Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer

Published: January 5, 2016 doi: 10.3791/53495
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3,4, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Department of Medicine, Emory University School of Medicine, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine, 4Yerkes National Primate Research Center

Abstract

Exosomes er små vesikler som varierer i størrelse fra 30 nm til 100 nm som frigjøres både konstitutivt og ved stimulering av en rekke celletyper. De er funnet i en rekke biologiske fluider, og er kjent for å bære en rekke proteiner, lipider og nukleinsyremolekyler. Opprinnelig tenkt å være litt mer enn reservoarer for mobilnettet rusk, er rollene til exosomes regulerer biologiske prosesser og ved sykdommer stadig verdsatt.

Flere metoder er blitt beskrevet for å isolere exosomes fra celledyrkningsmedier og biologiske væsker. På grunn av sin lille størrelse og lav tetthet, differensial ultrasentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest brukte teknikker for exosome isolasjon. Imidlertid inneholder plasma av HIV-1-infiserte individer både exosomes og HIV-viruspartikler, som er lik i størrelse og tetthet. Det har således effektiv separasjon av exosomes fra HIV-viruspartikler i humant plasma har værten utfordring.

For å møte denne begrensningen, har vi utviklet en prosedyre forandret fra Cantin et. al., 2008 for rensing av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma. Iodixanol hastighetsgradienter ble anvendt for å separere exosomes fra HIV-1 partikler i plasma hos HIV-1-positive individer. Viruspartikler, ble identifisert ved p24 ELISA. Exosomes ble identifisert på grunnlag av exosome markører acetylkolinesterase (AChE), og de CD9, CD63 og CD45 antigener. Vår gradient fremgangsmåten ga exosome forberedelser gratis viruspartikler. Den effektive rensing av exosomes fra humant plasma gjort oss i stand til å undersøke innholdet av plasmafremstilte exosomes og å undersøke deres immunmodulerende potensial og andre biologiske funksjoner.

Introduction

HIV-1-epidemien fortsetter å ha en betydelig innvirkning på hele verden. Som for 2013, ble omtrent 35 millioner mennesker verden over lever med hiv, og 2,1 millioner av disse var nysmittede personer 1. Forebyggende strategier og økt tilgang til antiretroviral behandling har vært nyttig for å redusere den samlede kjøpet av HIV. Imidlertid er enkelte bestander fortsatt opplever økning i kjøp av HIV 1. Dermed er det behov for fortsatt innsats for å løse denne epidemien.

En av de sterkeste prediktor for HIV sykdomsprogresjon er kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Definert ved vedvarende høyt nivå av påviselige cytokiner og forhøyet uttrykk markører på overflaten av T-lymfocytter, er CIA blitt tilskrevet: i) kontinuerlig dendrittiske celleproduksjon av type I IFN-11; (ii) direkte aktivering av immunsystemet drevet av HIV-proteiner Tat, Nef og gp120 12; (iii) Translokasjon av bakterielle proteiner i gut forbundet immunceller 6. Men den eksakte mekanismen (e) underliggende kronisk, systemisk aktivering av immunsystemet i HIV-smitte fortsatt ikke helt klarlagt.

Vår forskningsgruppe og andre har vist en rolle exosomes i HIV patogenesen 15-18. Vår gruppe har bestemt at Nef protein utskilles fra infiserte celler i exosomes 15, og exosomal Nef (exNef) er til stede i plasma hos HIV-smittede personer på nanogram nivåer 18. Vi har vist at bystander CD4 + T-celler utsatt for exNef resulterte i aktiverings-indusert celledød avhengig av CXCR4 veien 19, 20. Alternativt, monocytter / makrofager var refraktære til exNef-indusert apoptose, men viste endrede cellulære funksjoner og cytokin ekspresjon. I det siste har vår gruppe vist exosomes isolert fra plasma hos HIV-infiserte individer inneholder en rekke proinflammatoriske cytokiner. Further, naive perifert blod mononukleære celler eksponert for plasmafremstilte exosomes fra HIV-infiserte pasienter indusert uttrykk for CD38 på naiv og sentrale minne CD4 + og CD8 + T-celler. Dette bidrar sannsynligvis til systemisk inflammasjon og viral propagering via bystander celleaktivering 21, og antyder at exosomes spiller en vesentlig rolle i patogenesen av HIV.

I å undersøke hvilken rolle exosomes i HIV patogenesen, er én utfordring å utvikle teknikker for å effektivt separate exosomes fra HIV partikler og samtidig opprettholde den exosomal innhold samt deres funksjonelle immunmodulator evne. Flere metoder er blitt beskrevet for å isolere exosomes fra cellekultur og biologiske væsker 22,23. På grunn av sin lille størrelse og lave tetthet (exosomes flyte ved en tetthet på 1,15 - 1,19 g / ml), differensialultrasentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest vanlig anvendte teknikker for exosome isolasjon 23.Men HIV-smittede cellekultursupernatanter og pasienter 'plasma inneholde både exosomes og HIV-1 viruspartikler. Exosomes og HIV-1 partikler som er svært lik både i størrelse og tetthet. Alternativt, drar nytte av uttrykket unike exosomal markører som CD63, CD45 og CD81, exosomes har blitt isolert ved hjelp immunoaffinitetskromatografi fangst metoder 23. Denne prosedyren kan skille virus fra exosomes. Imidlertid er ulempen med denne teknikken den tette binding av antistoffene til de rensede exosomes, som kunne forstyrre vurderingen av immunmodulerende potensialet av exosomes i kultur.

For å møte disse begrensningene, har vi utviklet en prosedyre for rensing av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma endret fra Cantin og kolleger 22 bruker Iodixanol hastighetsgradienter. Exosomes ble funnet å segregere i low-density / øvre fraksjoner av iodixanol gradienter, mens viruspartikler segregert i høy-Tetthet / lavere fraksjoner. Viruspartikler ble identifisert ved p24 ELISA og exosomes ble identifisert ved hjelp av exosome markører smerter, CD9, CD63 og CD45. De øvre lav tetthet fraksjoner oppsamlet inneholdt exosomes som var negative for HIV-1 p24 forurensning. Den effektive rensing og separering av exosomes fra HIV-partikler i humant plasma muliggjør nøyaktig undersøkelse av innholdet av exosomes avledet fra humant plasma, samt undersøkelse av deres immunmodulerende potensial og den diagnostiske og prognostiske verdi av exosomes i HIV-1 patogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En generell diagram av exosome isolering og rensing prosedyren er gitt i figur 1. Fullblod ble hentet fra friske pasienter og fra HIV-positive personer ikke får antiretroviral theraoy deltar Hope Clinic of Emory University og Infectious Disease Program for Grady Health System i Atlanta, Georgia. Denne studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene i Emory University og Morehouse School of Medicine. Alle personer som deltar i studien ga skrevet og informert samtykke.

1. Utarbeidelse av Exosomes fra blodplasma

  1. Human Blood Collection og prosessering
    1. Samle 10 ml perifert blod ved venepunksjon i EDTA blodoppsamlingsrør (som inneholder 18 mg kalium EDTA), og forsiktig invertere fem ganger for å blande.
    2. Sentrifuger blodprøverør ved 1000 xg i 20 minutter ved romtemperatur for å pelletere blodceller. Bruk en steril pipettete for å overføre plasmafraksjon (4-5 ml) i en 25 ml konisk rør. Fortynn plasma med 10 ml 1 X PBS. Kast blodceller (røde blodceller og hvite celler, også kjent som PBMC) i en passende merket beholder for biologisk avfall.
      MERK: I tilfelle av uinfiserte donor blodprøver, kan PBMC være reservert for videre bruk (se prosedyre IV.2, nedenfor).
    3. Oppbevar plasmaprøver ved 4 o C for kort sikt (2-3 dager) eller ved -80 o C i lengre tids lagring.
      MERK: Ta med noen frosne plasmaprøver til 4 o C før videre behandling.
  2. Utarbeidelse av Exosome Fraksjon fra Plasma
    1. Sentrifuger ved 10.000 xg plasma i 30 minutter ved 4 ° C for å fjerne cellerester. Bruke en steril serologisk pipette for å overføre plasma erte supernatant til et rent 25 ml ultrasentrifugerør. Kast pellet i biohazard container.
    2. Sentrifuger ryddet plasma på 100 000 xg for 2time ved 4 ° C for å fjerne store blærer. Fjern 100,000 xg supernatanten forsiktig ved pipettering, og kast i biologisk avfall. Resuspender pelleten 100 000 xg i 1 ml av 1 x PBS i et rent rør og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter, virvlende forsiktig for å løsne og separate partikler.
    3. Vask suspenderte 100000 xg exosome / virus pellet ved å tilsette 25 ml PBS. Snu røret fem ganger for å blande, så sentrifuger igjen på 100000 xg for 2 timer ved 4 ° C. Kast PBS vaskeoppløsningen i det smittefarlig avfallsbeholderen.
    4. Resuspender pelleten 100 000 xg i 1 ml av 1 x PBS og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter virvlende forsiktig for å løsne og oppløse pelleten.
      MERK: Hvis det ikke er mulig å gå direkte til iodixanol gradient trinnet, lagre pellet, som inneholder exosomes og viruspartikler, ved 4 ° C i 1-2 dager inntil iodixanol gradient trinn.

2. Rensing av Exosomes

  1. Generere 6% -18% velocity gradienter av iodixanol ved hjelp av en dobbeltkammer gradient tidligere apparatur.
    1. Forbered 6% og 18% løsninger av iodixanol reagens, levert som en 60% løsning i vann, ved fortynning i PBS. Pipetter 5,5 ml av 18% løsning i den omrørte kammeret, og Pipetter 5,5 ml av 6% løsning i reservoaret kammeret. Slå på røre, åpne kraner, og la hver gradient å strømme inn i en 14 ml ultrasentrifugerør.
      MERK: Enten bruke umiddelbart eller lagre oppkjørte gradienter O / N ved 4 ° C før bruk.
    2. Nøye lag 1 ml av exosome / virus løsning på toppen av hver 11 ml gradient. Sentrifuger gradienter på 250 000 x g i 2 timer ved 4 ° C, ved hjelp av en SW40Ti svingende spannrotor.
    3. Merke tolv (12) 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fjern 1,0 ml fra toppen av gradienten og overføring til røret 1. Overfør de resterende 1 ml fraksjoner til rør 2-12 i kronologisk rekkefølge.
      NB: Den øverste fraksjon vil således være # 1, bunnfraksjonen, # 12. Stmalm gradient fraksjoner ved 4 ° C. De rensede exosomes, som bør være i fraksjonene 1-3 på toppen av gradienten, er stabile i 3-4 uker når de lagres ved 4 ° C.

3. Exosome Karakterisering

  1. Acetylkolinesterase (AChE) aktivitetsanalyse
    1. Forbered 100 mM substrat lager ved å blande acetylthiocholine jod 28,9 mg i 1 ml 1X PBS. Oppbevares underlaget lager ved -20 ° C opp til en måned.
    2. Forbered 10 mM fargeindikator lager ved blanding av benzosyre og natriumbikarbonat 39.6mg 15 mg i 10 ml 1 x PBS. Butikken fargeindikator lager ved 4 ° C i opptil to uker.
    3. Forbered assayreagens ved blanding av 1 x PBS, substrat, og fargeindikator i et forhold på 100: 2: 5 (for eksempel, 10 ml 1 x PBS + 200 ul substrat + 500 pl fargeindikator).
    4. Overføring 50 ul fra hver 1,5 ml gradient fraksjon rør (merket 1 til 12, fra prosedyre III.3) til brønnene i en 96-brønners microtiter plate. Forbered to brønner for hver gradient prøve.
    5. Utarbeide et sett av standarder ved først å lage en 2000 uU / ml AChE lager i PBS. Gjør elleve (11) 2-gangers seriefortynninger av dette lager og tilsett 50 ul av hver fortynning til en enkelt brønn i en mikrotiterplate, slik at standard # 1 = 2000 uU / ml, # 2 = 1000 uU / ml, # 3 = 500 uU / ml, etc. til # 12 = 0,98 uU / ml. De tolv verke standardene vil således oppta en enkelt rad av en 96-brønn analyseplate.
    6. Tilsett 200 ul av analysereagensen blanding til hver brønn og inkuberes 20 min (i mørket) ved romtemperatur for å tillate utvikling av det fargede reaksjonsprodukt. Mål AChE-aktivitet ved en bølgelengde på 450 nm ved bruk av en fluorescerende mikroplateleser.
      MERK: Prosent av gjenværende utgangsmateriale etter exosome rensing bestemmes ved AchE analyse av den ufraksjonerte plasma.
  2. Immunoblot-analyse
    1. Separate proteiner i gradient fraksjoner 1-12 (fra procedure 2.1.3) ved SDS-PAGE på 4-20% Tris-HCl prefabrikerte gels på 100V x 1 time. Overfør proteiner i gelen til en nitrocellulosemembran ved hjelp av en elektro-blottingsoverføring celle i henhold til produsentens instruksjoner. Tillat overføringene til tørk i 12-16 timer (O / N) på 350V.
    2. Fjerne membranen fra blotting apparater og vaske i Tris-bufret saltvann (TBS) i 5 minutter. Blokk med 5% fettfri melk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved risting ved RT.
    3. Inkuber membranen med primære antistoffer som er spesifikke for exosomes (CD9, CD45, CD63) eller HIV-1 capsid protein (p24) i 5% fettfri melk med risting ved 4 ° C i 12-16 timer (O / N). Fortynninger av primære antistoffer for immunoblot varierer fra 1: 2000 1: 5000.
    4. Vask den blot i TTBS i 20 minutter, fulgt av inkubering med en 1: 2000 fortynning av pepperrotperoksydase (HRP) -konjugert anti-IgG (sekundært antistoff), i 5% fettfri melk i 1 time ved RT. Vask blot 3 ganger med TTBS, 10 min per vask.
    5. Lagre bildene som TIFF-filer som kan vises i Adobe Photoshop. Utfør densitometry analyse av band som bruker ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
  3. Cytokin analyse
    1. Før analysen cytokin, forstyrrer immunkomplekser som vanligvis er til stede i humant plasma ved sur dissosiasjon og lysere exosomes ved behandling vaskemiddel. Analysen begge utgangsplasmaprøver og renset exosome forberedelser.
      1. Til 100 pl humant plasma tilsettes 100 pl 0,33 N HCl og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Tilsett 100 ul 0,33 N NaOH for å nøytralisere syre-behandlede plasma. Legg Triton X-100 til både den nøytraliserte plasma og renset exosome prøver, til en final konsentrasjon på 1%, for å forårsake lysis av exosomes.
    2. For denne analysen (en fluorescerende kule-basert prosedyre), bruke magnetiske kuler forhåndsbelagt med antistoffer av produsenten. Bruk en spesialdesignet panel av anti-menneskelige cytokin antistoffbelagte kuler; gjengitt i tabell 1. Vortex de antistoff-belagte magnetiske kuler fra cytokin analysesettet i 30 sekunder og tilsett 50 ul perler til hver brønn av en 96-brønns plate som skal anvendes i analysen.
    3. Forberede en fortynning serie av standarder i plasma standard buffer (begge finnes i cytokin analysen kit) som beskrevet i bruksanvisningen for cytokin analysen kit, for å generere en 8-punkts standardkurve.
    4. Legg 150 ul 1X vaskebuffer (fra kit) til hver brønn og vask kulene ved hjelp av en magnetisk kuleskive, som beskrevet i bruksanvisningen. Tilsett 25 ul plasma analysebuffer (fra kit) til hver brønn. Legg 25 ul av standarder og prøver til alle brønner som benyttes i analysen. Legg 25 ul av plasmasample buffer til negative kontrollbrønner. Forsegl og rist platen ved 700 rpm i 60 min ved RT og inkuberes O / N ved 4 ° C.
    5. Legg 150 ul 1X vaskebuffer til hver brønn og platen vaskes (som i trinn 3.3.4, ovenfor). Legg 25 ul av deteksjons antistoffer i hver brønn, og rist tetning plate ved 700 rpm i 30 minutter ved romtemperatur. Gjenta vasketrinn.
    6. Tilsett 50 ul streptavidin-oppløsning (SAPE, fra settet) i hver brønn, og rist tetning plate ved 700 rpm i 30 minutter ved romtemperatur. Gjenta plate vasker som i 3.3.4.
    7. Legg 120 mL av lese buffer (fra settet) i hver brønn, og rist i laboratoriebordrister ved 700 rpm i 5 minutter ved romtemperatur for å gi den fluorescerende signal for å utvikle seg. Les plate på plate leseren i henhold til produsentens anvisninger.
    8. For å ta hensyn til mengden av exosomes tapt under isoleringsprosedyren brukes følgende ligning: [(original lesing / plasmavolum) x 66,6 = justert cytokin lesing].

4. Analyse for Immunmoduler Potential

  1. Utarbeidelse av Culture Medium Exosome fattige Fetal Bovine Serum
    1. Sentrifuger 500 ml føtalt bovint serum (FBS) ved 100.000 xg i 20 timer ved 4 ° C for å pelletere forurensende exosomes og mikrovesikler. Forsiktig fjerne og lagre exosome fattige FBS supernatant. Kast pellet i biologisk avfall.
    2. Kombiner 20% av exosome fattige FBS supernatant med 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium. Filtrer det medium gjennom et 0,45 um membranfilter.
    3. Legg streptomycin (100 U / ml), penicillin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-bufret saltvannsoppløsning (10 pM), og IL-2 (20 U / ml) til den filtrerte medium.
  2. Cell Kultur og Exosome Eksponering
    1. Expose exosomes til giver perifere mononukleære blodceller (PBMC) innhentet fra friske klinikk frivillige. Suspendere PBMC ifremstilt kulturmedium og tell cellene ved hjelp av et celle / partikkelteller (i henhold til produsentens standardmetode).
      MERK: PBMC oppnås i løpet av plasma forberedelse beskrevet ovenfor (trinn 1.2).
    2. Ved å bruke klare mediet fra fremgangsmåte 4.1.3, co-kulturen 3,0 x 10 6 (PBMC) med en ug / ml sammenslåtte exosomes fra tre (3) HIV-1 seropositive eller fra tre (3) HIV-1-seronegative individer i en total volum på 1 ml i brønnene til en 12-brønns dyrkingsplate (med lokk). Inkuber kulturer i 48 timer ved 37 ° C.
    3. Forbered ubehandlede PBMC kulturer og kulturer behandlet med Concanavalin A (Con A; 5 ug / ml) for å tjene som negative og positive kontroller, henholdsvis, som beskrevet ovenfor (4.2.2). Inkuber alle PBMC-kultur i 48 timer ved 37 ° C.
    4. Umiddelbart før høsting av cellene, fremstille fortynninger av følgende fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer: Alexa Fluor 700-merket anti-CD3 (1: 400 fortynning), allophycocyAnin (APC) / cyanin 7 (Cy7) -merket anti-CD4 (1: 400), peridinin klorofyll-proteinkomplekset-merket anti-CD4 (1: 400), V450-merket anti-CD8 (1: 400), biotin- merket anti-CD45RA (1: 1000), fykoerytrin (PE) / Cy7-merket anti-CD62L (1: 1000), PE / cyanin 5 (Cy5) -merket anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Rød merket anti-streptavidin (1: 2000), og PE / Cy5-merket muse IgG1K isotypekontroll (1: 200).
    5. Etter 48 timers inkubasjonstiden, høste PBMC. Vask PBMC i PBS for å fjerne exosomes og flekke cellene ved inkubering i 1 time ved 4 ° C med individuelle fluorokromkonjugerte merket antistoff. Analyser farget PBMC ved strømningscytometri for å kvantifisere ekspresjon av kjemokiner (som beskrevet 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Exosomes er effektivt renset fra HIV-1-positive human plasma. Isolerte exosomes, identifisert av acetylkolinesterase (AChE), adskilt i fraksjoner 1-3 med lavere densitet ved toppen av iodixanol gradienter, mens viruspartikler, identifisert av HIV-1 p24-antigen , segregert i høyere tetthet fraksjoner (10-12, nær bunnen). Tilstedeværelsen av exosomes ble ytterligere bekreftet ved immunblot identifisering av exosome markører AChE, CD9, CD45, CD63 og, og ved elektronmikroskopi (figur 2).

Pro-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner er forbundet med og signifikant forhøyet i exosomes av HIV-1 seropositive individer. Purified exosomes og ufraksjonert plasma fra HIV-1-infiserte og HIV-1-seronegative individer ble analysert for 21 cytokiner / kjemokiner ved multipleks assay. Alle 21 cytokiner / chemokines ble oppdaget i exosomes isolert fra HIV-1-positive individer. Dessuten ble deres nivåer signifikant forhøyet sammenlignet med plasma og exosomes fra HIV-1-seronegative kontroller (tabell 1).

CD38-ekspresjon ble øket på overflaten av celler eksponert for exosomes fra HIV-1 seropositive individer. PBMC fra friske humane givere ble eksponert i 48 timer for å sammenslåtte exosomes fra HIV-1 seropositive eller seronegative individer, og vurdert for nivåer av aktivering markør CD38 på CD4 + og CD8 + T-celler via flowcytometri. Vi har observert at ved 48 timer etter eksponering, CD38-ekspresjon på overflaten av naive og sentral hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler ble signifikant forhøyet i T-celler eksponert for exosomes fra HIV-1-positive individer, sammenlignet med HIV-negative exosome behandling og ubehandlet kontroller (figur 3).


Figur 1. Skjematisk fremstilling av exosome isolert fra HIV-1-positive human plasma. (A) 10 ml perifert blod ble oppsamlet fra HIV-1 seropositve og seronegative individer. (B) EDTA blodprøverør ble sentrifugert ved 1000 xg i 20 min ved RT. (C) Separert plasma ble overført til 50 ml koniske rør og fortynnet ½ med 1 x PBS og (D) ble sentrifugert 10000 x g i 30 min. (E) Supernatanten ble overført til ultrasentrifuge-rør, og (F) ble sentrifugert ved 10 000 xg i 2 timer. (G, H) Supernatanten ble kastet og pelleten exosome re-suspendert og vasket i 1 ml av 1 x PBS. (I) Etter sentrifugering ble supernatanten kastet og pelleten resuspendert i 1 ml 1 x PBS og lagt over 6-18% iodixanol hastighetsgradienten og (J) ble sentrifugert ved 250 000 xg i 2 timer. (K) Etter sentrifugering ble 1 ml fraksjoner fra topp til bunnen av gradienten var transferred til 1,5 ml rør og analysert for innhold AChE og immunoblotanalyse. (L) Fraksjonene 2 og 3 ble så slått sammen og fortynnes med 4 ml av 1 x PBS og (M) sentrifugert ved 400 000 xg i 2 timer. (N) Etter sentrifugering, supernatanten ble fjernet og pelleten resuspendert i 1 ml 1X PBS for analyse av pro-inflammatoriske cytokin og chemokin uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Exosomes blir effektivt renset fra humant plasma. Individuelle iodixanol hastighetsgradient fraksjoner fra HIV-seropositive individer eller seronegative ble utsatt for (A) enzymatisk assay for acetylcholinesterase (AChE), og (B) Western blot-analyse for exosomal markører CD9, CD45, og CD63 og viralt protein p24 og var (C) immunolabeled med anti-CD63 og undersøkt med elektronmikroskopi for å bekrefte fremstilling av rensede exosomes (C). (Figur fra Konadu et al 2014 21, brukt med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse for Immunmoduler Potential. PBMC fra HIV-1 seronegative personer ble utsatt for enten sammenslåtte exosomes fra plasma HIV-1 seropositive (HIV + Exo) eller seronegative (HIV Exo) individer, ubehandlet eller behandlet med 5 mikrogram / ml Concanavalin A (Con A) som en positiv kontroll. Etter 48 timers eksponering, naiv (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM; CD45RA- / CD62L +) og Effector (TEM; CD45RA- / CD62L-) Minne CD4 + og CD8 + T-celler ble analysert for CD38-ekspresjon ved strømningscytometri. Exosome Konsentrasjonen ble normalisert av totalt protein og tilsatt ved 1 ug / ml. Feilstolpene representerer gjennomsnitt +/- SEM av seks uavhengige donorer. Forskjellen mellom gruppene ble testet for statistisk signifikans ved One Way ANOVA-test. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figur fra Konadu et al 2014 21, brukt med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Analyse av renset exosomes og hele plasma fra HIV-1 seropositive og seronegative personer for pro-inflammatoriske cytokin og chemokin uttrykk. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figur fra Konadu et al 2014 21, brukt med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kronisk aktivering av immunsystemet (CIA) og CD4 + T-celle-uttømming er to viktige kjennetegnene ved HIV-1-infeksjon. De har blitt etablert som predikator for patogenesen, med CIA å være den beste prediktor. Men de underliggende mekanismene som driver kronisk systemisk aktivering av immunsystemet og CD4 + T-celle nedgangen har fortsatt ikke fullstendig klarlagt. Vi og andre laboratorier har utviklet firmaet bevis for at exosomes utskilt fra HIV-1-infiserte celler spiller en rolle i begge kjennetegn.

Den vedvarende interesse for både sammensetning og funksjon av ekstracellulære vesikler har ført til utgivelsen av ulike metoder for exosome isolasjon fra begge celledyrkningsmedier og biologiske væsker 24-26. Imidlertid har en barriere for å undersøke rollen til exosomes i HIV-1 patogenesen vært effektiv separasjon av exosomes fra HIV-1 partikler samtidig som evnen til å undersøke både exosome innhold og funksjonell aktivitet. Vi har utviklet en protocol for rensing av exosomes fra HIV-1 partikler i humant plasma, utnytte iodixanol hastighetsgradienter. De HIV-positive donorer brukt i denne studien hadde ikke fått antiretroviral behandling og plasmaprøvene som benyttes for disse forsøk inneholdt fra 1500 til 400.000 viruspartikler / ml med et gjennomsnitt på 206.000 viruspartikler / ml 21. Således, viser vi at exosomes i plasma hos HIV-1-infiserte individer kan effektivt separeres fra HIV-1 viruspartikler, selv når virus belastningene er høye. Selv om like i størrelse og tetthet, exosomes segregert i lav tetthet / øvre fraksjoner av iodixanol gradienter i forhold til viruspartikler, som adskilt i høy tetthet / lavere fraksjoner. De exosomes utarbeidet av iodixanol gradient metoden er svært renset og fri for forurensende ekstracellulære proteiner. Renheten av det isolerte exosomes populasjonen ble bekreftet ved hjelp av p24-ELISA og Western blot-analyse for HIV-1 p24 kapsidproteinsamt Western analyse for exosomal markører, hodepine, CD9, CD45 og CD63. Bruk av disse markørene er i samsvar med nylig publiserte retningslinjer for exosome identifikasjon 27.

Mer fysiologisk relevant for aktivering av immunsystemet, ble de rensede exosomes fra HIV-1 infiserte individer funnet å inneholde cytokiner / chemokiner ved betydelig høyere konsentrasjoner enn exosomes fra HIV-1 seronegative kontroller. Videre exosomes fra HIV-1-infiserte individer var biologisk aktiv og som viser evnen til å indusere økte nivåer av aktivering markør, CD38, på overflaten av naive og sentral hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler. Sammen er disse data tyder på en mekanisme som kunne drive vedvarende immunaktivering under HIV-infeksjon.

Resultatene vi var i stand til å få hjelp av vår exosome renselsesprosess, som kombinerer differensial sentrifugering og iodixanol hastighetsgradient separasjon viser verdienav å bruke høy-rene exosomes for fysiologiske og funksjonelle bioanalyser. Fremgangsmåten har visse fallgruver og begrensninger. En betydelig mengde av de exosomes, ofte et flertall av utgangsmaterialet som beregnes ved måling av AChE-aktivitet blir tapt i løpet av prosessen. I tillegg er fremgangsmåten også tidkrevende og krever tilgang til dyrt utstyr. Til slutt, genereringen av iodixanol gradienter ved bruk av gradienten fromer anordningen krever betydelig praksis for å sikre reproduserbarhet. En alternativ fremgangsmåte for generering gradient kan være å fremstille en gradert serie av iodixanol løsninger, etterfulgt av forsiktig lagdeling av løsningene i sentrifugerørene og inkubering O / N for å tillate gradientene til å danne. Vi har imidlertid ikke testet dette alternativ.

Den eksperimentelle protokollen beskrevet her for isolering og separering av exosomes fra HIV-1 partikler i humant plasma er en effektiv metode for å sikre renheten av exosomes. Bruk av denne metoden har ført til spennende muligheter for fremtiden henvendelse angående rollen exosomes i HIV-1 patogenesen og kunne like brukes i henvendelser for andre biologiske prosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
  2. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
  3. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
  4. Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
  5. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
  6. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
  7. Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
  8. Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
  9. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
  10. Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
  11. O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
  12. Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
  13. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  14. Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
  15. Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
  16. Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
  17. Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
  18. Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
  19. James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
  20. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
  21. Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
  22. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
  23. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  24. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  25. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
  26. Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).

Tags

Immunologi Exosomes HIV-1 Plasma Iodixanol hastighetsgradienter Cytokiner
Isolering av Exosomes fra Plasma av HIV-1 Positive Personer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth,… More

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter