz daha küçüktür, dikkat edin.
NOT: Birlikte, bu özellikler kağıt testi ped cihazının pamuk testi ped kısmına karşı uygulanacak izin böylece laminasyon filmi deliğin kenarlarına altında bahsedilen ince boşluk, yani içine kağıt testi ped kayma kenarları. Bu yerde kağıt testi yastıkları tutar. - Nitrit assa hazırlayınCihaz y Porsiyon.
- Coat nitrit göstergesi (adım 2.4 hazırlanmış) çözeltisi ve ortam sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin 4 ul nitrit tahlil ped.
- Tespit Cihazı Toplam Protein Deney Porsiyon hazırlayın.
- Kat BSA göstergesi çözeltisi (adım 2.5 hazırlandı) ve oda sıcaklığında tam olarak kurumasına izin 4 ul toplam protein tahlili pedi.
- Tespit Cihazının Uroblinogen Deneyi Porsiyon hazırlayın.
- Kat uroblinogen (adım 2.6 hazırlandı) ve oda sıcaklığında tam olarak kurumasına izin 4 ul uroblinogen deney takımı.
4. Pamuk temelli Analitik Cihaz için standart eğrileri oluşturun
- hazırlanan her standart için, önceden hazırlanmış bir cihazın emici ucunu batırın ~ 10 sn (emilim hacmi standart çözeltisi içine (deney göstergelerinin (bakınız bölüm 3.4) ile önceden yüklenmiş)200-300 ul) (Şekil 2F).
- 10 dk kolorimetrik reaksiyonlar (Şekil 2F) tamamlamak için bir çevre ortamında pamuk tabanlı bir aygıt yerleştirin. üç kopya halinde her bir deney tekrar edin.
- Her test pedi (Şekil 2G) meydana gelen kolorimetrik değişim analiz cihazı tarayın. Bir masaüstü tarayıcı ve görüntü çözünürlüğü 600 dpi RGB modunda tarama testi pedleri camına deney yastıkları ortaya çıkan bir yer. jpeg formatında her görüntü kaydetme.
- Ilgili renk yoğunlukları (Şekil 2H) belirlemek için görüntü analizi yazılımı kullanılarak bir bilgisayarda taranan görüntüyü analiz edin.
- http://imagej.nih.gov/ij/ at ImageJ yazılımı indirin. Taranan görüntü dosyaları açın. Menü komutları Görüntü seçin ve 8-bit gri tonlama RGB görüntüleri dönüştürmek için "Type" ı seçin.
- Test pedi analitik alanı seçmek için araç çubuğundaki "Oval" aracını kullanın. Seçin menü comm içinde "Analiz"Eleştiri ve renk yoğunluğunu analiz etmek "Tedbir" seçeneğini seçin. Kayıt yoğunluğu sonuçlarını anlamına gelir.
- Nitrit, total protein ve ürobilinojen deneyleri (Şekil 2I) standart eğrileri kurmak.
- Standart nitrit, toplam protein ve ürobilinojen çözeltiler farklı konsantrasyonlarını gösterir ve stastical yazılımı kullanılarak, iki boyutlu bir koordinat sistemine göre ortalama yoğunluğu sonuçlarıyla karşılaştırıldı.
- karesel model ve lineer regresyon modelleri ile total protein ve ürobilinojen deneyleri için standart eğrileri tarafından nitrit tayini için standart eğriye uyacak.
5. Kuruluş Standart Eğri değerleri kullanma Bilinmeyen Numune Konsantrasyonları belirleyin
- , Nitrit, total protein ve bilinmeyen çözümler ürobilinojen konsantrasyonlarını belirlemek standart çözüm konsantrasyonlarını ve nitrit yerine ölçülen yoğunluk sonuçları, total protein ölçmek için tarif edildiği gibi cihazı kullanmak ve urobi için2. adımda inşa modellerin denklem içine linogen deneyleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz başarıyla hidrofil (iç kısım) ile karakterize piyasada mevcut temizlik pamuk ve hidrofobik (dış kısım) özellikleri (Şekil 1A) kullanarak pamuk bazlı analitik cihazların geliştirilmesini göstermiştir. 3 temas açısı ölçüm sonuçlarını göstermektedir. Dış pamuk hidrofobik arayüzü 127,35 ° ± 4.73 ° idi. (Şekil 2F) analizleri kullanıcı dostu bir bakış açısıyla, burada kullanılan kolorimetrik analizler doğrudan çıplak gözle görülebiliyor ve daha fazla renk yoğunluğu ile ölçülebilir. Normal bir kişide idrar total protein az 150 mg / dl (4 iM) olmalıdır. İdrar nitrit algılama analitik hassasiyet mümkün olduğu kadar düşük olması gerekmektedir, böylece, bir analitik cihaz geliştirilmesi konusunda idrar nitrit iyonu değeri, idrar kanalı enfeksiyonlarının ya da bakteriyel enfeksiyonlar ile ilişkilinitrit deneyi. Ürobilinojen dışkı ile atılır ve enterohepatik dolaşıma tarafından kurtarıldı, ancak urobilinogen bazı seviyeleri, yaklaşık 1 olduğu - 4 mg / gün, idrar Şekil 4A bulunabilir -. C Her deney için standart eğrileri oluşturmak için çabalarımız sonuçlarını göstermektedir hedef. Bu standart eğriler ortalama kolorimetrik yoğunluk sonuçlarını inceleyerek ve biz kurduk standart konsantrasyonlarının konsantrasyonları ile karşılaştırarak kuruldu. Bu bize her bir deney için tespitlerde (LODs) limitini değerlendirmek için izin verdi. tampon sistemlerinde nitrit, BSA ve urobilinogen için LODs sırasıyla 0.147 mM 3.672 uM ve 4,861 mg / L idi. Bu aynı zamanda bilinmeyen çözümleri nitrit, BSA ve urobilinogen konsantrasyonlarının belirlenmesi için matematiksel bir çerçeve sağladı.
Şekil 1 >. Şematik Pamuk temelli Analitik Cihaz diyagramı. Üst ve kesit görünümü görüntüleri her test pedi (0.5 cm çapında) ve pamuk tabanlı bir aygıt (1 cm genişliğinde x 5.5 cm uzunluğunda) boyutlarını ortaya. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Pamuk temelli Analitik Cihaz, Örnekleme ve Sonuçlar Analizi Şekil 2. Fabrikasyon Süreci. (A) bir kağıt kesici belirtilen boyuta temizlik pamuk parçalarını kesmek için kullanılmıştır. (B) kalem laminasyon için yerleri işaretlemek için kullanılan montaj film delik. (C), bir laminar ısıtılarak laminasyon filmi, iki tabaka arasında sandviç düzeneği kullanılmıştır. (D) (F) Ürobilinojen BSA. Test pedleri pamuk cihaz üzerine monte edilmiştir (E). kesilmiştir, ve nitrit deneyler eden pamuk bazlı analiz cihazı ile gerçekleştirilmiştir. (G) Görüntüleri sonuçlarının bir tarayıcı kullanarak bir bilgisayara yapılan ve ithal edildi. (H) Görüntü analiz yazılımı gri skala kontrast durum analizi görüntüleri analiz etmek için kullanıldı. (I) elde edilen yoğunluk sonuçları bir standart eğri içine monte edildi. tıklayınız burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 3. Temas Açısı pamuk dış üzerine düştü Temizleyici Pamuk. DI su (1 ul) için sonuçlarHidrofobik katman temas açısını belirlemek için.
Pamuk tabanlı analitik Cihaz üzerinde Nitrit, ürobilinoken ve BSA için Şekil 4. Analiz Sonuçları. (A) nitrit (,156-2,5 mM), (B) BSA (1,875-30 uM), (C) ürobilinojen (standart eğrileri . 7,8-125 mcM) her bir konsantrasyon için, testler üçer kez yapılmış ve eğri uydurma R 2 değerleri nitrit vardı: BSA 0.99: 0.98, ve ürobilinojen: 0.95. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol kritik adım ve filtre kağıdı (kromatografisi filtre kağıdı veya kantitatif filtre kağıdı) (hidrofobiklik / hidrofiliklik değişen) pamuklu malzeme uygun kombinasyonunu belirlemek dahildir. İyi planlanmış ve idam cihaz tasarımı en iyi performansı kolorimetrik deneyleri için niteliklerini vermektedir. Bizim kolorimetrik tahlil sonuçlarından, burada sunulan pamuk bazlı analitik cihaz birden hastalık tespiti için bir platform olarak büyük bir potansiyele gösteriyor.
En güncel yanal akış-baz ürünler (örneğin., Gebelik testi) 14 functon tek bir tahlil daha fazla sağlar. Bazı çubuğu testleri çoklu-biyomarker deneyleri 15 gerçekleştirirken tahlil reaktifler doğrudan test örnekleri temas, çünkü bunların kullanımı teminat örnek kontaminasyon riskini taşır. Bizim cihaz bu engeli aşar ve tek bir yan akım olarak kanal cihazında birden fazla kolorimetrik tahlilleri uygulamak için kullanılabilir.
Bu yöntem, yalnızca hedef analit molekül boyutu ile sınırlıdır. Nitrit R2 ve LOD değerler cihazlar düşük moleküler analiz 5 (Şekil 4) için daha uygun olduğunu öne sürerek, diğer tahliller (BSA ve ürobilinojen) olanlar, çok daha fazladır.
Bazı ileri optimizasyon hala klinik pratikte bu cihazın pratikliğini geliştirmek amacıyla gerekli olabilir. Uzun süreler boyunca dış ortama maruz kaldığında bu optimizasyon tahlil belirteçlerinden güvenilirliğini ve stabilitesini arttırmak içerir. Bununla birlikte, bu buluş, hızlı ve doğru bir analiz ve bulaşıcı uygun takip analizi için ihtiyaçlarını yerine getirmek için, özellikle ilgili olarak, güvenilir bir şekilde, klinik uygulamada kullanılabilecek, düşük maliyetli, analitik cihazların geliştirilmesinde bir belirleyici ve değerli bir gedik sağladığına inanıyoruz ve bulaşıcı hastalıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Tayvan Bakanlığı'ndan hibe tarafından kısmen desteklenmiştir (EN 104-2628-e-007-001-My3 (CMC)), ve Taichung Gaziler General Hospital (TCVGH-1056904C (MYH)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| nitrite | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| urobilinogen | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| citrate | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| tetrabromophenol blue | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| sulfanilamide | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| citric acid | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(Dimethylamine)benzaldehyde | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| Methyl Red sodium salt | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| Bromothyle blue | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| Shiseido Cleansing Cotton | Shiseido, Japan | No. 79014 | |
| chromatography paper | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| plastic substrate | lamination film, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| scanner | microtek scanmaker | i2400 | |
| paper cutter | Life paper cutter | No.306 | |
| laminator | AURORA | LM4231H | |
| laminator film | UNI LAMI | 4A |
References
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105 (2011).
- Lin, S., et al.
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R.
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
