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Immunology and Infection

एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा से Exosomes का अलगाव

Published: January 5, 2016 doi: 10.3791/53495
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3,4, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Department of Medicine, Emory University School of Medicine, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine, 4Yerkes National Primate Research Center

Abstract

Exosomes सेल प्रकार की एक किस्म से दोनों अनिवार्यता और उत्तेजना पर जारी कर रहे हैं कि 30 एनएम से 100 एनएम से आकार में लेकर छोटे पुटिकाओं हैं। वे जैविक तरल पदार्थ की एक संख्या में पाए जाते हैं और प्रोटीन, वसा, और न्यूक्लिक एसिड अणुओं की एक किस्म ले जाने के लिए जाना जाता है। मूलतः सेलुलर मलबे के लिए जलाशयों से थोड़ा अधिक है, जैविक प्रक्रिया का विनियमन exosomes की और रोगों में भूमिका तेजी से सराहना कर रहे हैं होने लगा।

कई तरीकों सेलुलर संस्कृति मीडिया और जैविक तरल पदार्थ से exosomes अलग-थलग करने के लिए वर्णित किया गया है। कारण उनके छोटे आकार और कम घनत्व, अंतर ultracentrifugation और / या ultrafiltration को exosome अलगाव के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं। हालांकि, एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा आकार और घनत्व में समान हैं, जो दोनों exosomes और एचआईवी वायरल कणों, शामिल हैं। इस प्रकार, मानव प्लाज्मा में एचआईवी वायरल कणों से exosomes के कुशल जुदाई किया गया हैएक चुनौती।

इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम Cantin एट से संशोधित एक प्रक्रिया विकसित की है। अल।, मानव प्लाज्मा में एचआईवी के कणों से exosomes की शुद्धि के लिए 2008। Iodixanol वेग ढ़ाल एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा में एचआईवी -1 कणों से exosomes अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया। वायरस कणों पी 24 एलिसा द्वारा की पहचान की गई। Exosomes exosome मार्कर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के आधार (दर्द), और CD9, CD63, और CD45 एंटीजन पर पहचान की गई। हमारी ढाल प्रक्रिया वायरस कणों से मुक्त exosome तैयारियों झुकेंगे। मानव प्लाज्मा से exosomes के कुशल शुद्धि प्लाज्मा व्युत्पन्न exosomes की सामग्री की जांच करने के लिए और उनकी प्रतिरक्षा modulatory क्षमता और अन्य जैविक कार्यों की जांच करने के लिए सक्षम होना चाहिए।

Introduction

एचआईवी -1 महामारी दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है करने के लिए जारी है। 2013 के रूप में, दुनिया भर में लगभग 35 लाख लोग एचआईवी के साथ जी रहे थे, और इनमें से 2.1 लाख नव संक्रमित व्यक्तियों के एक थे। रोकथाम रणनीति और एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी तक पहुंच बढ़ाने एचआईवी के समग्र अधिग्रहण को कम करने में मददगार दिया गया है। हालांकि, व्यक्तिगत आबादी अभी भी एचआईवी 1 के अधिग्रहण में उगता सामना कर रहे हैं। इस प्रकार, इस महामारी से निपटने के लिए जारी प्रयासों के लिए एक की जरूरत है।

एचआईवी रोग प्रगति की सबसे मजबूत predictors में से एक पुरानी प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) 2-10 है। पहचाने जाने साइटोकिन्स और टी lymphocytes की सतह पर ऊंचा अभिव्यक्ति मार्करों के लगातार उच्च स्तर से परिभाषित किया, सीआईए को जिम्मेदार ठहराया गया है: मैं 11 IFN प्रकार i) निरंतर वृक्ष के समान कोशिकाओं के उत्पादन; एचआईवी प्रोटीन गूंथना, NEF और gp120 12 के द्वारा संचालित (ii) के प्रत्यक्ष प्रतिरक्षा सक्रियण; (Iiiपेट जुड़े प्रतिरक्षा कोशिकाओं 6 में बैक्टीरियल प्रोटीन का) translocation। हालांकि, सटीक व्यवस्था (एस) अंतर्निहित पुरानी, ​​एचआईवी संक्रमण में प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण पूरी तरह से स्पष्ट किया जा रह है।

हमारे शोध समूह और अन्य लोगों के एचआईवी रोगजनन 15-18 में exosomes की भूमिका का प्रदर्शन किया है। हमारे समूह Nef प्रोटीन exosomes 15 में संक्रमित कोशिकाओं से उत्सर्जित किया जाता है कि निर्धारित किया गया है, और exosomal NEF (exNef) nanogram स्तर 18 पर एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा में मौजूद है। हम वैकल्पिक रूप से, एककेंद्रकश्वेतकोशिका / मैक्रोफेज exNef-प्रेरित apoptosis को आग रोक थे। ExNef के संपर्क में सीडी 4+ टी कोशिकाओं CXCR4 मार्ग 19, 20 पर निर्भर सक्रियण प्रेरित सेल मौत हुई कि दर्शक दिखाया गया है, लेकिन बदल सेलुलर कार्यों और साइटोकाइन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है। एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा से अलग अभी हाल ही में हमारे समूह ने दिखा दिया है exosomes समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की एक किस्म के होते हैं। फूrther, भोले और केंद्रीय स्मृति सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं पर CD38 की अभिव्यक्ति प्रेरित एचआईवी संक्रमित रोगियों से प्लाज्मा व्युत्पन्न exosomes के संपर्क में भोले परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear। यह संभावना प्रणालीगत सूजन और दर्शक सेल सक्रियण 21 के माध्यम से वायरल प्रसार में योगदान देता है, और exosomes एचआईवी रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पता चलता है।

एचआईवी रोगजनन में exosomes की भूमिका की जांच में, एक चुनौती एचआईवी कणों से कुशलता से अलग exosomes exosomal सामग्री को बनाए रखते हुए साथ ही उनके कार्यात्मक प्रतिरक्षा modulatory क्षमता के लिए तकनीक विकसित कर रहा है। कई तरीकों सेल संस्कृति और जैविक तरल पदार्थ 22,23 से exosomes अलग-थलग करने के लिए वर्णित किया गया है। क्योंकि उनके छोटे आकार और कम घनत्व की (exosomes 1.15 के घनत्व पर तैरने लगते हैं - 1.19 ग्राम / एमएल), अंतर ultracentrifugation और / या ultrafiltration exosome अलगाव 23 के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं।हालांकि, एचआईवी संक्रमित कोशिका संस्कृति supernatants और मरीजों के प्लाज्मा exosomes और एचआईवी -1 वायरल कणों दोनों होते हैं। Exosomes और एचआईवी -1 कणों का आकार और घनत्व दोनों में बहुत समान हैं। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के CD63, CD45, और CD81 के रूप में अद्वितीय exosomal मार्करों की अभिव्यक्ति का लाभ लेने, exosomes immunoaffinity कब्जा तरीकों 23 उपयोग कर अलग कर दिया गया है। यह प्रक्रिया exosomes से वायरस को अलग नहीं कर सकता। हालांकि, इस तकनीक का दोष यह है कि संस्कृति में exosomes की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता के आकलन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो शुद्ध exosomes, के लिए एंटीबॉडी की तंग लगाव है।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम iodixanol वेग ढ़ाल का उपयोग एचआईवी Cantin से संशोधित मानव प्लाज्मा में कणों और सहकर्मियों के 22 से exosomes की शुद्धि के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है। वायरस कणों उच्च में अलग जबकि Exosomes, कम घनत्व में iodixanol ढ़ाल के ऊपरी / अंशों को अलग करने के लिए पाए गएघनत्व / कम अंशों। वायरस कणों पी 24 एलिसा द्वारा की पहचान की गई और exosomes exosome मार्कर दर्द, CD9, CD63, और CD45 का उपयोग कर पहचान की गई। एकत्र ऊपरी कम घनत्व अंशों एचआईवी -1 पी 24 संदूषण के लिए नकारात्मक रहे थे जो exosomes निहित। मानव प्लाज्मा में एचआईवी के कणों से exosomes के कुशल शुद्धि और जुदाई मानव प्लाज्मा के साथ-साथ उनकी प्रतिरक्षा modulatory क्षमता की जांच और एचआईवी -1 रोगजनन में exosomes के नैदानिक ​​और शकुन मूल्य से निकाली गई exosomes की सामग्री की सही परीक्षा के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

Exosome अलगाव और शोधन प्रक्रिया का एक सामान्य आरेख चित्र 1 में प्रदान की जाती है। पूरे रक्त स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से और एमोरी विश्वविद्यालय की आशा क्लिनिक और ग्रेडी स्वास्थ्य प्रणाली के संक्रामक रोग कार्यक्रम में भाग लेने के एंटीरेट्रोवाइरल theraoy प्राप्त नहीं एचआईवी पॉजिटिव व्यक्तियों से प्राप्त हुई थी अटलांटा, जॉर्जिया में। इस अध्ययन में एमोरी विश्वविद्यालय और चिकित्सा के मोरहाउस स्कूल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। अध्ययन में भाग लेने वाले सभी व्यक्तियों को लिखा है और सूचित सहमति दे दी है।

रक्त प्लाज्मा से Exosomes की 1. तैयारी

  1. मानव रक्त संग्रह और प्रसंस्करण
    1. (18 मिलीग्राम पोटेशियम EDTA युक्त) EDTA के रक्त संग्रह ट्यूब में venipuncture द्वारा परिधीय रक्त के 10 मिलीलीटर लीजिए, और धीरे मिश्रण करने के लिए पांच बार पलटना।
    2. रक्त कोशिकाओं को गोली आरटी पर 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर रक्त संग्रह ट्यूब अपकेंद्रित्र। एक बाँझ pipet का प्रयोग करेंते एक 25 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब प्लाज्मा अंश (4-5 एमएल) के हस्तांतरण करने के लिए। 1 एक्स पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ प्लाज्मा पतला। Biohazard बर्बाद करने के लिए एक उचित रूप में चिह्नित कंटेनर में (यह भी PBMC के रूप में जाना लाल रक्त कोशिकाओं और सफेद कोशिकाओं) रक्त कोशिकाओं को त्यागें।
      नोट: असंक्रमित दाता रक्त के नमूनों के मामले में, PBMC आगे उपयोग (नीचे, प्रक्रिया IV.2 देखें) के लिए आरक्षित किया जा सकता।
    3. अल्पावधि (2-3 दिन) या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 ओ सी के लिए 4 ओ सी में प्लाज्मा के नमूने संग्रहित करें।
      नोट: आगे की प्रक्रिया से पहले 4 ओ सी के लिए किसी भी जमे प्लाज्मा के नमूने ले आओ।
  2. प्लाज्मा से Exosome अंश की तैयारी
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र प्लाज्मा सेलुलर मलबे को हटाने के लिए। एक स्वच्छ 25 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब करने के लिए मंजूरी दे दी प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें। Biohazard कंटेनर में गोली त्यागें।
    2. 2 के लिए 100,000 XG पर मंजूरी दे दी प्लाज्मा अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर घंटा बड़े पुटिकाओं हटाने के लिए। Pipetting द्वारा ध्यान से 100,000 XG तैरनेवाला निकालें, और biohazard कचरे में त्यागें। एक स्वच्छ ट्यूब में 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 100,000 XG गोली Resuspend और धीरे हटाना और अलग कणों को घूमता, 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    3. पीबीएस के 25 मिलीलीटर जोड़कर निलंबित 100,000 XG exosome / वायरस गोली धो लें। फिर धीरे से, मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 100,000 XG पर फिर से अपकेंद्रित्र ट्यूब पांच बार पलटना। Biohazard अपशिष्ट कंटेनर में पीबीएस धोने समाधान त्यागें।
    4. 1 एक्स पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 100,000 XG गोली Resuspend और हटाना और गोली भंग करने के लिए धीरे घूमता 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      नोट: यह iodixanol ढाल चरण तक 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, exosomes और वायरस कणों से युक्त, iodixanol ढाल कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना गोली स्टोर करने के लिए संभव नहीं है।

Exosomes 2. शुद्धीकरण

  1. 6% -18% veloc उत्पन्नएक दोहरे चैम्बर ढाल पूर्व उपकरण का उपयोग कर iodixanol के अल्पसंख्यक ढ़ाल।
    1. पीबीएस में कमजोर पड़ने से पानी में एक 60% समाधान, के रूप में आपूर्ति iodixanol अभिकर्मक का 6% और 18% समाधान, तैयार करें। Pipet 5.5 हड़कंप मच गया चैम्बर में 18% समाधान के मिलीलीटर, और pipet जलाशय के चेंबर में 6% समाधान के 5.5 मिलीलीटर। , दोषी पर मुड़ें पानी निकलने की टोंटी खोलते हैं, और प्रत्येक ढाल एक 14 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में प्रवाह करने की अनुमति देते हैं।
      नोट: तुरंत उपयोग या उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार ढ़ाल हे / एन की दुकान या तो।
    2. ध्यान से प्रत्येक 11 मिलीलीटर ढाल के शीर्ष पर exosome / वायरस समाधान के 1 मिलीलीटर परत। एक SW40Ti झूल बाल्टी रोटर का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा, के लिए 250,000 XG पर अपकेंद्रित्र ढ़ाल।
    3. बारह (12) 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब लेबल। ढाल के ऊपर से 1.0 मिलीलीटर निकालें और ट्यूब # 1 के लिए स्थानांतरण। अनुक्रमिक क्रम में ट्यूब 2-12 के लिए शेष 1ml अंशों स्थानांतरण।
      नोट: सर्वोच्च अंश इस प्रकार # 1, नीचे अंश, # 12 हो जाएगा। सेंट4 डिग्री सेल्सियस पर ढाल अंशों अयस्क। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब ढाल के शीर्ष पर अंशों 1-3 में होना चाहिए, जो शुद्ध exosomes, 3-4 सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं।

3. Exosome विशेषता

  1. Acetylcholinesterase (दर्द) गतिविधि परख
    1. 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में acetylthiocholine आयोडाइड 28.9 मिलीग्राम के मिश्रण से 100 मिमी सब्सट्रेट स्टॉक तैयार। 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर पर स्टोर सब्सट्रेट शेयर।
    2. 1X पीबीएस के 10 मिलीलीटर में benzoic एसिड 39.6mg और सोडियम बाइकार्बोनेट 15 मिलीग्राम के मिश्रण से 10 मिमी रंग सूचक स्टॉक तैयार। ऊपर दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर रंग सूचक शेयर।
    3. (उदाहरण के लिए 10 मिलीलीटर 1X पीबीएस + 200 μl सब्सट्रेट + 500 μl रंग सूचक) 5: 2: 100 के अनुपात में मिश्रण 1X पीबीएस, सब्सट्रेट, और रंग सूचक द्वारा परख अभिकर्मक तैयार करें।
    4. एक 96 अच्छी तरह microtite के कुओं के लिए स्थानांतरण (प्रक्रिया III.3 से, 1-12 लेबल) प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर ढाल अंश ट्यूब से 50 μlआर थाली। प्रत्येक ढाल नमूना के लिए डुप्लिकेट कुओं तैयार करें।
    5. पहले पीबीएस में एक 2000 μU / एमएल दर्द शेयर बनाकर मानकों का एक सेट तैयार करें। बनाओ ग्यारह (11) 2 गुना इस शेयर के धारावाहिक dilutions और, एक microtiter प्लेट की एक भी अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 50 μl जोड़ने के लिए इतना है कि मानक # 1 = 2,000 μU / एमएल, # 2 = 1000 μU / एमएल, # 3 = 500 μU / एमएल, आदि # 12 = 0.98 μU / एमएल तक। बारह दर्द मानकों इस प्रकार एक 96 अच्छी तरह से परख प्लेट की एक पंक्ति पर कब्जा होगा।
    6. प्रत्येक के लिए परख अभिकर्मक मिश्रण के 200 μl अच्छी तरह से जोड़ें और रंग प्रतिक्रिया उत्पाद के विकास की अनुमति के लिए आरटी पर (अंधेरे में) 20 मिनट सेते हैं। एक फ्लोरोसेंट microplate रीडर का उपयोग कर 450 एनएम के तरंग दैर्ध्य में दर्द गतिविधि को मापने।
      नोट: exosome शुद्धि के बाद शेष सामग्री शुरू करने का प्रतिशत unfractionated प्लाज्मा के दर्द परख द्वारा मूल्यांकन किया है।
  2. Immunoblot विश्लेषण
    1. Proced से ढाल अंशों 1-12 में अलग प्रोटीन (100V एक्स 1 घंटा में 4-20% Tris एचसीएल मिल में बना हुआ जैल पर एसडीएस पृष्ठ से Ure 2.1.3)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक विद्युत सोख्ता हस्तांतरण सेल का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली को जेल में प्रोटीन स्थानांतरण। स्थानान्तरण 350V पर 12-16 घंटा (हे / एन) के लिए दाग की अनुमति दें।
    2. सोख्ता तंत्र से झिल्ली निकालें और 5 मिनट के लिए Tris-buffered खारा (टीबीएस) में धो लें। आरटी पर झटकों से 1 घंटे के लिए (0.1% के बीच 20 के साथ टीबीएस) TTBS में 5% नोनफेट दूध के साथ ब्लॉक।
    3. 12-16 घंटा (हे / एन) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ 5% नोनफेट दूध में exosomes (CD9, CD45, CD63) या एचआईवी -1 capsid प्रोटीन (पी 24) के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं। Immunoblots के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के dilutions 1 से सीमा: 2,000 -1: 5,000।
    4. एक 1 के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा 20 मिनट के लिए TTBS में दाग धो लें: हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के 2,000 कमजोर पड़ने आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% नोनफेट दूध में, विरोधी आईजीजी (माध्यमिक एंटीबॉडी) को संयुग्मित। धब्बा TTBS के साथ 3 बार, धोने प्रति 10 मिनट धो लें।
    5. एडोब फोटोशॉप में देखी जा सकती है जो झगड़ा फ़ाइलों के रूप में छवियों को बचाओ। ImageJ सॉफ्टवेयर (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, बेथेस्डा, एमडी) का उपयोग बैंड के डेन्सिटोमीटरी विश्लेषण करते हैं।
  3. साइटोकाइन परख
    1. साइटोकाइन परख करने से पहले, एसिड हदबंदी से मानव प्लाज्मा में आम तौर पर मौजूद हैं और डिटर्जेंट उपचार द्वारा exosomes lyse कि प्रतिरक्षा परिसरों को बाधित। परख दोनों शुरू करने प्लाज्मा नमूनों और शुद्ध exosome तैयारी।
      1. मानव प्लाज्मा के 100 μl के लिए 100 μl 0.33 एन एचसीएल जोड़ने और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एसिड का इलाज प्लाज्मा बेअसर करने के लिए 100 μl 0.33 एन NaOH जोड़ें। एक फाई के लिए, ट्राइटन X-100 को निष्प्रभावी प्लाज्मा और शुद्ध exosome दोनों नमूने जोड़ें1% की अंतिम एकाग्रता, exosomes की सेल पैदा करने के लिए।
    2. इस परख (एक फ्लोरोसेंट मनका आधारित प्रक्रिया) के लिए, चुंबकीय मोती निर्माता द्वारा एंटीबॉडी के साथ पूर्व लेपित का उपयोग करें। विरोधी मानव साइटोकाइन एंटीबॉडी लिपटे मोतियों की एक कस्टम डिजाइन पैनल का उपयोग करें; 1 टेबल में सूचीबद्ध। 30 सेकंड के लिए साइटोकाइन परख किट से एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोती भंवर और परख में इस्तेमाल की जाने वाली एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl मोती जोड़ें।
    3. एक 8 सूत्री मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए, साइटोकाइन परख किट के लिए अनुदेश पुस्तिका में वर्णित के रूप में प्लाज्मा मानक बफर (साइटोकाइन परख किट में निहित दोनों) में मानकों की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें।
    4. पुस्तिका में वर्णित के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (किट) से 1X धोने बफर के 150 μl जोड़ें और एक चुंबकीय मनका वॉशर का उपयोग मोती धो लें। प्रत्येक अच्छी तरह से (किट से) 25 μl प्लाज्मा परख बफर जोड़ें। परख में प्रयुक्त सभी कुओं के लिए मानकों और नमूने के 25 μl जोड़ें। प्लाज्मा के 25 μl जोड़ेंनकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए नमूना बफर। सील और आरटी पर 60 मिनट के लिए 700 rpm पर थाली हिला और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1x धो बफर के 150 μl जोड़ें और (ऊपर, कदम 3.3.4 के रूप में) थाली धोने। प्रत्येक अच्छी तरह से सील में पता लगाने के एंटीबॉडी के 25 μl जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए 700 rpm पर थाली हिला। धोने कदम दोहराएँ।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से सील में (किट से SAPE) streptavidin समाधान के 50 μl जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए 700 rpm पर थाली हिला। 3.3.4 में दोहराने के रूप में प्लेट washes।
    7. फ्लोरोसेंट संकेत विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 700 rpm पर एक प्रयोगशाला टेबलटॉप प्रकार के बरतन पर प्रत्येक में (किट) से पढ़ने के बफर के 120 μl अच्छी तरह से जोड़ें और हिला। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लेट रीडर पर प्लेट पढ़ें।
    8. , अलगाव की प्रक्रिया के दौरान खो exosomes की राशि के लिए खाते को निम्न समीकरण का उपयोग करने के लिए: [(मूल पढ़ने / प्लाज्मा मात्रा) 66.6 = समायोजित साइटोकाइन पढ़ने x]।

Immunomodulatory क्षमता के लिए 4. परख

  1. Exosome समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम साथ संस्कृति के माध्यम की तैयारी
    1. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए 100,000 XG पर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 500 मिलीलीटर exosomes और microvesicles दूषित गोली। ध्यान से हटाने और exosome समाप्त एफबीएस सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए। Biohazard कचरे में गोली त्यागें।
    2. रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 के 500 मिलीलीटर (1640 RPMI) माध्यम के साथ exosome समाप्त एफबीएस सतह पर तैरनेवाला के 20% का मिश्रण। एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर।
    3. फ़िल्टर्ड मध्यम करने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल), पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), एल glutamine (2 मिमी), HEPES बफर खारा समाधान (10 माइक्रोन), और आईएल -2 (20 यू / एमएल) जोड़ें।
  2. सेल संस्कृति और Exosome एक्सपोजर
    1. स्वस्थ क्लिनिक स्वयंसेवकों से प्राप्त दाता परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) को exosomes बेनकाब। में PBMC निलंबितसंस्कृति के माध्यम से तैयार किया है और (निर्माता के मानक विधि के अनुसार) एक सेल / कण काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
      नोट: PBMC (1.2 कदम) ऊपर वर्णित प्लाज्मा तैयारी के दौरान प्राप्त कर रहे हैं।
    2. प्रक्रिया 4.1.3 से तैयार माध्यम का उपयोग कर, सह संस्कृति 3.0 एक्स 10 6 से जमा exosomes की 1 ग्राम / मिलीलीटर के साथ (PBMC) तीन (3) एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव या तीन (3) एचआईवी -1 सेरोनिगेटिव व्यक्तियों से कुल में (ढक्कन) के साथ एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के कुओं में 1 मिलीलीटर की मात्रा। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए संस्कृतियों सेते हैं।
    3. Concanavalin एक साथ इलाज किया अनुपचारित PBMC संस्कृतियों और संस्कृतियों की तैयारी (कोन ए, 5 माइक्रोग्राम / एमएल) (4.2.2) जैसा कि ऊपर वर्णित है, क्रमशः, के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण सेवा के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सभी PBMC संस्कृतियों सेते हैं।
    4. एलेक्सा स्त्राव 700 लेबल विरोधी CD3 (1: 400 कमजोर पड़ने), allophycocy तुरंत पहले कोशिकाओं की कटाई करने के लिए, निम्न fluorochrome संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की dilutions तैयार(1: 400), V450 लेबल विरोधी सीडी 8, biotin-: क्लोरोफिल प्रोटीन जटिल लेबल विरोधी सीडी 4 (400 1) peridinin,: Anin (एपीसी) / जाती 7 (Cy7) विरोधी सीडी 4 (400 1) -labeled विरोधी CD45RA (1: 1000) लेबल, phycoerythrin (पीई) / विरोधी CD62L (1: 1000) Cy7 लेबल: पीई टेक्सास लाल, पीई / जाती 5 (Cy5) विरोधी CD38 (200 1) -labeled लेबल विरोधी streptavidin (1: 2,000), और पीई / Cy5 लेबल माउस IgG1K निर्धारण नियंत्रण (1: 200)।
    5. 48 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, PBMC फसल। पीबीएस में धो PBMC व्यक्ति fluorochrome टैग एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1hr लिए ऊष्मायन के द्वारा कोशिकाओं exosomes हटाने और दाग। (21 वर्णित) chemokines की अभिव्यक्ति यों की फ्लो द्वारा दाग PBMC का विश्लेषण करें।

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Representative Results

Exosomes कुशलता से एचआईवी -1 सकारात्मक मानव प्लाज्मा से शुद्ध कर रहे हैं। एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) गतिविधि द्वारा की पहचान पृथक exosomes, एचआईवी -1 प्रतिजन पी 24 द्वारा की पहचान वायरस कणों, जबकि iodixanol ढ़ाल के शीर्ष पर कम घनत्व अंशों 1-3 में अलग-अलग (नीचे के पास, 10-12) उच्च-घनत्व भागों में बांटा गया। exosomes की उपस्थिति आगे exosome मार्कर दर्द, CD9, CD45, और CD63, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा (चित्रा 2) के immunoblot पहचान की पुष्टि की थी।

समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines के साथ जुड़ा हुआ है और काफी एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव व्यक्तियों की exosomes में बुलंद कर रहे हैं। शुद्ध exosomes और unfractionated प्लाज्मा से एचआईवी -1 से संक्रमित और एचआईवी -1 सेरोनिगेटिव व्यक्तियों मल्टीप्लेक्स परख द्वारा 21 साइटोकिन्स / chemokines के लिए विश्लेषण किया गया। सभी 21 साइटोकिन्स / केमोkines एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों से अलग exosomes में पाया गया। एचआईवी -1 सेरोनिगेटिव नियंत्रण (तालिका 1) से प्लाज्मा और exosomes की तुलना में इसके अतिरिक्त, अपने स्तर काफी ऊंचा कर रहे थे।

CD38 अभिव्यक्ति एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव व्यक्तियों से exosomes के संपर्क में कोशिकाओं की सतह पर बढ़ गया था। असंक्रमित मानव दाताओं से PBMCs पर सक्रियण मार्कर CD38 के स्तर के लिए एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव या सेरोनिगेटिव व्यक्तियों से जमा exosomes करने के लिए 48 घंटे के लिए संपर्क में है और का मूल्यांकन किया गया सीडी 4 + और प्रवाह cytometry के माध्यम से सीडी 8 + टी कोशिकाओं। हम ने कहा कि 48 घंटे के बाद जोखिम, सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं को काफी एचआईवी नेगेटिव exosome उपचार और इलाज की तुलना में एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों से exosomes के संपर्क में टी कोशिकाओं में उठाया गया भोले और केंद्रीय स्मृति की सतह पर CD38 अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रण (चित्रा 3)।


एचआईवी -1 सकारात्मक मानव प्लाज्मा से exosome अलगाव के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। (ए) परिधीय रक्त के 10 मिलीलीटर एचआईवी -1 seropositve और सेरोनिगेटिव व्यक्तियों से एकत्र किया गया था। (बी) EDTA के रक्त संग्रह ट्यूब आरटी पर 20 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifuged थे। (सी) अलग प्लाज्मा 1x पीबीएस और (डी) के साथ साढ़े 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों का तबादला और पतला था 30 मिनट के लिए 10,000 XG centrifuged। (ई) सतह पर तैरनेवाला नलियों ultracentrifuge को हस्तांतरित और (एफ) 2 घंटे के लिए 10,000 XG पर centrifuged था। (जी, एच) सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और exosome गोली फिर से निलंबित कर दिया और 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में धोया। Centrifugation के बाद (आई), सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और गोली पीबीएस 1x 1ml में फिर से निलंबित कर दिया और 2 घंटे के लिए 250,000 XG पर centrifuged 6-18% iodixanol वेग ढाल और (जे) पर मढ़ा। Centrifugation के बाद (कश्मीर), ढाल के ऊपर से नीचे तक 1 मिलीलीटर अंशों टीआरए थे1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए nsferred और दर्द सामग्री और immunoblot विश्लेषण के लिए विश्लेषण किया। (एल) अंशों 2 और 3 की तुलना में थे और संयुक्त 1X पीबीएस और 2 घंटे के लिए 400,000 XG पर centrifuged (एम) के 4 मिलीलीटर के साथ पतला। (एन) centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और गोली समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन और केमोकाइन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित कर दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Exosomes कुशलतापूर्वक मानव प्लाज्मा से शुद्ध कर रहे हैं। एचआईवी सेरोपॉज़िटिव या सेरोनिगेटिव व्यक्तियों से व्यक्तिगत iodixanol वेग ढाल भिन्न (ए) एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ के लिए एंजाइमी परख (दर्द), और exosomal मार्कर CD9, सीडी के लिए (बी) के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन थे45, CD63 और वायरल प्रोटीन पी 24 और थे (सी) विरोधी CD63 के साथ immunolabeled और शुद्ध exosomes (सी) की तैयारी की पुष्टि करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की और। (अनुमति के द्वारा प्रयोग किया जाता Konadu एट अल, 2014 में 21, से चित्रा)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Immunomodulatory क्षमता के लिए चित्रा 3. परख से। PBMCs एचआईवी -1 सेरोनिगेटिव व्यक्तियों एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव के प्लाज्मा (एचआईवी + Exo) या सेरोनिगेटिव से जमा exosomes या तो अनुपचारित (एचआईवी Exo) व्यक्तियों, वाम अवगत कराया, या के साथ इलाज किया गया 5 माइक्रोग्राम / एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में Concanavalin एक मिलीलीटर (कोन ए)। 48 घंटा प्रदर्शन के बाद, भोली (CD45RA / + CD62L +), मध्य (टीसीएम; CD45RA- / CD62L +) और प्रेरक (मंदिर, CD45RA- / CD62L-) स्मृति सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा CD38 अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया। Exosome एकाग्रता कुल प्रोटीन द्वारा सामान्यीकृत और 1 ग्राम / मिलीलीटर में जोड़ा गया है। त्रुटि सलाखों +/- मतलब प्रतिनिधित्व छह स्वतंत्र दाताओं की सेम। समूहों के बीच अंतर एक तरह से एनोवा टेस्ट से सांख्यिकीय महत्व के लिए परीक्षण किया गया। * पी ​​<0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001, **** पी <0.0001। (अनुमति के द्वारा प्रयोग किया जाता Konadu एट अल से चित्रा, 2014 में 21,)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन और केमोकाइन अभिव्यक्ति के लिए शुद्ध exosomes और एचआईवी -1 सेरोपॉज़िटिव से पूरे प्लाज्मा और सेरोनिगेटिव व्यक्तियों की तालिका 1. विश्लेषण। पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001, **** पी <0.0001। (अनुमति के द्वारा प्रयोग किया जाता Konadu एट अल, 2014 में 21, से चित्रा)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जीर्ण प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) और सीडी 4+ टी सेल कमी एचआईवी -1 संक्रमण के दो महत्वपूर्ण पहचान कर रहे हैं। वे सीआईए सबसे अच्छा कारक होने के साथ रोगजनन के लिए भविष्यवक्ताओं के रूप में स्थापित कर दिया गया है। हालांकि, पुरानी प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण और सीडी 4+ टी सेल गिरावट ड्राइविंग अंतर्निहित तंत्र अभी भी पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। हम और अन्य प्रयोगशालाओं एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं से स्रावित exosomes दोनों पहचान में एक भूमिका निभा कि ठोस सबूत विकसित किया है।

दोनों संरचना और बाह्य पुटिकाओं के समारोह में जारी ब्याज सेल संस्कृति मीडिया और जैविक तरल पदार्थ 24-26 दोनों से exosome अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों के प्रकाशन के लिए प्रेरित किया है। Exosome सामग्री और कार्यात्मक गतिविधि दोनों जांच करने की क्षमता को बनाए रखते हुए हालांकि, एचआईवी -1 रोगजनन में exosomes की भूमिका की जांच के लिए एक बाधा एचआईवी -1 कणों से exosomes के कुशल जुदाई किया गया है। हम एक आद्य विकसित किया हैiodixanol वेग ढ़ाल का उपयोग मानव प्लाज्मा में एचआईवी -1 कणों से exosomes की शुद्धि के लिए कर्नल। इस अध्ययन में इस्तेमाल एचआईवी पॉजिटिव दाताओं एंटीरेट्रोवायरल उपचार और 206,000 वायरस कणों / एमएल 21 की औसत के साथ 1500 से 400,000 वायरस कणों / एमएल के लिए निहित इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल प्लाज्मा के नमूने प्राप्त नहीं हुआ था। इस प्रकार, हम वायरस भार उच्च रहे हैं, तब भी जब एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों के प्लाज्मा में exosomes कुशलता से एचआईवी -1 वायरस कणों से अलग किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। आकार और घनत्व में समान हालांकि, exosomes उच्च घनत्व / निचले भागों में बांटा गया है, जो वायरल कणों की तुलना में iodixanol ढ़ाल के कम घनत्व / ऊपरी अंशों में अलग। iodixanol ढाल विधि द्वारा तैयार exosomes उच्च शुद्ध और बाह्य प्रोटीन contaminating के लिए स्वतंत्र हैं। पृथक exosomes आबादी की पवित्रता पी 24 एलिसा और एचआईवी -1 पी 24 capsid प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करने की पुष्टि की थीके रूप में अच्छी तरह से exosomal मार्कर, दर्द, CD9, CD45, और CD63 के लिए पश्चिमी विश्लेषण के रूप में। इन मार्कर के उपयोग exosome पहचान 27 के लिए हाल ही में प्रकाशित दिशा निर्देशों के अनुरूप है।

अधिक physiologically प्रासंगिक प्रतिरक्षा सक्रियण के लिए, एचआईवी -1 संक्रमित व्यक्तियों से शुद्ध exosomes एचआईवी -1 सेरोनिगेटिव नियंत्रण से exosomes तुलना में काफी अधिक मात्रा में साइटोकिन्स / chemokines शामिल पाए गए। इसके अलावा, एचआईवी -1 से संक्रमित व्यक्तियों से exosomes भोले और केंद्रीय स्मृति सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं की सतह पर, सक्रियण मार्कर, CD38 के स्तर में वृद्धि के लिए प्रेरित करने की क्षमता का प्रदर्शन, जैविक रूप से सक्रिय थे। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों में एचआईवी संक्रमण के दौरान लगातार प्रतिरक्षा सक्रियण ड्राइव सकता है कि एक तंत्र सुझाव देते हैं।

परिणाम हम अंतर centrifugation और iodixanol वेग ढाल जुदाई मूल्य दिखाने को जोड़ती है जो हमारे exosome शुद्धिकरण की प्रक्रिया का उपयोग कर, प्राप्त करने में सक्षम थेशारीरिक और कार्यात्मक bioassays के लिए उच्च शुद्ध exosomes का उपयोग करने का। प्रक्रिया कुछ नुकसान और सीमाएं हैं। Exosomes के एक काफी मात्रा में दर्द गतिविधि की माप द्वारा गणना के रूप में शुरू सामग्री के अक्सर एक बहुमत की प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं। इसके अलावा, प्रक्रिया भी समय लगता है और महंगे उपकरण के लिए उपयोग की आवश्यकता है। अंत में, ढाल Fromer उपकरण का उपयोग कर iodixanol ढ़ाल की पीढ़ी reproducibility सुनिश्चित करने के लिए काफी अभ्यास की आवश्यकता है। ढाल पीढ़ी के लिए एक वैकल्पिक तरीका ढ़ाल के रूप में करने की अनुमति के लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में समाधान के लिए सावधान लेयरिंग और incubating हे / एन के द्वारा पीछा iodixanol समाधान की एक वर्गीकृत श्रृंखला तैयार करने के लिए हो सकता है। हालांकि, हम इस विकल्प परीक्षण नहीं किया है।

मानव प्लाज्मा में एचआईवी -1 कणों से अलगाव और exosomes के विभाजन के लिए यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पूर्व की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए एक प्रभावी तरीका हैosomes। इस विधि का उपयोग एचआईवी -1 रोगजनन में exosomes की भूमिका के बारे में भविष्य की जांच के लिए रोमांचक रास्ते के लिए प्रेरित किया और समान रूप से अन्य जैविक प्रक्रियाओं के लिए जांच में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 107 Exosomes एचआईवी -1 प्लाज्मा iodixanol वेग ढ़ाल साइटोकिन्स
एचआईवी -1 सकारात्मक व्यक्तियों के प्लाज्मा से Exosomes का अलगाव
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Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth,… More

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

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