Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

doi: 10.3791/53495 Published: January 5, 2016

Abstract

Exosomes هي حويصلات صغيرة يتراوح حجمها ما بين 30 نانومتر إلى 100 نانومتر التي تم إصدارها على حد سواء بشكل جوهري وعلى التحفيز من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وهي توجد في عدد من السوائل البيولوجية ومعروفة لتنفيذ مجموعة متنوعة من البروتينات، والدهون، وجزيئات الحمض النووي. كان يعتقد في البداية أن يكون قليلا أكثر من الخزانات لالحطام الخلوي، وأعرب عن تقديره للأدوار exosomes تنظيم العمليات الحيوية والأمراض على نحو متزايد.

وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلوي والسوائل البيولوجية. ونظرا لصغر حجمها ومنخفض الكثافة، والفرق تنبيذ فائق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة. ومع ذلك، البلازما من HIV-1 الأفراد المصابين يحتوي على كل exosomes والجسيمات الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية، والتي تتشابه في الحجم والكثافة. وهكذا، كان الفصل الفعال للexosomes من فيروس نقص المناعة البشرية الجسيمات الفيروسية في البلازما البشريةتحدي.

لمعالجة هذا القيد، وضعنا إجراء تعديل من Cantin وآخرون. آل.، 2008 لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية. استخدمت Iodixanol تدرجات السرعة للفصل exosomes من HIV-1 الجزيئات في البلازما من HIV-1 الأفراد إيجابي. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA. وقد تم تحديد Exosomes على أساس علامات exosome أستيل (أستيلكولينستراز)، والمضادات CD9، CD63، CD45 و. أسفرت إجراءات متدرجة لدينا الاستعدادات exosome خالية من جزيئات الفيروس. تنقية فعالة من exosomes من البلازما البشرية مكنتنا من فحص محتوى exosomes المشتقة من البلازما وللتحقيق إمكاناتهم تغييري المناعة ووظائف بيولوجية أخرى.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لا يزال وباء HIV-1 أن يكون لها تأثير كبير في جميع أنحاء العالم. اعتبارا من عام 2013، ما يقرب من 35 مليون شخص في العالم يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، وكانت 2.1 مليون من هؤلاء الأفراد المصابين حديثا 1. وكانت استراتيجيات الوقاية وزيادة فرص الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية مفيدة في الحد من الاستحواذ الكلي لفيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، السكان الفردية لا تزال تعاني من ارتفاع في اكتساب HIV 1. وبالتالي، هناك ضرورة استمرار الجهود المبذولة لمعالجة هذا الوباء.

واحدة من أقوى تنبئ تطور المرض فيروس نقص المناعة البشرية هو تنشيط جهاز المناعة المزمن (CIA) 10/02. التي تحددها مستويات عالية باستمرار السيتوكينات يمكن اكتشافها وعلامات التعبير مرتفعة على سطح الخلايا الليمفاوية T، وقد نسبت وكالة المخابرات المركزية إلى: ط) المستمر انتاج الخلايا الجذعية من النوع الأول الإنترفيرون 11؛ (ب) تنشيط جهاز المناعة المباشر مدفوعا بروتينات فيروس نقص المناعة البشرية تات، نيف وgp120 12؛ (ج) النبات من البروتينات البكتيرية في الأمعاء المرتبطة الخلايا المناعية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة (ق) الكامنة المزمنة، تنشيط جهاز المناعة النظامية في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية لا يزال يتعين توضح تماما.

وقد أظهرت مجموعتنا البحثية وغيرها من دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية 15-18. وقد قررت مجموعتنا أن البروتين نيف يفرز من الخلايا المصابة في exosomes 15، وexosomal نيف (exNef) موجود في البلازما من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية على المستويين نانوغرام 18. لقد أثبتنا أن المارة أدت CD4 + T-الخلايا المعرضة لexNef في الناجم عن تنشيط الخلايا الموت تعتمد على مسار CXCR4 19، 20. بدلا من ذلك، كانت الوحيدات / الضامة الحرارية إلى موت الخلايا المبرمج exNef التي يسببها، ولكن عرضت الوظائف الخلوية المعدلة وخلوى التعبير. exosomes وفي الآونة الأخيرة، وقد أظهرت مجموعتنا معزولة من بلازما الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية تحتوي على مجموعة متنوعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات. فوrther، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية ساذجة تتعرض لexosomes المشتقة من البلازما من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية الناجمة عن التعبير عن CD38 على خلايا الذاكرة من السذاجة ووسط CD4 + CD8 + T و. هذا من المرجح أن يساهم في الالتهابات الفيروسية ونشر عن طريق تنشيط الخلايا المارة 21، ويشير إلى أن exosomes تلعب دورا هاما في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية.

في التحقيق في دور exosomes في التسبب فيروس نقص المناعة البشرية، يتمثل أحد التحديات هو تطوير تقنيات لexosomes منفصلة بكفاءة من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية مع الحفاظ على المحتوى exosomal فضلا عن قدرتها الوظيفية تغييري المناعية. وقد وصفت عدة طرق لعزل exosomes من زراعة الخلايا والسوائل البيولوجية 22،23. بسبب صغر حجمها وانخفاض الكثافة (exosomes تطفو في كثافة 1،15-1،19 ز / مل)، تنبيذ فائق الفرق و / أو الترشيح الفائق هي التقنيات الأكثر شيوعا لexosome العزلة 23.ومع ذلك، بفيروس نقص المناعة البشرية supernatants زراعة الخلايا والبلازما المرضى تحتوي على كل exosomes وHIV-1 الجسيمات الفيروسية. Exosomes وHIV-1 الجسيمات متشابهة جدا من حيث الحجم والكثافة. بدلا من ذلك، والاستفادة من التعبير عن علامات exosomal فريدة من نوعها مثل CD63، CD45، CD81 و، وتم عزل exosomes باستخدام طرق أسر immunoaffinity 23. هذا الإجراء يمكن أن تفصل الفيروس من exosomes. ومع ذلك، فإن عيوب هذه التقنية هو مرفق ضيق من الأجسام المضادة للexosomes النقاء، والتي يمكن أن تتداخل مع تقييم القدرة المناعية للexosomes في الثقافة.

لمعالجة هذه القيود، وضعنا الداخلي لتنقية exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية المعدلة من Cantin وزملاء العمل 22 باستخدام Iodixanol تدرجات السرعة. تم العثور على Exosomes للفصل في منخفض الكثافة / الكسور العليا من التدرجات iodixanol، في حين أن جزيئات الفيروس قد فصلت في عاليةالكثافة / أقل الكسور. وقد تم تحديد جزيئات الفيروس عن طريق P24 ELISA وتم تحديد exosomes باستخدام علامات exosome اشي CD9، CD63، CD45 و. العلوي الكسور منخفض الكثافة جمعت الواردة exosomes التي كانت سلبية للتلوث HIV-1 P24. تنقية فعالة وفصل exosomes من جزيئات فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما البشرية يسمح للفحص دقيق لمحتوى exosomes المشتقة من البلازما البشرية فضلا عن التحقيق في إمكاناتهم تغييري المناعية والقيمة التشخيصية والنذير من exosomes في HIV-1 المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد المخطط العام لإجراء العزل exosome والتنقية في الشكل 1. تم الحصول على الدم الكامل من المتبرعين الصحية والمقدمة من الأفراد المصابين بالفيروس لا يتلقون theraoy المضاد للفيروسات القهقرية حضور عيادة الأمل من جامعة إيموري وبرنامج الأمراض المعدية من النظام الصحي جرادي في اتلانتا، جورجيا. وافقت هذه الدراسة من قبل مجالس المراجعة المؤسسية للجامعة إيموري وكلية مورهاوس في كلية الطب. جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة أعطى كتابة والموافقة المستنيرة.

1. إعداد Exosomes من بلازما الدم

  1. جمع الدم البشري وتجهيز
    1. جمع 10 مل من الدم المحيطي من قبل بزل الوريد في أنابيب جمع الدم EDTA (التي تحتوي على 18 ملغ البوتاسيوم EDTA)، وعكس بلطف خمس مرات لخلط.
    2. أجهزة الطرد المركزي أنابيب جمع الدم في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في RT لتكوير خلايا الدم. استخدام الماصة العقيمةالشركة المصرية للاتصالات لنقل جزء البلازما (4-5 مل) إلى 25 مل أنبوب مخروطي الشكل. تمييع البلازما مع 10 مل من 1 X PBS. تجاهل خلايا الدم (خلايا الدم الحمراء والخلايا البيضاء، والمعروف أيضا باسم PBMC) في وعاء ملحوظة بشكل مناسب للنفايات بيولوجية.
      ملاحظة: في حالة غير المصابة عينات الدم المانحة وPBMC يمكن محفوظة لاستخدامها مرة أخرى (انظر الإجراء IV.2 أدناه).
    3. تخزين عينات البلازما في 4 درجة مئوية لمدة قصيرة المدى (2-3 أيام) أو في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
      ملاحظة: جلب أي عينات البلازما المجمدة إلى 4 درجة مئوية قبل مزيد من المعالجة.
  2. إعداد Exosome جزء من البلازما
    1. البلازما أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الحطام الخلوي. استخدام ماصة المصلية العقيمة لنقل طاف البلازما مسح لتنظيف 25 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة. تجاهل بيليه في حاوية واقية.
    2. أجهزة الطرد المركزي البلازما مسح في 100،000 x ج لمدة 2ساعة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحويصلات الكبيرة. إزالة طاف 100،000 x ج بعناية من قبل pipetting، وتجاهل في نفايات بيولوجية. resuspend الكرية 100،000 x ج في 1 مل من 1X PBS في أنبوب نظيفة واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة، يحوم بلطف لإزاحة والجسيمات منفصلة.
    3. غسل علقت 100،000 x ج بيليه exosome / فيروس بإضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني. عكس بلطف أنبوب خمس مرات لخلط، ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 100،000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. تجاهل الحل يغسل PBS في حاوية نفايات بيولوجية.
    4. resuspend الكرية 100،000 x ج في 1 مل من 1 X PBS واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة يحوم بلطف لإزاحة وحل بيليه.
      ملاحظة: إذا لم يكن من الممكن الانتقال مباشرة إلى الخطوة التدرج iodixanol، تخزين بيليه، تحتوي على exosomes وجزيئات الفيروس، في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام حتى الخطوة iodixanol التدرج.

2. تنقية Exosomes

  1. توليد 6٪ -18٪ velocالتدرجات إيتي من iodixanol باستخدام-غرفة مزدوجة التدرج الجهاز السابق.
    1. إعداد 6٪ و 18٪ حلول كاشف iodixanol، كما زودت حل 60٪ في المياه، من خلال التخفيف في برنامج تلفزيوني. الماصة 5،5 مل من محلول 18٪ الى غرفة أثار، والماصة 5،5 مل من محلول 6٪ الى غرفة الخزان. بدوره على النمام، وفتح محبس، والسماح لكل التدرج في التدفق إلى أنبوب نابذة 14 مل.
      ملاحظة: إما استخدامها على الفور أو تخزين مستعدة التدرجات O / N عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
    2. طبقة بعناية 1 مل من محلول exosome / فيروس على الجزء العلوي من كل 11 مل التدرج. التدرجات الطرد المركزي في 250000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية، وذلك باستخدام SW40Ti دلو يتأرجح الدوار.
    3. تسمية اثني عشر (12) 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إزالة 1.0 مل من أعلى التدرج ونقل إلى أنبوب # 1. نقل ما تبقى من كسور 1ML لأنابيب 12/02 في ترتيب تسلسلي.
      ملاحظة: وبالتالي سوف يكون جزء العلوي رقم 1، جزء السفلي، رقم 12. سانتخام الكسور التدرج في 4 درجات مئوية. وexosomes النقاء، التي ينبغي أن تكون في الكسور 1-3 في الجزء العلوي من التدرج، مستقرة لمدة 3-4 أسابيع عند تخزينها في 4 درجات مئوية.

3. Exosome توصيف

  1. أستيل (أستيلكولينستراز) نشاط الفحص
    1. إعداد 100 ملي الأسهم الركيزة عن طريق خلط acetylthiocholine يوديد 28.9 ملغ في 1 مل من 1X PBS. متجر الأسهم الركيزة في -20 ° C إلى 1 شهر.
    2. إعداد 10 ملي الأسهم مؤشر اللون عن طريق خلط البنزويك حمض 39.6mg وبيكربونات الصوديوم 15 ملغ في 10 مل من 1X PBS. مخزن الأوراق المالية مؤشر اللون في 4 ° C تصل إلى أسبوعين.
    3. إعداد الفحص الكاشف عن طريق خلط 1X PBS، الركيزة، ومؤشر اللون في نسبة 100: 2: 5 (على سبيل المثال، 10 مل 1X PBS + 200 ميكرولتر الركيزة + 500 ميكرولتر مؤشر اللون).
    4. نقل 50 ميكرولتر من كل 1.5 مل التدرج أنبوب جزء (المسمى 12/1، من III.3 الداخلي) إلى الآبار لmicrotite 96-جيدالوحة ص. إعداد الآبار مكررة لكل عينة التدرج.
    5. إعداد مجموعة من المعايير بجعل أول مخزون μU / مل أستيلكولينستراز 2000 في برنامج تلفزيوني. جعل أحد عشر (11) 2-أضعاف التخفيفات المسلسل من هذا المخزون وإضافة 50 ميكرولتر من كل تخفيف في بئر واحدة لوحة microtiter، بحيث القياسية # 1 = 2000 μU / مل، رقم 2 = 1000 μU / مل، رقم 3 = 500 μU / مل، الخ حتى رقم 12 = 0.98 μU / مل. فإن المعايير أستيل كولينستراز اثني عشر بالتالي تشغل صف واحد من لوحة فحص 96-جيدا.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من خليط الفحص الكاشف إلى كل بئر واحتضان 20 دقيقة (في الظلام) في RT للسماح تطوير المنتج مادة ملونة. قياس النشاط أستيلكولينستراز عند طول موجي 450 نانومتر من استخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت.
      ملاحظة: يتم تقييم نسبة ابتداء من المواد المتبقية بعد تنقية exosome بواسطة أستيل كولينستراز فحص للبلازما غير المجزأ.
  2. تحليل طخة مناعية
    1. البروتينات منفصلة في الكسور التدرج 1-12 (من procedلدى عودتهم 2.1.3) من خلال SDS-PAGE على 4-20٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك المواد الهلامية مسبقة الصنع في 100V × 1 ساعة. نقل البروتينات في الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام خلية نقل-النشاف الكهربائية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. السماح للنقل لطخة ل12-16 ساعة (O / N) في 350V.
    2. إزالة غشاء من جهاز النشاف ويغسل في تريس مخزنة المالحة (TBS) لمدة 5 دقائق. منع مع 5٪ الحليب الخالي في TTBS (TBS مع توين 20 0.1٪) لمدة 1 ساعة عن طريق هز في RT.
    3. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية محددة لexosomes (CD9، CD45، CD63) أو HIV-1 البروتين قفيصة (P24) في 5٪ الحليب الخالي مع اهتزاز عند 4 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة (O / N). التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية لimmunoblots تتراوح من 1: 2000 -1: 5000.
    4. غسل وصمة عار في TTBS لمدة 20 دقيقة، تليها الحضانة مع 1: 2000 تخفيف من الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugated المضادة للمفتش (الأجسام المضادة الثانوية)، في 5٪ الحليب الخالي لمدة 1 ساعة على RT. غسل وصمة عار 3 مرات مع TTBS، 10 دقيقة لكل يغسل.
    5. حفظ الصور على هيئة ملفات TIFF التي يمكن الاطلاع عليها في أدوبي فوتوشوب. إجراء تحليل كثافة من عصابات باستخدام برنامج يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD).
  3. خلوى الفحص
    1. قبل الفحص خلوى، وتعطيل المركبات المناعية التي عادة ما تكون موجودة في البلازما البشرية عن طريق التفكك الحمضي وليز exosomes عن طريق العلاج المنظفات. فحص على حد سواء بدءا عينات البلازما والاستعدادات exosome تنقيته.
      1. 100 ميكرولتر من البلازما البشرية إضافة 100 ميكرولتر 0.33 N HCL واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إضافة 100 ميكرولتر 0.33 N هيدروكسيد الصوديوم لتحييد البلازما حمض المعالجة. إضافة تريتون X-100 إلى كل من البلازما تحييد وexosome النقاء عينات، لفايتركيز نال من 1٪، ليسبب تحلل من exosomes.
    2. لهذا الاختبار (إجراء المستندة إلى حبة فلوري)، استخدام الخرز المغناطيسي قبل المغلفة مع الأجسام المضادة من قبل الشركة المصنعة. استخدام لوحة مصمم خصيصا للخلوى حبات المغلفة المضادة للأجسام المضادة الإنسان؛ المدرجة في الجدول 1. دوامة حبات المغلفة الأضداد المغناطيسية من فحص عدة خلوى لمدة 30 ثانية، وإضافة 50 حبات ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة 96-جيدا لاستخدامها في فحص.
    3. إعداد سلسلة التخفيف من المعايير في المخزن مستوى البلازما (سواء الواردة في فحص عدة خلوى) كما هو موضح في دليل التعليمات لفحص عدة خلوى، لإنشاء منحنى 8 نقطة القياسي.
    4. إضافة 150 ميكرولتر من 1X العازلة يغسل (من مجموعة) إلى كل بئر وتغسل حبات باستخدام حبة غسالة المغناطيسي، كما هو موضح في الدليل. إضافة 25 ميكرولتر العازلة فحص البلازما (من مجموعة) إلى كل بئر. إضافة 25 ميكرولتر من المعايير وعينات لجميع الآبار المستخدمة في الفحص. إضافة 25 ميكرولتر من البلازماعينة عازلة لآبار المراقبة السلبية. ختم ويهز لوحة في 700 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في RT واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    5. إضافة 150 ميكرولتر من 1X غسل العازلة إلى كل بئر وغسل لوحة (كما في الخطوة 3.3.4 أعلاه). إضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة كشف في كل بئر، وختم ويهز لوحة في 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT. كرر الخطوة الغسيل.
    6. إضافة 50 ميكرولتر من الحل streptavidin (SAPE، من عدة) في كل بئر، وختم ويهز لوحة في 700 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT. يغسل وحة كرر كما هو الحال في 3.3.4.
    7. إضافة 120 ميكرولتر من العازلة القراءة (من مجموعة) في كل بئر ويهز على مختبر الطاولة شاكر في 700 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على RT للسماح للإشارة الفلورسنت لتطوير. قراءة لوحة على قارئ لوحة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    8. من أجل لحساب كمية exosomes المفقود خلال إجراء العزل، استخدم المعادلة التالية: [(القراءة الأصلي / حجم البلازما) × 66.6 = القراءة خلوى تعديل].

4. الفحص عن إمكانية المناعية

  1. إعداد الثقافة المتوسطة مع Exosome المنضب مصل بقري جنيني
    1. الطرد المركزي 500 مل من مصل بقري جنيني (FBS) في 100،000 x ج لمدة 20 ساعة في 4 درجات مئوية لتكوير تلويث exosomes وmicrovesicles. إزالة بعناية وحفظ المنضب exosome FBS طاف. تجاهل بيليه في نفايات بيولوجية.
    2. الجمع بين 20٪ للالمنضب exosome FBS طاف مع 500 مل من روزويل معهد الحديقة التذكارية 1640 (RPMI 1640) متوسطة. تصفية المتوسطة من خلال مرشح غشاء 0.45 ميكرون.
    3. إضافة الستربتومايسين (100 U / مل)، البنسلين (100 U / مل)، L-الجلوتامين (2 ملم)، محلول ملحي HEPES مخزنة (10 ميكرون)، وIL-2 (20 U / مل) إلى المتوسطة التي تمت تصفيتها.
  2. الثقافة الخلية وExosome التعرض
    1. فضح exosomes إلى الخلايا المانحة الطرفية الدم وحيدات النوى (PBMC) تم الحصول عليها من المتطوعين عيادة صحية. تعليق PBMC فيإعداد مستنبت وعد الخلايا باستخدام عداد الخلية / الجسيمات (وفقا لأسلوب الشركة المصنعة قياسي).
      ملاحظة: يتم الحصول على PBMC أثناء إعداد البلازما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.2).
    2. باستخدام استعداد المتوسطة من إجراء 4.1.3، وشارك في ثقافة 3.0 × 10 6 (PBMC) مع 1 ميكروغرام / مل من exosomes مجمعة من ثلاث (3) HIV-1 مصاب بالفيروس أو من ثلاث (3) 1 فيروس نقص المناعة البشرية أفراد سلبيين في ما مجموعه حجم 1 مل في الآبار لوحة ثقافة 12-جيدا (مع غطاء). احتضان الثقافات لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية.
    3. إعداد الثقافات PBMC غير المعالجة والثقافات تعامل مع كونكانافالين A (كون A؛ 5 ميكروغرام / مل) لخدمة الضوابط سلبية وإيجابية، على التوالي، كما هو موضح أعلاه (4.2.2). احتضان جميع الثقافات PBMC لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية.
    4. مباشرة قبل حصاد الخلايا، وإعداد التخفيفات من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة تألقي مترافق التالية: فلور اليكسا 700 المسمى مكافحة CD3 (1: 400 تمييع)، allophycocyعنين (APC) / cyanine 7 (Cy7) -labeled مكافحة CD4 (1: 400)، peridinin البروتين الكلوروفيل مكافحة CD4 (1: 400) المسمى المجمع، وصفت V450 مكافحة CD8 (1: 400)، biotin- وصفت لمكافحة CD45RA (1: 1000)، فيكوإيريترين (PE) / Cy7 المسمى مكافحة CD62L (1: 1000)، / cyanine 5 (Cy5) -labeled PE مكافحة CD38 (1: 200)، PE-تكساس الأحمر- وصفت لمكافحة streptavidin (1: 2000)، وPE / Cy5 المسمى الماوس IgG1K isotype السيطرة (1: 200).
    5. بعد فترة الحضانة 48 ساعة، حصاد PBMC. غسل PBMC في برنامج تلفزيوني لإزالة exosomes وصمة عار على الخلايا عن طريق الحضانة ل1hr في 4 درجات مئوية مع الفردية الأجسام المضادة الموسومة تألقي. تحليل PBMC الملون التدفق الخلوي لقياس التعبير عن كيموكينات (كما هو موضح 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وطهروا بكفاءة Exosomes من HIV-1 البلازما البشرية إيجابي. exosomes معزولة، التي حددها أستيل (أستيلكولينستراز) النشاط، مفصولة في أقل كثافة الكسور 1-3 في الجزء العلوي من التدرجات iodixanol، في حين أن جزيئات الفيروس، التي حددها HIV-1 مستضد P24 ، فصل في الكسور ذات الكثافة السكانية العالية (10-12، بالقرب من القاع). وأكد وجود exosomes مزيدا من تحديد طخة مناعية من علامات exosome اشي CD9، CD45، CD63 و، وبواسطة المجهر الإلكتروني (الشكل 2).

وترتبط السيتوكينات الموالية للالتهابات وكيموكينات مع ومرتفعة بشكل ملحوظ في exosomes من HIV-1 الأفراد مصليا. exosomes تنقية والبلازما غير المجزأ من HIV-1 المصابين وتم تحليل HIV-1 أفراد سلبيين لمدة 21 السيتوكينات / كيموكينات عن طريق فحص متعددة. كل 21 السيتوكينات / الكيماوي تم الكشف عن kines في exosomes معزولة عن HIV-1 الأفراد إيجابي. بالإضافة إلى ذلك، تم مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع البلازما وexosomes من HIV-1 الضوابط سلبيين (الجدول 1).

وزادت CD38 التعبير على سطح الخلايا المعرضة لexosomes من HIV-1 الأفراد مصليا. تعرضت PBMCs من المانحين الإنسان غير المصابة لمدة 48 ساعة إلى exosomes المجمعة من HIV-1 مصليا أو أفراد سلبيين وتقييم لمستويات CD38 تنشيط علامة على CD4 + CD8 + T والخلايا عن طريق التدفق الخلوي. لاحظنا ذلك من خلال 48 ساعة بعد التعرض، CD38 التعبير على سطح الذاكرة السذاجة ووسط الخلايا CD4 + وCD8 + T كانت مرتفعة بشكل ملحوظ في T-الخلايا المعرضة لexosomes من 1 فيروس نقص المناعة البشرية الأفراد إيجابي مقارنة مع العلاج exosome بفيروس نقص المناعة البشرية السلبية وغير المعالجة ضوابط (الشكل 3).

ضمن صفحة = "1"> الشكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي من exosome بمعزل عن HIV-1 البلازما البشرية إيجابي. (A) تم جمع 10 مل من الدم المحيطي من HIV-1 seropositve والأفراد سلبيين. تم طرد (B) أنابيب جمع الدم EDTA في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في RT. ونقلت (C) مطلق البلازما إلى 50 مل أنابيب مخروطية والمخففة ½ مع برنامج تلفزيوني 1X و (D) طرد 10000 x ج لمدة 30 دقيقة. (E) تم نقل طاف لأنابيب نابذة فائقة السرعة و(F) طرد في 10000 x ج لمدة 2 ساعة. تم تجاهل (G، H) وطاف وبيليه exosome إعادة علقت وغسلها في 1 مل من 1X PBS. (I) بعد الطرد المركزي، تم تجاهل وطاف بيليه إعادة علقت في 1ML برنامج تلفزيوني 1X ومضافين على 6-18٪ التدرج iodixanol السرعة و(J) طرد على 250،000 x ج لمدة 2 ساعة. (K) بعد الطرد المركزي، وكانت 1 مل الكسور من أعلى إلى أسفل التدرج هيئة تنظيم الاتصالاتnsferred إلى 1.5 مل أنابيب وتحليلها لمحتوى أستيلكولينستراز وتحليل طخة مناعية. (L) الكسور 2 وكانت 3 من الجمع بين وتضعف مع 4 مل من 1X PBS و (M) طرد على 400،000 x ج لمدة 2 ساعة. (N) بعد الطرد المركزي، تم تجاهل وطاف بيليه إعادة علقت في 1 مل من 1X PBS لتحليل الموالية للالتهابات خلوى وchemokine التعبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
يتم تنقيته الشكل 2. Exosomes بكفاءة من البلازما البشرية. iodixanol الفردي الكسور سرعة التدرج من الأفراد بفيروس نقص المناعة البشرية مصليا أو سلبيين تعرضوا لل(A) فحص الأنزيمية للأستيل (أستيلكولينستراز)، و (ب) تحليل لطخة غربية لعلامات exosomal CD9، CD45، وCD63 والفيروسية P24 البروتين وكانت (C) immunolabeled مع مكافحة CD63 ودرست مع المجهر الإلكتروني لتأكيد إعداد exosomes المنقى (C). (الشكل من كونادو وآخرون، 2014 21، وتستخدم بإذن). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
فيروس نقص المناعة البشرية 1 تعرضت الشكل 3. الفحص عن إمكانية المناعية. PBMCs من أفراد سلبيين إما exosomes المجمعة من البلازما من HIV-1 مصاب بالفيروس (HIV + إكسو) أو سلبيين (بفيروس نقص المناعة البشرية إكسو) فردا، تركت دون علاج، أو تعامل مع 5 ميكروغرام / مل من كونكانافالين A (كون A) كعنصر تحكم إيجابية. بعد 48 ساعة من التعرض، ساذجة (CD45RA + / CD62L +)، الوسطى (TCM؛ CD45RA- / CD62L +) والمستجيب (TEM؛ CD45RA- / CD62L-) ذاكرة CD4 + و وقد تم تحليل CD8 + T-خلايا لCD38 التعبير التدفق الخلوي. تم تطبيع تركيز Exosome بواسطة البروتين الكلي، وأضاف في 1 ميكروغرام / مل. أشرطة الخطأ تمثل يعني +/- SEM ستة المانحين مستقلة. تم اختبار الفرق بين مجموعات لدلالة إحصائية به على الصراط ANOVA اختبار واحد. * ف <0.05، ** p <0.01 *** P <0.001، **** ف <0.0001. (الشكل من كونادو وآخرون، 2014 21، مستخدمة بإذن). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
جدول تحليل 1. من exosomes تنقيته والبلازما كله من HIV-1 مصليا والأفراد سلبيين لخلوى المؤيدة للالتهابات وchemokine التعبير. P <0.05، ** p <0.01 *** P <0.001، **** ف <0.0001. (الشكل من كونادو وآخرون، 2014 21، وتستخدم بإذن). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنشيط المناعة المزمن (CIA) وCD4 + T استنزاف خلية نوعان من السمات الهامة المميزة للعدوى HIV-1. وقد أنشئت على أنها تنبئ عن المرضية، مع CIA كونه أفضل تنبؤ. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء القيادة تنشيط جهاز المناعة النظامية المزمن وانخفاض خلايا CD4 + T تزال لم توضح تماما. نحن ومختبرات أخرى قد وضعت دليلا راسخا على أن exosomes يفرز من HIV-1 الخلايا المصابة تلعب دورا في كل من بصمات.

وقد أدى استمرار اهتمام في كل من تركيب ووظيفة الحويصلات خارج الخلية إلى نشر طرق مختلفة لexosome بمعزل عن وسائل الاعلام في زراعة الخلايا والسوائل البيولوجية 24-26. ومع ذلك، فقد شكلت عائقا أمام التحقيق في دور exosomes في HIV-1 المرضية الفصل الفعال للexosomes من HIV-1 الجسيمات مع الحفاظ على القدرة على تحقيق كل من المحتوى exosome والنشاط الوظيفي. قمنا بتطوير بروتوالعقيد لتنقية exosomes من HIV-1 الجزيئات في البلازما البشرية، وذلك باستخدام التدرجات iodixanol السرعة. وكانت الجهات المانحة بفيروس نقص المناعة البشرية المستخدمة في هذه الدراسة لم تتلق العلاج المضاد للفيروسات وعينات البلازما المستخدمة في هذه التجارب الواردة من 1500 إلى 400،000 جزيئات الفيروس / مل بمعدل 206،000 جزيئات الفيروس / مل 21. وبالتالي، علينا أن نبرهن على exosomes في بلازما HIV-1 الأفراد المصابين يمكن فصلها بكفاءة من جزيئات فيروس HIV-1، حتى عند تحميل الفيروس مرتفعة. على الرغم من تماثل في حجمها وكثافتها، ومفصول exosomes في الكسور منخفض الكثافة / العليا من التدرجات iodixanol بالمقارنة مع الجسيمات الفيروسية، التي تعاني من التمييز في كثافة عالية / منخفضة الكسور. وexosomes بواسطة الأسلوب iodixanol التدرج أعد هي العالية النقاء وخالية من تلويث البروتينات خارج الخلية. وأكد على نقاء السكان exosomes معزولة باستخدام P24 ELISA وتحليل لطخة غربية لHIV-1 P24 البروتين قفيصةفضلا عن التحليل الغربي للعلامات exosomal، آلام، CD9، CD45، CD63 و. استخدام هذه العلامات يتسق مع المبادئ التوجيهية التي نشرت مؤخرا لتحديد exosome 27.

أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لتنشيط جهاز المناعة، عثر على exosomes النقاء من HIV-1 المصابين لاحتواء السيتوكينات / كيموكينات بتركيزات أعلى بكثير من exosomes من HIV-1 الضوابط سلبيين. وعلاوة على ذلك، exosomes من HIV-1 الأفراد المصابين كانت نشطة بيولوجيا، واظهار القدرة على إحداث زيادة مستويات علامة التنشيط، CD38، على سطح خلايا الذاكرة السذاجة ووسط CD4 + CD8 + T و. بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات إلى الآلية التي يمكن أن تدفع تنشيط جهاز المناعة المستمر خلال العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية.

كنا قادرين على الحصول على النتائج باستخدام لدينا عملية تنقية exosome، الذي يجمع بين الطرد المركزي التفاضلي وiodixanol سرعة الفصل المتدرج تظهر قيمةاستخدام exosomes العالية النقاء لاختبارات بيولوجية الفسيولوجية والوظيفية. لا يكون الإجراء بعض المخاطر والقيود. يتم فقدان قدر كبير من exosomes، غالبا ما يكون غالبية المواد ابتداء تحسب على قياسات لنشاط أستيلكولينستراز، خلال هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، هذا الإجراء هو أيضا تستغرق وقتا طويلا ويتطلب الوصول إلى معدات باهظة الثمن. وأخيرا، وتوليد التدرجات iodixanol باستخدام جهاز fromer التدرج يتطلب ممارسة كبيرة لضمان التكاثر. طريقة بديلة لتوليد التدرج قد يكون لإعداد سلسلة متدرجة من الحلول iodixanol، تليها طبقات متأنية للحلول في أنابيب الطرد المركزي واحتضان O / N للسماح للتدرجات لتشكيل. ومع ذلك، فإننا لم تختبر هذا البديل.

بروتوكول تجريبي وصفها هنا لعزل وفصل exosomes من HIV-1 الجزيئات في البلازما البشرية هو وسيلة فعالة لضمان نقاء السابقosomes. وقد أدى استخدام هذا الأسلوب لسبل مثيرة للتحقيق في المستقبل فيما يتعلق بدور exosomes في HIV-1 المرضية، ويمكن كذلك استخدامها في الاستفسارات عن العمليات البيولوجية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva Switzerland. (2013).
  2. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
  3. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
  4. Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
  5. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
  6. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
  7. Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
  8. Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
  9. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
  10. Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
  11. O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
  12. Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
  13. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  14. Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
  15. Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18, (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
  16. Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
  17. Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
  18. Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
  19. James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
  20. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
  21. Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. (2014).
  22. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
  23. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  24. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  25. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
  26. Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).More

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter