Abstract
Exosomes är små blåsor varierar i storlek från 30 nm till 100 nm som släpps både konstitutivt och vid stimulering från en mängd olika celltyper. De finns i ett antal biologiska vätskor och är kända för att bära en mängd olika proteiner, lipider och nukleinsyramolekyler. Ursprungligen tänkt att vara lite mer än behållare för cellrester, är roller exosomes reglerar biologiska processer och vid sjukdomar alltmer uppskattat.
Flera metoder har beskrivits för att isolera exosomer från cellulära odlingsmedia och biologiska vätskor. På grund av sin ringa storlek och låg densitet, differentiell ultracentrifugering och / eller ultrafiltrering är de vanligaste teknikerna för Exosome isolering. Men plasma från HIV-1-infekterade individer innehåller både exosomes och HIV viruspartiklar, som är lika i storlek och täthet. Således har effektiv separation av exosomes från HIV-viruspartiklar i human plasma variten utmaning.
För att ta itu med denna begränsning, har vi utvecklat ett förfarande modifierat från Cantin et. al., 2008 för rening av exosomes från HIV-partiklar i human plasma. Jodixanol hastighetsgradienter användes för att separera exosomer från HIV-1-partiklar i plasma hos HIV-1-positiva individer. Viruspartiklar identifierades genom p24 ELISA. Exosomes identifierades på basis av Exosome markörer acetylkolinesteras (AChE), och CD9, CD63 och CD45 antigener. Vår lutning förfarande gav Exosome beredningar fria från viruspartiklar. Den effektiva reningen av exosomes från human plasma möjligt för oss att undersöka innehållet i plasmabaserade exosomes och att undersöka deras immunmodulerande potential och andra biologiska funktioner.
Introduction
HIV-1-epidemin fortsätter att ha en betydande effekt i hela världen. Som av 2013, var cirka 35 miljoner människor i världen lever med hiv, och 2,1 miljoner av dessa var nyligen infekterade individer 1. Förebyggande strategier och ökad tillgång till antiretroviral behandling har varit till hjälp för att minska den totala förvärvet av HIV. Men enskilda populationer fortfarande upplever stiger i förvärvet av HIV 1. Det finns således ett behov av fortsatta insatser för att ta itu med denna epidemi.
En av de starkaste prediktorer av HIV sjukdomsförloppet är kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Definieras av fortsatt höga nivåer av detekterbara cytokiner och förhöjda uttrycks markörer på ytan av T-lymfocyter, har CIA skrivits: i) kontinuerlig dendritiska celler produktion av typ I IFN 11; (ii) direkta immunaktivering drivs av HIV-proteiner Tat, Nef och gp120 12; (iii) Translokation av bakteriella proteiner i tarm tillhörande immunceller 6. Den exakta mekanismen (er) underliggande kronisk, systemisk immunaktivering vid HIV-infektion ännu inte helt klarlagd.
Vår forskargrupp och andra har visat en roll exosomes i HIV patogenes 15-18. Vår grupp har fastställt att Nef-proteinet utsöndras från infekterade celler i exosomes 15, och exosomal Nef (exNef) förekommer i plasma hos HIV-infekterade individer på nanogram nivåer 18. Vi har visat att åskådare CD4 + T-celler exponerade för exNef gav aktiveringsinducerat celldöd beroende av CXCR4-vägen 19, 20. Alternativt monocyt / makrofager var refraktära till exNef apoptos, men uppvisade förändrade cellulära funktioner och cytokinexpression. Senast har vår grupp visade exosomes isolerade från plasma från HIV-infekterade individer innehåller en mängd olika pro-inflammatoriska cytokiner. Further, naiva perifera mononukleära blodceller som utsätts för plasmahärledda exosomes från HIV-infekterade patienter inducerade uttryck av CD38 på naiva och centrala minne CD4 + och CD8 + T-celler. Detta bidrar sannolikt till systemisk inflammation och virusförökning via åskådare cellsaktivering 21, och föreslår att exosomes spelar en viktig roll i HIV patogenes.
Vid undersökning roll exosomes i HIV patogenes, är en utmaning att utveckla tekniker för att på ett effektivt sätt separata exosomes från HIV-partiklar medan exosomal innehållet upprätthålla liksom deras funktionella immunmodulerande förmåga. Flera metoder har beskrivits för att isolera exosomer från cellkultur och biologiska vätskor 22,23. På grund av deras ringa storlek och låg densitet (exosomer flyter vid en densitet av 1,15 - 1,19 g / ml), differentiell ultracentrifugering och / eller ultrafiltrering är de mest allmänt använda teknikerna för Exosome isolering 23.Emellertid HIV-infekterade cellodlingssupernatanter och patienternas plasma innehåller både exosomer och HIV-1 virala partiklar. Exosomes och HIV-1-partiklar är mycket lika i både storlek och täthet. Alternativt, dra nytta av uttrycket av unika exosomal markörer såsom CD63, CD45 och CD81, exosomes har isolerats med hjälp av immunaffinitetsinfångningsmetoder 23. Detta förfarande kan separera virus från exosomes. Emellertid är nackdelen med denna teknik den täta fastsättningen av antikroppar mot de renade exosomes, som skulle kunna störa utvärderingen av den immunmodulatoriska potential exosomes i odling.
För att lösa dessa begränsningar, har vi utvecklat ett förfarande för rening av exosomes från HIV-partiklar i human plasma modifierade från Cantin och medarbetare 22 använder iodixanol hastighetsgradienter. Exosomes befanns segregera i låg densitet / övre fraktioner av jodixanol gradienter, medan viruspartiklar segregerade i hög-densitet / lägre fraktioner. Viruspartiklar identifierades genom p24 ELISA och exosomes identifierades med hjälp av Exosome markörer AChE, CD9, CD63 och CD45. De övre låg densitet uppsamlade fraktionerna innehöll exosomer som var negativa för förorening HIV-1 p24. Den effektiva rening och separering av exosomes från HIV-partiklar i human plasma möjliggör noggrann granskning av innehållet i exosomes härrör från human plasma samt undersökning av deras immunmodulerande potential och diagnostiska och prognostiska värde av exosomes i HIV-1 patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett allmänt diagram över Exosome isolering och reningsprocedur ges i figur 1. Helblod erhölls från friska frivilliga givare och från HIV-positiva individer inte får antiretroviral theraoy deltar Hope kliniken i Emory University och Infectious Disease Program för Grady Health System i Atlanta, Georgia. Studien godkändes av institutionella prövningsnämnder i Emory University och Morehouse School of Medicine. Alla personer som deltar i studien gav skriftligt och informerat samtycke.
1. Framställning av exosomes från blodplasma
- Människoblod insamling och bearbetning
- Samla 10 ml perifert blod genom venpunktion i uppsamlings EDTA blodprovsrör (innehållande 18 mg kalium EDTA), och vänd försiktigt fem gånger för att blanda.
- Centrifugera blodprovsrör vid 1000 xg under 20 min vid RT för att pelletera blodkroppar. Använd en steril pipettte att överföra plasmafraktionen (4-5 ml) till en 25 ml koniska rör. Späd plasman med 10 ml 1 x PBS. Kasta blodkroppar (röda blodkroppar och vita blodkroppar, även känd som PBMC) i ett lämpligt märkta behållare för biologiskt avfall.
OBS: När det gäller oinfekterade givarblodprover kan PBMC reserveras för vidare användning (se procedur IV.2 nedan). - Förvara plasmaprover vid 4 ° C under kort sikt (2-3 dagar) eller vid -80 ° C under en längre tid.
OBS: Ta alla frysta plasmaprover till 4 ° C före ytterligare bearbetning.
- Framställning av Exosome Fraktion från plasma
- Centrifug plasma vid 10.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C för att avlägsna cellrester. Använd en steril serologisk pipett för att överföra rensas plasma supernatanten till ett rent 25 ml ultracentrifugrör. Kasta pelleten i biohazard behållaren.
- Centrifugera den klare plasma vid 100 tusen xg under 2h vid 4 ° C för att avlägsna stora vesiklar. Avlägsna 100.000 xg vätskan försiktigt genom pipettering, och kasta i biologiskt avfall. Resuspendera 100 tusen xg pelleten i 1 ml 1X PBS i ett rent rör och inkubera vid RT i 30 min, snurra försiktigt för att lossa och separera partiklar.
- Tvätta den suspenderade 100 tusen xg Exosome / viruspelleten genom tillsats av 25 ml PBS. Invertera röret försiktigt fem gånger för att blanda och sedan centrifugera igen vid 100 tusen xg under 2 h vid 4 ° C. Kassera PBS tvättlösning i biologiskt avfallsbehållare.
- Resuspendera 100 tusen xg pelleten i 1 ml av en X PBS och inkubera vid RT i 30 min snurra försiktigt för att lossa och lös pelleten.
OBS: Om det inte är möjligt att gå direkt till iodixanol lutning steget lagra pelleten, som innehåller exosomes och viruspartiklar, vid 4 ° C under 1-2 dagar tills iodixanol lutning steget.
2. Rening av exosomer
- Generera 6% -18% velocity gradienter av iodixanol med dubbla kammare gradient tidigare apparat.
- Förbered 6% och 18% lösningar av iodixanol reagens som levereras som en 60% lösning i vatten, genom utspädning i PBS. Pipettera 5,5 ml av 18% lösning i den omrörda kammaren, och pipett 5,5 ml 6% lösning i reservoirkammaren. Sätt på omröraren, öppna kranen, och låta varje gradient för att strömma in i en 14 ml ultracentrifugrör.
OBS: Använd antingen omedelbart eller förvara beredda gradienter O / N vid 4 ° C före användning. - Skikt försiktigt 1 ml av Exosome / viruslösningen på toppen av varje 11 ml-gradient. Centrifugera gradienter vid 250 tusen xg under 2 h vid 4 ° C med användning av en SW40Ti svängande hink rötor.
- Märk tolv (12) 1,5 ml mikrocentrifugrör. Avlägsna 1,0 ml från toppen av gradienten och överför till röret # 1. Överför återstående 1 ml fraktioner till rören 2-12 i ordningsföljd.
OBS: Den översta fraktionen kommer sålunda att vara # 1, bottenfraktionen, # 12. Stmalm gradienten fraktionerna vid 4 ° C. De renade exosomes, som bör vara i fraktionerna 1-3 på toppen av gradienten, är stabila i 3-4 veckor vid förvaring vid 4 ° C.
- Förbered 6% och 18% lösningar av iodixanol reagens som levereras som en 60% lösning i vatten, genom utspädning i PBS. Pipettera 5,5 ml av 18% lösning i den omrörda kammaren, och pipett 5,5 ml 6% lösning i reservoirkammaren. Sätt på omröraren, öppna kranen, och låta varje gradient för att strömma in i en 14 ml ultracentrifugrör.
3. Exosome Karakterisering
- Acetylkolinesteras (AChE) Aktivitetsanalys
- Bered 100 mM substrat lager genom att blanda acetyltiokolin jodid 28,9 mg i 1 ml 1X PBS. Butikssubstrat lager vid -20 ° C upp till 1 månad.
- Förbered 10 mM färgindikator lager genom att blanda bensoesyra 39.6mg och natriumbikarbonat 15 mg i 10 ml 1 x PBS. Butiksfärgindikator lager vid 4 ° C i upp till två veckor.
- Förbered analysreagens genom att blanda 1X PBS, substrat, och färgindikator i ett förhållande av 100: 2: 5 (till exempel 10 ml 1X PBS + 200 pl substrat + 500 l färgindikator).
- Överför 50 ul från varje 1,5 ml gradient fraktion röret (märkt 1-12, från förfarande III.3) till brunnarna i en 96-brunn microtiter platta. Förbered duplikatbrunnar för varje gradient prov.
- Bered en uppsättning standarder genom att först göra en 2000 pU / ml AChE lager i PBS. Gör elva (11) 2-faldiga seriespädningar av denna lager och tillsätt 50 | il av varje spädning till en enda brunn i en mikrotiterplatta, så att standard # 1 = 2.000 pU / ml, # 2 = 1,000 pU / ml, # 3 = 500 pU / ml, etc. tills # 12 = 0,98 pU / ml. De tolv AChE standarder kommer således anges på en enda rad i en 96-brunnars analysplatta.
- Tillsätt 200 ul av analysreagensblandningen till varje brunn och inkubera 20 min (i mörker) vid RT för att medge utvecklingen av den färgade reaktionsprodukten. Mät AChE-aktivitet vid en våglängd av 450 nm med användning av en fluorescerande mikroplattläsare.
OBS: Andelen av utgångsmaterial som återstår efter Exosome rening bedöms av AchE analys av ofraktionerat plasma.
- Immunoblotanalys
- Separata proteiner i gradientfraktioner 1-12 (från procedure 2.1.3) genom SDS-PAGE på 4-20% Tris-HCl förgjutna geler vid 100 V x 1 tim. Överför proteiner i gelén till ett nitrocellulosamembran med användning av en elektroblotting överföringscell enligt tillverkarens instruktioner. Låt överföringar till blot för 12-16 timmar (O / N) vid 350V.
- Avlägsna membranet från blottingapparat och tvätta i Tris-buffrad saltlösning (TBS) under 5 min. Block med 5% fettfri mjölk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) under 1 tim med skakning vid RT.
- Inkubera membranet med primära antikroppar specifika för exosomes (CD9, CD45, CD63) eller HIV-1-kapsidprotein (p24) i 5% fettfri mjölk under skakning vid 4 ° C under 12-16 h (O / N). Utspädningar av primära antikroppar för immunoblottar varierar från 1: 2000 -1: 5000.
- Tvätta blotten i TTBS under 20 min, följt av inkubation med en 1: 2000 utspädning av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad till anti-IgG (sekundär antikropp), i 5% fettfri mjölk under 1 h vid RT. Tvätta blot 3 gånger med TTBS, 10 min per tvätt.
- Spara bilderna som TIFF-filer som kan visas i Adobe Photoshop. Utför densitometri analys av band med ImageJ programvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Cytokin-analys
- Före cytokin analysen, störa immunkomplex som vanligtvis förekommer i human plasma genom syra dissociation och lysera exosomes från detergentbehandling. Analys båda startplasmaprover och renade Exosome preparat.
- Till 100 ul av humant plasma till 100 | il 0,33 N HCl och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Tillsätt 100 pl 0,33 N NaOH för att neutralisera syrabehandlad plasma. Lägg Triton X-100 till både den neutraliserade plasma och renad Exosome prover, till en final koncentration av 1%, för att förorsaka lys av exosomer.
- För denna analys (en fluorescerande pärla baserad procedur), använder magnetiska pärlor förbelagda med antikroppar genom tillverkaren. Använd ett skräddarsytt panel av anti-humana cytokiner antikroppsbelagda pärlor; uppräknade i tabell 1. Vortexa antikroppsbelagda magnetiska kulor från cytokin analyskit för 30 sek och tillsätt 50 | il pärlor till varje brunn i en 96-brunnsplatta som skall användas i analysen.
- Bered en spädningsserie av standarder i plasma standardbuffert (båda ingår i cytokin analyssats) som beskrivs i bruksanvisningen för cytokin analyskitet för att skapa en 8-punkts standardkurva.
- Tillsätt 150 ul av 1X tvättbuffert (från kit) till varje brunn och tvätta pärlorna med användning av en magnetisk pärla bricka, såsom beskrivs i bruksanvisningen. Lägg 25 pl plasmaanalysbuffert (från kitet) till varje brunn. Tillsätt 25 pl av standarder och prover till alla brunnar som användes i analysen. Tillsätt 25 | il plasmaprovbuffert till negativa kontrollbrunnar. Försegla och skaka plattan vid 700 rpm under 60 min vid RT och inkubera O / N vid 4 ° C.
- Tillsätt 150 pl 1X tvättbuffert i varje brunn och tvätta plattan (som i steg 3.3.4, ovan). Tillsätt 25 | il av detektionsantikroppar i varje brunn, försegla och skaka plattan vid 700 rpm under 30 min vid RT. Upprepa tvättningssteget.
- Tillsätt 50 pl av streptavidin-lösning (SAPE, från satsen) i varje brunn, försegla och skaka plattan vid 700 rpm under 30 min vid RT. Upprepa platt tvättar som i 3.3.4.
- Lägg 120 pl av behandlingen buffert (från kit) till varje brunn och skaka på en laboratoriebordsskakanordning vid 700 rpm under 5 min vid RT för att tillåta den fluorescerande signalen att utvecklas. Läs plattan på plattläsaren enligt tillverkarens instruktioner.
- För att ta hänsyn till mängden av exosomes förlorade under isoleringsförfarandet, använd följande ekvation: [(ursprunglig läsning / plasmavolym) x 66,6 = justerat cytokin behandlingen].
- Före cytokin analysen, störa immunkomplex som vanligtvis förekommer i human plasma genom syra dissociation och lysera exosomes från detergentbehandling. Analys båda startplasmaprover och renade Exosome preparat.
4. Analys för immunomodulerande Potential
- Framställning av odlingsmedium med Exosome utarmade fetalt bovint serum
- Centrifugera 500 ml fetalt bovint serum (FBS) vid 100 tusen xg under 20 h vid 4 ° C för att pelletera förorenande exosomes och mikrovesiklar. Försiktigt bort och spara Exosome utarmade FBS supernatant. Kasta pelleten i biologiskt avfall.
- Kombinera 20% av Exosome utarmade FBS supernatanten med 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium. Filtrera mediet genom ett 0,45 | im membranfilter.
- Lägg streptomycin (100 U / ml), penicillin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-buffrad salinlösning (10 | iM), och IL-2 (20 U / ml) till den filtrerade mediet.
- Cell Culture och Exosome Exponering
- Exponera exosomer över givare perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhållna från friska klinik frivilliga. Suspendera PBMC iberedd odlingsmedium och räkna cellerna med hjälp av en cell / partikelräknare (enligt tillverkarens standardmetod).
OBS: PBMC erhålles under plasmapreparat som beskrivs ovan (steg 1,2). - Använda beredda medium från förfarandet 4.1.3, samodling 3,0 x 10 6 (PBMC) med 1 pg / ml av poolade exosomer från tre (3) HIV-1 seropositiva eller från tre (3) HIV-1-seronegativa individer i en total volym av 1 ml i brunnarna på en 12-brunnars odlingsplatta (med lock). Inkubera kulturer i 48 h vid 37 ° C.
- Förbered obehandlade PBMC kulturer och kulturer behandlade med Concanavalin A (Con A; 5 | ig / ml) för att fungera som negativa och positiva kontroller, respektive, såsom beskrivits ovan (4.2.2). Inkubera alla PBMC kulturer för 48 timmar vid 37 ° C.
- Omedelbart före skörd av cellerna, förbereda utspädningar av följande fluorokromkonjugerade monoklonala antikroppar: Alexa Fluor 700-märkt anti-CD3 (1: 400 utspädning), allophycocyAnIn (APC) / cyanin 7 (Cy7) -märkt anti-CD4 (1: 400), peridinin klorofyll proteinkomplex-märkt anti-CD4 (1: 400), V450-märkt anti-CD8 (1: 400), biotin- märkt anti-CD45RA (1: 1000), fykoerytrin (PE) / Cy7-märkt anti-CD62L (1: 1000), PE / cyanin 5 (Cy5) -märkt anti-CD38 (en: 200), PE-Texas Red- märkt anti-streptavidin (1: 2000), och PE / Cy5-märkt mus IgG1K isotypkontroll (1: 200).
- Efter 48 timmars inkubationstid, skörda PBMC. Tvätta PBMC i PBS för att avlägsna exosomes och ge fläckar cellerna genom inkubering under 1 timme vid 4 ° C med enskilda fluorokrom-märkta antikroppar. Analysera färgade PBMC med flödescytometri för att kvantifiera expressionen av kemokiner (såsom beskrivs 21).
- Exponera exosomer över givare perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhållna från friska klinik frivilliga. Suspendera PBMC iberedd odlingsmedium och räkna cellerna med hjälp av en cell / partikelräknare (enligt tillverkarens standardmetod).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exosomer effektivt renas från HIV-1 positivt humanplasma. Isolerade exosomer, identifierade genom acetylkolinesteras (AChE) -aktivitet, segregerade i lägre densitet fraktionerna 1-3 vid toppen av jodixanol gradienter, medan viruspartiklar, som identifieras med HIV-1-antigen p24 , segregerade i fraktionerna högre densitet (10-12, nära botten). Närvaron av exosomes bekräftades ytterligare genom immunoblot identifiering av Exosome markörer värk, CD9, CD45 och CD63, och genom elektronmikroskopi (Figur 2).
Pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner är förknippade med och betydligt förhöjda i exosomes av HIV-1-seropositiva individer. Renat exosomes och ofraktionerat plasma från HIV-1-infekterade och HIV-1 seronegativa individer analyserades med avseende 21 cytokiner / kemokiner från multiplex analys. Alla 21 cytokiner / cellgifterkines upptäcktes i exosomes isolerade från HIV-1-positiva individer. Dessutom var deras nivåer signifikant förhöjda jämfört med plasma och exosomer från HIV-1 seronegativa kontroller (tabell 1).
CD38 uttryck ökade på ytan av celler exponerade för exosomes från HIV-1-seropositiva individer. PBMC från oinfekterade humana donatorer exponerades under 48 h till poolade exosomer från HIV-1-seropositiva eller seronegativa individer och bedömdes med avseende på halter av aktiveringsmarkören CD38 på CD4 + och CD8 + T-celler via flödescytometri. Vi observerade att efter 48 h efter exponering, CD38-uttryck på ytan av naiva och centralminne CD4 + och CD8 + T-celler var signifikant förhöjda i T-celler exponerade för exosomes från HIV-1-positiva individer jämfört med HIV-negativa Exosome behandling och obehandlade kontroller (Figur 3).
Figur 1. Schematisk representation av Exosome isolering från HIV-1 positivt humanplasma. (A) 10 ml av perifert blod uppsamlades från HIV-1 seropositve och seronegativa individer. (B) EDTA-bloduppsamlingsrören centrifugerades vid 1000 xg under 20 min vid RT. (C) Separerad plasma överfördes till 50 ml koniska rör och späddes ½ med 1 x PBS och (D) centrifuger 10 tusen xg under 30 minuter. (E) Supernatanten överfördes till ultracentrifugrör och (F) centrifugerades vid 10000 xg under 2 h. (G, H) Supernatanten kastades och Exosome pelleten återsuspenderades och tvättades i 1 ml 1 x PBS. (I), Efter centrifugering, supernatanten kastades bort och pelleten återsuspenderades i 1 ml 1 x PBS och överlagras på 6-18% jodixanol hastighetsgradient och (J) centrifugerades vid 250 tusen xg under 2 h. (K) Efter centrifugering, 1 ml fraktioner från topp till botten av gradienten var transferred till 1,5 ml rör och analyseras med avseende AChE innehåll och immunoblotanalys. (L) Fraktionerna 2 och 3 var än kombinerades och utspäddes med 4 ml av 1 x PBS och (M) centrifugerades vid 400 tusen xg under 2 h. (N) Efter centrifugering, supernatanten kastades och pelleten re-suspenderades i 1 ml 1X PBS för analys av pro-inflammatoriska cytokiner och kemokin uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. exosomes effektivt renas från human plasma. Individuell iodixanol hastighetsgradient fraktioner från HIV-seropositiva eller seronegativa personer utsattes för (A) enzymatisk analys för acetylkolinesteras (AChE), och (B) Western blot-analys för exosomal markörer CD9, CD45, och CD63 och virusprotein p24 och var (C) immunolabeled med anti-CD63 och undersöktes med elektronmikroskopi för att bekräfta framställning av renade exosomer (C). (Bild från Konadu et al, 2014 21, som används av tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys för immunomodulerande potential. PBMCs från HIV-1 seronegativa individer exponerades för antingen poolade exosomes från plasma från HIV-1 seropositiva (HIV + Exo) eller seronegativ (HIV Exo) individer, vänster obehandlat eller behandlas med 5 mikrogram / ml Concanavalin A (Con A) som en positiv kontroll. Efter 48 timmar exponering, naiv (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM, CD45RA- / CD62L +) och Effector (TEM, CD45RA- / CD62L-) Minne CD4 + och CD8 + T-celler analyserades för CD38-expression genom flödescytometri. Exosome koncentration normaliserades genom totalt protein och tillsattes vid en | ig / ml. Felstaplar representerar medelvärdet +/- SEM för sex oberoende givare. Skillnad mellan grupperna testades för statistisk signifikans genom envägs-ANOVA-test. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Bild från Konadu et al, 2014 21, som används av tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Analys av renade exosomes och hela plasma från HIV-1 seropositiva och seronegativa personer för pro-inflammatoriska cytokiner och kemokin uttryck. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Bild från Konadu et al, 2014 21, som används av tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk immunaktivering (CIA) och CD4 + T-cellstömning är två viktiga kännetecken av HIV-1-infektion. De har etablerat sig som prediktorer för patogenes, med CIA är den bästa prediktorn. Men de bakomliggande mekanismerna som driver kronisk systemisk immunaktivering och CD4 + T-celler nedgång fortfarande inte helt klarlagd. Vi och andra laboratorier har utvecklat starka bevis att exosomes utsöndras från HIV-1-infekterade celler spelar en roll i båda kännetecken.
Den fortsatta intresset för både sammansättning och funktion av extracellulära vesiklar har lett till publiceringen av olika metoder för Exosome isolering från båda cellodlingsmedia och biologiska vätskor 24-26. Emellertid har ett hinder för att undersöka betydelsen av exosomes i HIV-1 patogenes varit effektiv separation av exosomes från HIV-1-partiklar med bibehållen förmåga att utreda både Exosome innehåll och funktionell aktivitet. Vi har utvecklat en protocol för rening av exosomes från HIV-1-partiklar i humanplasma, som utnyttjar iodixanol hastighetsgradienter. HIV-positiva donatorer användes i denna studie hade inte fått antiretroviral behandling och plasmaprover som används för dessa experiment finns från 1500 till 400.000 viruspartiklar / ml med ett genomsnitt på 206.000 viruspartiklar / ml 21. Sålunda visar vi att exosomes i plasma av HIV-1-infekterade individer effektivt kan separeras från HIV-1-viruspartiklar, även när virusbelastningar är höga. Även liknande i storlek och täthet, exosomes segregerade i låg densitet / övre fraktioner av iodixanol gradienter jämfört med viruspartiklar, som avskiljs vid hög densitet / lägre fraktioner. De exosomes utarbetats av iodixanol gradientmetoden är höggradigt renade och fria från kontaminerande extracellulära proteiner. Renheten av det isolerade exosomer populationen bekräftades med användning av p24-ELISA och Western blot-analys för HIV-1 p24-kapsidproteinliksom Western-analys för exosomal markörer, AChE, CD9, CD45 och CD63. Användning av dessa markörer är förenligt med nyligen publicerade riktlinjer för Exosome identifiering 27.
Mer fysiologiskt relevanta för immunaktivering, var de renade exosomes från HIV-1 infekterade individer visade sig innehålla cytokiner / kemokiner vid betydligt högre koncentrationer än exosomes från HIV-1 seronegativa kontroller. Dessutom exosomer från HIV-1-infekterade individer var biologiskt aktiv, som uppvisar förmågan att inducera förhöjda nivåer av aktiveringsmarkör, CD38, på ytan av naiva och centralminne CD4 + och CD8 + T-celler. Tillsammans står dessa uppgifter tyder på en mekanism som kunde köra ihållande immunaktivering under HIV-infektion.
De resultat vi kunde få hjälp av vår Exosome reningsprocessen, som kombinerar differentiell centrifugering och iodixanol hastighetsgradient separation visar värdetatt använda högrenade exosomes för fysiologiska och funktionella bioanalyser. Förfarandet har vissa fallgropar och begränsningar. En avsevärd mängd av exosomer, ofta en majoritet av utgångsmaterialet som beräknas genom mätningar av AChE-aktivitet, förloras under processen. Dessutom är det förfarande också tidskrävande och kräver tillgång till dyrbar utrustning. Slutligen, generering av iodixanol övertoningar med hjälp av övertonings fromer apparaten kräver betydande praxis för att säkerställa reproducerbarhet. En alternativ metod för lutning generering kan vara att framställa en graderad serie jodixanol lösningar, följt av noggrann skiktning av lösningarna i centrifugrör och inkubering O / N för att låta gradienterna för att bilda. Emellertid har vi inte testat detta alternativ.
Det experimentella protokoll som beskrivs här för isolering och separation av exosomer från HIV-1-partiklar i human plasma är en effektiv metod för att säkerställa renheten av exosomes. Användning av denna metod har lett till spännande vägar för framtida utredning om vilken roll exosomes i HIV-1 patogenes och kunde lika gärna användas i undersökningar för andra biologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
